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Cancer Research

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Abstract

Nas últimas décadas, tumores xenoenxertos subcutâneos implantados no paciente ou linhas de células humanas cultivadas têm sido cada vez mais reconhecidos como modelos mais representativos para estudar cânceres humanos em camundongos imunodeficientes do que a célula humana estabelecida tradicional linhas in vitro. Recentemente, modelos de xenoenxerto tumoral derivados do paciente (PDX) ortotópicos implantados em camundongos foram desenvolvidos para melhor replicar características dos tumores de pacientes. Espera-se que um modelo de camundongo xenoenxerto ortotópico do fígado seja uma plataforma útil de pesquisa sobre o câncer, fornecendo insights sobre biologia tumoral e terapia medicamentosa. No entanto, a implantação do tumor ortotópico do fígado é geralmente complicada. Aqui descrevemos nossos protocolos para a implantação ortotópica de tumores uveal uveal metastáticos derivados do fígado. Nós cultamos linhas de células de melanoma uveal metastático do fígado humano em camundongos imunodeficientes. Os protocolos podem resultar em taxas de sucesso técnico consistentemente altas usando uma técnica de implantação ortotópica cirúrgica com pedaços de tumor de melanoma uveal derivado do paciente ou uma técnica de injeção de agulha com linha de células humanas cultivadas. Também descrevemos protocolos de tomografia computadorizada para detectar tumores hepáticos interiores e para técnicas de reimplantação usando tumores criopreservados para alcançar o reenxerto. Juntos, esses protocolos fornecem uma plataforma melhor para modelos de camundongos tumorais ortotópicos do fígado de melanoma uveal metastático do fígado em pesquisa translacional.

Introduction

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O melanoma uveal é o tumor maligno intraocular mais comum entre adultos no mundo ocidental. Nos últimos 50 anos, a incidência de melanoma uveal (5,1 casos por milhão) manteve-se estável nos Estados Unidos1,2. O melanoma uveal surge de melanócitos na íris, corpo ciliário ou choroide, e é uma doença extremamente letal quando desenvolve metástase. A taxa de mortalidade de pacientes com metástase de melanoma uveal foi de 80% aos 1 ano e 92% aos 2 anos após o diagnóstico inicial das metástases. O tempo entre o diagnóstico de metástases e morte é tipicamente curto, menos de 6 meses, sem levar em conta a terapia3,4. O câncer se espalha através do sangue e tende a metástase dominante mente para o fígado (89-93%)4,5. Um modelo eficaz do rato é urgente necessário para uma investigação mais adicional da melanoma uveal fígado-metastática. Para a pesquisa translacional, há uma clara demanda para gerar um modelo de camundongo uveal metastático localizado no fígado.

Espera-se que os modelos de camundongos tumorais derivados do paciente forneçam estratégias de medicamentos individualizados. Estes modelos podem ser preditivos de desfechos clínicos, ser úteis para avaliação de medicamentos pré-clínicos e ser usados para estudos biológicos de tumores6. Os modelos representativos de PDX são camundongos xenoenxerto supada tumoralmente ectópica, que têm tumor em locais subcutâneos. A maioria dos pesquisadores pode fazer cirurgia para implantação subcutânea sem prática especial7,8. Eles também podem monitorar tumores subcutâneos facilmente. Embora os modelos PDX subcutâneos se tornaram populares na fase de pesquisa, eles têm alguns obstáculos na mudança para uso prático. Implantação subcutânea força tumores derivados do paciente a enxetorgravura em um microambiente diferente da origem tumoral, de modo que leva à falha do enxerto e ao crescimento lento do tumor 9,10,11, 12,13,14. O enxerto ortotópico pode ser uma abordagem mais ideal e racional para um modelo PDX porque usa o mesmo órgão que o tumor original15,16.

Recentemente, desenvolvemos protocolos para técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica de tumores de melanoma uveal metastáticos do fígado derivados do paciente e técnicas de injeção de agulha com uma linha de células de melanoma uveal metastático do fígado humano cultivada no NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratos17,18. Os protocolos resultam em taxas de sucesso técnico consistentemente altas. Também estabelecemos técnicas de tomografia computadorizada que são úteis para detectar tumores hepáticos interiores, e desenvolvemos reimplantação de tumores criopreservados na plataforma PDX. Nós encontramos que os modelos uveal do xenograft do melanoma mantêm as características do tumor paciente original do fígado, incluindo suas características histopatológicas e moleculares. Juntas, essas técnicas fornecem uma plataforma melhor para modelos de tumorortópico hepático para melanoma uveal em pesquisatranscional.

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Protocol

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Os pacientes inscritos no estudo devem fornecer consentimento por escrito permitindo o uso de amostras cirúrgicas descartadas para fins de pesquisa e estudos genéticos, de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional. Este protocolo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Coleção de tecido tumoral fresco derivado do paciente

  1. Obtenha o tecido tumoral derivado do paciente a partir de uma cirurgia ou uma biópsia de agulha em uma sala de cirurgia do hospital.
  2. Coloque o tecido tumoral em um recipiente de 100 mL contendo a solução de sal equilibrado de Hanks (HBSS) no gelo.
  3. Transfira o tecido para um capô estéril (Nível 2 de Biossegurança) em laboratório.
  4. Vá para o segundo passo o mais rápido possível.
    Nota: Por razões de segurança, exclua pacientes com infecções conhecidas por HIV ou hepatite B ou C.

2. Processamento de tecido tumoral fresco derivado do paciente

  1. Coloque o tecido em um tubo de 50 mL contendo solha soline tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para lavar o tecido, adicione PBS no tubo e descarte PBS do tubo duas vezes.
  2. Transfira o tecido em uma placa de Petri contendo PBS no gelo.
  3. Usando fórceps estéreis e tesouras, retire as partes necróticas do tecido. Mantenha o tecido úmido e frio durante os passos 2,3 a 2,5. Para amostras de biópsia de agulha, pule o passo 2.3 e 2.5, e não corte as amostras.
    Nota: O tecido necrótico muitas vezes se rompe facilmente quando tocado.
  4. Corte o tecido em 1 mm3 cubos para implantação hepática cirúrgica.
  5. Corte o resto do tecido em cubos de 2 mm na placa de Petri.
  6. Transfira-os para um microtubo de 1,7 mm com formalina de 4% para análise histológica e para outro tubo para análise genômica e proteômica.
  7. Coloque os microtubos em um frasco de nitrogênio líquido com nitrogênio líquido. Transfira os tubos para um congelador de -80°C para armazenamento permanente.
    Nota: O tempo entre a remoção da amostra do paciente e o processamento do tecido não deve exceder 30 min.

3. Implantação hepática cirúrgica com tecido tumoral derivado do paciente

  1. Spray todos os objetos que entram na capa para a cirurgia com 70% de álcool etílno.
    Nota: Isso inclui instrumentos cirúrgicos, almofadas de aquecimento e máquinas de anestesia.
  2. Medir o peso de um cotonete e folha de tecido.
  3. Anestesiar um rato com um vaporizador de isoflurano de 3 a 5%, colocando-o na câmara de indução.
  4. Uma vez que o rato é anestesiado inteiramente, coloc o na posição supine em uma almofada de aquecimento. Coloque o cone isoflurane no cnout do rato para inalar 1,5-3% isoflurane para manutenção de anestesia.
    Nota: O rato precisa de estar na almofada de aquecimento durante o procedimento inteiro. A falta de aquecimento pode causar hipotermia.
  5. Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.
  6. Injete buprenorfina (0,6 mg/kg) subcutâneamente no flanco usando uma agulha 27 G em uma micro seringa antes da cirurgia.
  7. Aplique 70% de álcool etílico no abdômen e espalhe a pele para cima e para baixo. Depois de espalhar a pele, confirme uma visualização mais fácil da pele abaixo da área subcostal esquerda para um corte mais fácil. Não raspe a pele do abdômen.
    Nota: A pele esconderá o local da incisão após a cirurgia e impedirá que o rato risque a operação do borne da incisão. No entanto, você pode raspar a pele para evitar a infecção do site de incisão de acordo com os padrões institucionais.
  8. Aplique o iodo e deixe-o ser absorvido na pele.
  9. Coloque uma cortina cirúrgica estéril com um buraco de 2 cm no mouse.
  10. Levante a pele abdominal com fórceps ultrafinos curvos e faça uma incisão subcostal esquerda transversal de 1 cm com tesoura curva.
  11. Insira a ponta da tesoura curva a pele da incisão e abra-as ligeiramente para separar o peritônio da pele. Retire a tesoura da incisão com lâminas fechadas.
    Nota: Abrir e fechar tesouradentro do rato pode causar danos e sangramento.
  12. Localizar o fígado o peritônio. Confirme uma cor avermelhada escura através do peritônio.
  13. Com tesoura curva, faça uma incisão transversal de 1 cm no peritônio. Se uma artéria peritoneal sangra da vanguarda, parar imediatamente o sangramento com cautery.
  14. Pegue o tecido adiposo usando fórceps ultrafinos curvos com uma mão, insira a borda de um cotonete o lobo do fígado esquerdo e enrole o cotonete para baixo com a outra mão para trazer o fígado.
    Nota: Agarrar o tecido gordo é importante manter o tecido gordo da colagem ao cotonete.
  15. Exteriorize o fígado no cotonete e coloque o fígado em uma folha de tecido absorvente não tecido.
    Nota: A folha da tela joga dois papéis essenciais em estabilizar o fígado e em absorver a hemorragia.
  16. Faça uma incisão de 5 mm de largura e profundidade usando uma lâmina de bisturi estéril nº 11 para formar um bolso no parenchyma enquanto pressiona suavemente o local da incisão com o cotonete.
    1. Insira a lâmina em paralelo com a superfície do fígado e corte horizontalmente.
    2. Pressione o local da incisão com o cotonete para parar qualquer hemorragia.
      Nota: Não mantenha a lâmina vertical, caso contrário, você vai romper o fígado e ferir grandes vasos no meio do fígado.
  17. Enrole o cotonete para cima para abrir o local da incisão e implante um cubo de 1 mm3 de tecido tumoral no bolso com fórceps ultrafinos curvos. Retraia os fórceps enquanto rola o cotonete em rotação reversa e pressionando para baixo.
    Nota: Pressionar para baixo no local da incisão com o cotonete ao retrair os fórceps ajuda a impedir o deslocamento do tumor dentro do bolso.
  18. Tire delicadamente o cotonete do local da incisão após a implantação. Avance para a etapa 3.19 o mais rápido possível.
  19. Coloque um hemostat absorvível no local da incisão.
  20. Confirme a hemostasis. Se o sangramento continuar, adicione mais hemostat no local da incisão.
  21. Descasque o fígado fora da folha de tecido com fórceps (de preferência sem corte) e coloque o fígado de volta na cavidade abdominal.
  22. Suture peritoneum com dupla ligadura usando 5-0 sutura absorvível.
  23. Sutura de pele com ligadura tripla usando 5-0 sutura absorvível.
    Nota: A ligadura tripla ajuda a impedir a dehiscência da incisão cirúrgica.
  24. Observe o mouse até ficar completamente acordado e colocá-lo de volta na gaiola.
  25. Medir o peso do cotonete e da folha de tecido com sangue para o volume de sangramento durante a cirurgia. Compare-os com seus pesos originais antes da cirurgia. Reduzir o sangramento durante a cirurgia para menos de 10% do volume de sangue circulante no mouse.

4. Coleta e processamento de cultura do fígado humano metastático Uveal Melanoma Cell Line

  1. Prepare as células cultivadas.
  2. Coletar células e calcular o número de células usando um contador de células.
  3. Prepare uma quantidade apropriada de suspensão celular para 10,0 x 106 células em um tubo de 15 mL.
  4. Gire o tubo a 300 x g por 5 min em uma centrífuga à temperatura ambiente.
  5. Retire o supernatant no tubo de 15 mL. Deixe a pelota celular na parte inferior do tubo.
  6. Adicione 50 μL de RPMI 1640 médio em um tubo de 1,7 mL.
  7. Corte a ponta de uma ponta de 200 μL com tesoura para ampliar a abertura da ponta.
  8. Adicione 60 μL da matriz da membrana do porão usando uma pipeta com a ponta de corte no tubo de 1.7 mL que tem RPMI.
  9. Misture RPMI e matriz no tubo de 1,7 mL. Vórtice-lo.
  10. Adicione 110 μL da mistura na pelota celular no tubo de 15 mL. Transfira a suspensão celular para um novo tubo de 1,7 mL.
  11. Mantenha o tubo no gelo antes da injeção da agulha.

5. Implantação cirúrgica da agulha da linha de pilha metastática metastática cultivada da pilha de Uveal do fígado no fígado

  1. Siga o protocolo acima das etapas 3.1 a 3.15.
  2. Recolher a suspensão celular com uma microseringa com uma agulha 27 G.
  3. Insira a agulha ao longo da superfície do fígado e avançar a ponta da agulha 5 mm mais profundo.
  4. Injetar 20 μL de suspensão celular no fígado.
  5. Cauterizar o ponto de inserção do fígado para evitar que as células injetadas vazem. Confirme a hemostasis.
  6. Siga o protocolo acima das etapas 3.21 a 3.24.

6. Tomografia computadorizada

  1. Coloque o rato em um contidor no estado acordado.
  2. Limpe a cauda com uma almofada de álcool estéril para desinfecção e vasodilatação.
  3. Injete 100 μL de agente de contraste tc na veia da cauda com uma agulha de 27 G em uma seringa de 1 mL.
  4. Aguarde 4 h após a injeção antes de fazer a tomografia computadorizada.
    Nota: Leva 4 h até que o agente é levado por células de fígado Kupffer.
  5. Quatro horas após a injeção, anestesiao o rato tumor-rolamento com isoflurane vaporizado de 3-5% coloc o na câmara da indução.
  6. Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, coloque-o na posição propensa em um CT. Coloque o cone isoflurane no mirante do mouse para inalar isoflurane de 1,5-3% para manutenção de anestesia.
  7. Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.
  8. Faça uma tomografia por 15 min.
  9. Certifique-se de que o mouse até que seja totalmente despertado após a tomografia computadorizada e colocá-lo de volta na gaiola.
  10. Avalie a existência do tumor e meça o tamanho do tumor nas imagens de TC.
    Nota: O agente de contraste melhora o parenchyma normal do fígado de modo que seja fácil reconhecer o tumor não realçado. Não interprete mal a vesícula biliar e o estômago como tumor.

7. Tecido de colheita e processamento

  1. Eutanásia ratos usando CO2 seguido de deslocamento cervical, colocando o dedo indicador e polegar atrás do crânio e puxando o corpo pela base da cauda. Avance para o passo 7.2 o mais rápido possível.
  2. Coloque o mouse em uma posição supina e pulverizar o abdômen com 70% de álcool etílno.
  3. Use fórceps estéreis e tesouras estéreis para fazer uma incisão transversal de 3 cm abaixo do processo xifórido para expor os órgãos abdominais.
  4. Extirpar o tecido tumoral e realizar etapas 2.1 a 2.2.
  5. Corte o resto do tumor em cubos de 2 mm na placa de Petri.
  6. Transfira-os para um tubo criogênico com criomémetro para reimplantação após criopreservação.
  7. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento criogênico cheio de isopropanol.
  8. Transfira o recipiente para um congelador de -80°C para armazenamento temporário. Não coloque os criotubos com criomémetro diretamente em um tanque de nitrogênio líquido. Congelá-los lentamente a uma taxa de resfriamento de -1 °C/min para preservar o tecido tumoral.
  9. No dia seguinte, transfira os tubos para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento permanente.

8. Reimplante

  1. Mantenha os tubos congelados em um frasco líquido de nitrogênio com nitrogênio líquido até que esteja pronto para implantar tecido. Minimize a exposição do tecido à temperatura ambiente para manter a viabilidade e aumentar as chances de enxerto.
  2. Descongele tubo criopreservado em um banho de água de 37 °C.
  3. Executar etapas 2.2-2.4.
  4. Implante o tumor descongelado em camundongos, conforme descrito nos passos 3.1-3.24.

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Representative Results

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A implantação ortotópica cirúrgica usando o método do bolso do fígado pode transplantar o tumor uveal metastático da melanoma do fígado humano no fígado do rato com uma taxa de sucesso elevada de 80% dentro de seis meses. O tumor xenoenxerto enenxertos no fígado como um tumor solitário sem nódulos filha (Figura 1 e Figura 3A). A técnica cirúrgica de injeção ortotópica no fígado usando microagulhas enenxertou com sucesso células de melanoma uveal uveal humanas cultivadas cultivadas no fígado em todos os casos (Figura 2 e Figura 3B). Entretanto, alguns casos tiveram a disseminação em torno do tumor principal. O agente de contraste detecta tumores no fígado na TC, incluindo pequenos tumores de tamanho de 1 mm(Figura 3B). A reimplantação de tumores criopreservados estabeleceu-os com sucesso no fígado do rato com altas taxas de sucesso. Os tumores de xenoenxerto reimplantados após a criopreservação retêm as características dos tumores originais do paciente e dos tumores pré-criopreservados.

Figure 1
Figura 1: Modelo de camundongo xenoenxerto tumoral derivado do paciente por implante ortotópico cirúrgico do fígado. O rato foi eutanasiado após 6 meses após a implantação do tumor. O tumor preto pigmentado (seta preta) é melanoma uveal. O tumor é enxertado no lobo esquerdo do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Modelo de camundongo xenoenxerto derivado da linha de células humanas ortotópica do fígado usando o método de injeção de agulha. O rato foi eutanasiado 8 semanas após a injeção do tumor. O tumor preto pigmentado (seta preta) é melanoma uveal. O tumor é enxertado no lobo esquerdo do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Imagens de TC de tumores hepáticos no lobo esquerdo do fígado. Os tumores do fígado são detectados no CT realçado. O tecido normal do fígado é realçado pelo agente do contraste. Flechas brancas indicam o estômago ao lado do fígado. (A)O tumor (seta preta) que foi mostrado previamente na figura 1. A implantação ortotópica cirúrgica forma um tumor solitário. (B) Os tumores (seta preta) mostrado anteriormente na Figura 2. O método de injeção de agulhas forma um conjunto de muitos tumores pequenos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Dicas técnicas para o método de bolso do fígado. (A-C) O lóbulo esquerdo (setas brancas) do fígado pode ser exposto para fora do abdômen usando um cotonete (seta preta) através de uma incisão de 1 cm. Um retrator não é obrigado a alargar a incisão. (D)Cotonete pressiona a incisão suavemente. Ele obtém hemostasis depois de fazer uma incisão pelo bisturi (seta verde). (E)Cotonete rola para cima (seta vermelha curva). Isso levanta o fígado parenchyma para abrir a incisão. A seta amarela do tumor) é introduzida no bolso do fígado através da incisão por fórceps ultrafinos (seta azul). (F) Cotonete rola para baixo (seta vermelha curvada) para evitar que um tumor inserido no bolso de recuar. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

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Os modelos ortotópicos atuais do xenograft são labor-intensive, demorados, e caros criar. Modelos de camundongos xenoenxerto de tumor ortotópico para câncer de fígado foram estabelecidos há mais de duas décadas há19,20,21. No entanto, esta técnica é complicada e requer o uso de equipamentos especiais, como um suporte de microagulha e 6-0 a 8-0 suturas finas um microscópio. Tumor e tecido hepático normal devem ser costurados cuidadosamente para que a sutura não danifique o frágil tecido do fígado. As técnicas convencionais levam a complicações, como hematoma e necrose22. Recentemente, uma técnica modificada foi desenvolvida para resolver estes problemas23. Esta técnica modificada usa materiais hemostatic absorvíveis em vez da sutura para cobrir o tumor na superfície do fígado. No entanto, este método modificado não cobre completamente o tumor dentro do parenchyma do fígado. Uma parte do tumor é exposta ao exterior. Desenvolvemos uma técnica de implantação ortotópica cirúrgica- o método de bolso do fígado para abrigar o tumor inteiramente dentro da parenchyma18. Nosso método faz um bolso no fígado para fornecer um ambiente natural para tumores. O método do bolso do fígado é mais simples do que a técnica convencional, permitindo-nos terminar a implantação no fígado dentro de alguns minutos do início da operação. Este método resulta na formação de um tumor solitário no fígado e não desencadeia metástases, pelo menos enquanto observamos os camundongos, enquanto a injeção de agulha de uma única suspensão celular tende a se disseminar como metástases intra-hepáticas17. Um tumor solitário é mais apropriado avaliar o crescimento do tumor e seria útil avaliar a eficácia em uma experimentação da droga.

Em comparação com o método original de bolso do fígado18,nós modificamos nossos métodos para melhorar as técnicas de implantação. Primeiramente, um retractor não foi usado durante a cirurgia para minimizar o tamanho da incisão. Quando a incisão é menor, podemos encurtar o tempo de costura na cirurgia. Com uma incisão de 1 cm no abdômen, podemos facilmente trazer o lóbulo esquerdo para fora com um cotonete (Figura 4A-C). Em segundo lugar, um cotonete desempenha três papéis importantes, parando a hemostasis depois de fazer o bolso do fígado, abrindo o bolso do fígado para ser capaz de inserir um pedaço de tumor e mantendo o pedaço do tumor no bolso sem empurrar o tumor para trás (Figura 4D- F). O volume médio de sangramento foi aproximadamente inferior a 10% do volume sanguíneo circulante em camundongos. Menos sangramento forneceu grande confiança na cirurgia. Em terceiro lugar, uma folha de tecido é útil para consertar o lobo do fígado fora do abdômen. O lóbulo do fígado adere à folha e, portanto, impede que o lobo deslize de volta para o abdômen (Figura 4C). Pode-se facilmente cortar a superfície do fígado com um bisturi e injetar uma agulha na superfície do fígado. Como resultado, o tecido hepático frágil não é ferido.

Apresentamos duas dicas de solução de problemas para este método. Primeiro, quando um pequeno site de incisão é usado, às vezes um lóbulo esquerdo não é visível. Nesta situação, o lóbulo esquerdo é provável furar ao diafragma. Insira fórceps embotadas entre o lóbulo esquerdo e o diafragma para descascar o lóbulo. Em segundo, quando um pedaço do tumor é coloc no bolso do fígado com fórceps, o tumor pode furar aos fórceps e puxar para trás com ele. Pressione a incisão com um cotonete de algodão enquanto recua os fórceps. Isso funciona bem para evitar a luxação do tumor para fora do bolso.

Os tumores de xenoenxerto são cercados por tecido de camundongo, mesmo que sejam implantados ortotópicamente. As pilhas estromais humanas em tumores paciente-derivados são substituídas inevitàvel por pilhas estromais do rato. Idealmente, o modelo do rato forneceu melhor o tecido stromal humano em torno dos tumores. Chimeric humanizado rato do fígado ou humanizado modelos de camundongos imunes seria útil para estudar o enxerto de melanoma uveal e avaliar se o metabolismo da droga é o mesmo que um ambiente humano-fígado ou humano-imune24,25.

Modelos ortotópicos do rato do xenograft do tumor de fígado exigem a verificação do estabelecimento do tumor com estudos da imagem latente. O agente de contraste ct comercialmente disponível, desenvolvido para imagens de TC de fígado de camundongo, permite a detecção de tumores hepáticos interiores no estado vivo na TC. O agente de contraste aumenta especificamente o fígado normal no CT. É fácil distinguir o local não aprimorado do tumor26. O agente detecta tumores minúsculos menos de 1 mm (nódulos de filha) em torno dos tumores principais no CT. O agente pode ser tolerado pelo rato, e torna possível monitorar tumores hepáticos periodicamente. O agente seria usado para avaliar a eficácia de drogas anticancerígenas contra tumores de xenoenxerto localizados no fígado.

Geralmente, recomenda-se manter modelos PDX em um número de passagem relativamente baixo (menos de 10) para conservar a integridade genética e histológica do tumor original derivado do paciente27,28,29. A maioria dos pesquisadores se abstém de fazer várias passagens dos modelos PDX para reduzir o número de passagens e animais. Uma vez que os tumores paciente-derivados são preservados temporariamente em um congelador, nós podemos controlar modelos de PDX em um número mais baixo da passagem sem desperdiçar ratos. Isso é chamado de estratégia de biobancário. Um biobanco de câncer é uma abordagem racional para manter as características tumorais e reduzir o número de camundongos28,30. Estabelecer um método de biobancário adequado pode ajustar o fornecimento de modelos PDX para atender ao plano de tratamento do paciente ou um ensaio de eficácia de medicamentos para camundongos no futuro. Conseguimos re-implantação de tumores criopreservados para biobancário de câncer. Esperamos que esse sucesso facilite o uso da plataforma PDX em um futuro próximo.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Somos gratos a M. Ohara, K. Saito e M. Terai, por revisaro manuscrito. Os autores reconhecem a revisão crítica para o auxílio editorial e inglês deste manuscrito pelo Dr. R. Sato no centro do cancer da perseguição da raposa. O trabalho aqui descrito foi apoiado pelo Bonnie Kroll Research Fund, o Mark Weinzierl Research Fund, o Eye Melanoma Research Fund da Thomas Jefferson University, the Osaka Community Foundation e JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 em Osaka City Universidade. Estudos no laboratório do Dr. A. Aplin foram apoiados pela concessão do NIH R01 GM067893. Este projeto também foi financiado pelo Prêmio de Ciência Transformadora do Reitor, um Prêmio de Iniciativa Programática da Universidade Thomas Jefferson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

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References

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Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes
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Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

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