Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

İmmünficient Farelerde Karaciğer Ortotopik İnsan Uveal Melanom Xenograft Platformu Üretimi

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

Ortotopik insan karaciğeri metastatik uveal melanom ksenogreft fare modelleri, hasta kaynaklı tümör öbek ve kültürlü insan uveal melanom hücre hatları ile iğne enjeksiyon teknikleri ile cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri kullanılarak oluşturulmuştur.

Abstract

Son yıllarda, subkutan implante hasta kaynaklı ksenogreft tümörleri veya kültürlü insan hücre hatları giderek geleneksel kurulan insan hücresi daha immüneksik farelerde insan kanserleri çalışma için daha temsili modeller olarak kabul edilmiştir satırlar in vitro. Son zamanlarda farelerde ortotoik implante edilen hasta kaynaklı tümör ksenogrefti (PDX) modelleri hasta tümörlerinin özelliklerini daha iyi çoğaltmak için geliştirilmiştir. Bir karaciğer ortotopik ksenogreft fare modeli yararlı bir kanser araştırma platformu olması bekleniyor, tümör biyolojisi ve ilaç tedavisi içine anlayışlar sağlayan. Ancak, karaciğer ortotopik tümör implantasyonu genellikle komplikedir. Burada hasta kaynaklı karaciğer-metastatik üveal melanom tümörlerinin ortotopik implantasyonu için protokollerimizi açıklıyoruz. İnsan karaciğerini metastatik üveal melanom hücre çizgilerini immünoeksik farelere dönüştürdük. Protokoller, hasta kaynaklı uveal melanom tümörü parçaları içeren cerrahi ortotopik implantasyon tekniği veya kültürlü insan hücre hattı ile iğne enjeksiyon tekniği kullanılarak sürekli olarak yüksek teknik başarı oranlarına neden olabilir. Ayrıca iç karaciğer tümörlerini saptamak için BT taraması protokollerini ve kriyosrezerv tümörleri kullanarak yeniden implantasyon tekniklerini yeniden engraftment elde etmek için açıklıyoruz. Birlikte, bu protokoller çeviri araştırmakaraciğer metastatik uveal melanom karaciğer ortotopik tümör fare modelleri için daha iyi bir platform sağlar.

Introduction

Uveal melanom batı dünyasında yetişkinler arasında en sık görülen göz içi malign tümördür. Son 50 yıl içinde, uveal melanom insidansı (milyonda 5.1 olgu) Amerika BirleşikDevletleri'ndeistikrarlı kalmıştır 1,2. Uveal melanom iris melanositler doğar, silikal vücut, veya koroid, ve metastaz gelişir zaman son derece ölümcül bir hastalıktır. Uveal melanom metastazı olan hastaların ölüm oranı metastazların ilk tanısından 2 yıl sonra 1 yılda %80, 2 yıl sonra %92 idi. Metastaz tanısı ve ölüm arasındaki süre genellikle kısa, az 6 ay, tedavi ye bakılmaksızın3,4. Kanser kan yoluyla yayılır ve baskın karaciğermetastaz eğilimindedir (89-93%)4,5. Etkili bir fare modeli acilen karaciğer-metastatik uveal melanom daha fazla araştırma için gereklidir. Çeviri araştırma için, karaciğer lokalize metastatik üveal melanom fare modeli oluşturmak için net bir talep vardır.

Hasta kaynaklı tümör ksenogrefti (PDX) fare modellerinin bireyselleştirilmiş tıp stratejileri sağlaması beklenmektedir. Bu modeller klinik sonuçların tahmincisi olabilir, klinik öncesi ilaç değerlendirmesi için yararlı olabilir ve tümörlerin biyolojik çalışmalar için kullanılabilir6. Temsili PDX modelleri ektonik tümör implante ksenogreft fareler, deri altı sitelerde tümör var. Çoğu araştırmacı özel uygulama olmadan deri altı implantasyon için cerrahi yapabilirsiniz7,8. Ayrıca deri altı tümörleri kolayca izleyebilirler. Deri altı PDX modelleri araştırma aşamasında popüler hale gelmiş olsa da, pratik kullanıma geçişte bazı engelleri vardır. Subkutan implantasyon hasta kaynaklı tümörleri tümör kökenli farklı bir mikroortamda engraft için zorlar, böylece engreftasyon yetmezliği ve yavaş tümör büyümesine yol açar 9,10,11, 12,13,14. Ortotopik engraftment orijinal tümör15,16aynı organı kullandığı için bir PDX modeli için daha ideal ve rasyonel bir yaklaşım olabilir.

Son zamanlarda, nod kültürlü bir insan karaciğer-metastatik uveal melanom hücre hattı ile hasta kaynaklı karaciğer-metastatik uveal melanom tümörlerinin cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri ve iğne enjeksiyon teknikleri için protokoller geliştirdik. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareler17,18. Protokoller sürekli olarak yüksek teknik başarı oranları ile sonuçlanır. Ayrıca iç karaciğer tümörlerini tespit etmek için yararlı olan BT tarama tekniklerini oluşturduk ve PDX platformunda kriyosayrılmış tümörlerin yeniden implantasyonu geliştirdik. Uveal melanom tümörü ksenogreft modellerinin histopatolojik ve moleküler özellikleri de dahil olmak üzere orijinal hasta karaciğer tümörü özelliklerini koruduğunu bulduk. Birlikte, bu teknikler çeviriaraştırmada uveal melanom için karaciğer ortotopik tümör modelleri için daha iyi bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çalışmaya kayıtlı hastalar, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı bir protokole göre, atılan cerrahi numunelerin araştırma amaçlı ve genetik çalışmalar için kullanılmasına izin veren yazılı izin vermelidir. Bu protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki tavsiyelere uygun olarak yürütülmüş ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Taze Hasta Kaynaklı Tümör Dokusunun Toplanması

  1. Ameliyattan veya bir hastane ameliyathanesinde iğne biyopsisinden hasta kaynaklı tümör dokusu elde edin.
  2. Tümör dokusunu Hanks'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) buz üzerine içeren 100 mL'lik bir kapta koyun.
  3. Bir laboratuvarda dokuyu steril bir kaputa (Biyogüvenlik seviyesi 2) aktarın.
  4. En kısa sürede adım 2'ye geçin.
    NOT: Güvenlik nedenlerinden dolayı, bilinen HIV veya Hepatit B veya C enfeksiyonları olan hastaları hariç tinler.

2. Taze Hasta Kaynaklı Tümör Dokusunun İşlenmesi

  1. Dokuyu 50 mL'lik fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir tüpe koyun. Dokuyu yıkamak için, tüpe PBS ekleyin ve pbs'yi tüpten iki kez atın.
  2. Dokuyu buz üzerinde PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
  3. Steril forceps ve makas kullanarak, dokunun nekrotik parçaları çıkarın. 2.3 ila 2.5 adımları sırasında dokuyu nemli ve soğuk tutun. İğne biyopsisi örnekleri için adım 2.3 ve 2.5'i atlayın ve örnekleri kesmeyin.
    NOT: Nekrotik doku genellikle dokunulduğunda kolayca parçalanır.
  4. Cerrahi karaciğer implantasyonu için 1 mm3 küpler halinde dokuyu kesin.
  5. Petri kabında 2 mm küpler halinde doku geri kalanı kesin.
  6. Histolojik analiz için %4 formalin içeren 1,7 mm'lik bir mikrotüpe ve genomik ve proteomik analiz için başka bir tüpe aktarın.
  7. Mikrotüpleri sıvı nitrojen içeren bir sıvı nitrojen kavanozuna koyun. Tüpleri kalıcı depolama için -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
    NOT: Hastadan numune alınması ile doku işleme arasındaki süre 30 dakikayı geçmemelidir.

3. Hasta Kaynaklı Tümör Dokusu ile Cerrahi Karaciğer İmplantasyonu

  1. Ameliyat için kaputa gelen tüm nesneleri % 70 etil alkol ile püskürtün.
    NOT: Bu cerrahi aletler, ısıtma pedleri ve anestezi makineleri içerir.
  2. Bir pamuklu bez ve kumaş levha ağırlığını ölçün.
  3. Bir fareyi %3-5 izofluran buharlaştırıcı ile indüksiyon odasına yerleştirerek anesthetize edin.
  4. Fare tamamen anestezi edildikten sonra, bir ısıtma yastığı üzerinde supine pozisyonda yerleştirin. Anestezi bakımı için% 1.5-3 isoflurane teneffüs etmek için farenin burnunu nisme üzerinde izofluran koni yerleştirin.
    NOT: Fare tüm işlem sırasında ısıtma yastığı üzerinde olması gerekir. Isıtma eksikliği hipotermiye neden olabilir.
  5. Farenin ayağı ultra ince forceps ile dikilmiş olduğunda hiçbir tepki ile uygun anestezi onaylayın.
  6. Ameliyattan önce mikro şırıngaüzerinde 27 G iğne kullanarak kanadına buprenorfin (0.6 mg/kg) deri altına enjekte edin.
  7. Karın% 70 etil alkol uygulayın ve yukarı ve aşağı kürk yayıldı. Kürk yayıldıktan sonra, daha kolay bir kesim için sol subkostal alanın altında cildin daha kolay görselleştirme onaylamak. Kürkü karından kesmeyin.
    NOT: Kürk, ameliyattan sonra kesi bölgesini gizleyecek ve farenin kesi sonrası ameliyatı tırmalaymasını önleyecektir. Ancak, kurumsal standartlara göre kesi alanı enfeksiyonu önlemek için kürk tıraş olabilir.
  8. Iyot uygulayın ve cilde emilir sağlar.
  9. Fare üzerinde 2 cm delik li steril bir cerrahi örtü yerleştirin.
  10. Kavisli ultraince forseps ile karın derisi kaldırın ve kavisli makas ile 1 cm enine sol subkostal deri kesi yapmak.
  11. Kesinin derisinin altına kavisli makasın ucunu yerleştirin ve peritonu deriden ayırmak için hafifçe açın. Makasları kesikten kapalı bıçaklarla geri çek.
    NOT: Farenin içindeki makasların açılması ve kapanması hasara ve kanamaya neden olabilir.
  12. Periton altında karaciğer bulun. Periton aracılığıyla koyu kırmızımsı bir renk onaylayın.
  13. Kavisli makas ile, periton bir 1 cm enine kesi yapmak. Bir periton arter kesme kenarından kanarsa, hemen kateter ile kanamayı durdurun.
  14. Bir elinizle kavisli ultraince forsepskullanarak yağ dokusunu alın, sol karaciğer lobunun altına pamuklu bir bezin kenarını yerleştirin ve karaciğeri ortaya çıkarmak için diğer elinizle bezi aşağı doğru yuvarlayın.
    NOT: Yağ dokusu kapma pamuklu bez yapışmasını yağ dokusu tutmak için önemlidir.
  15. Pamuklu bez üzerinde karaciğer dışlaştırmak ve olmayan dokuma emici kumaş levha üzerine karaciğer yerleştirin.
    NOT: Kumaş levha karaciğer stabilize ve kanama emici iki temel rol oynar.
  16. Parankimde bir cep oluşturmak için steril no. 11 neşter bıçağı kullanarak 5 mm genişlik ve derinlikte bir kesi yapın ve kesi bölgesine pamuklu bezle hafifçe bastırın.
    1. Bıçağı karaciğer yüzeyine paralel olarak yerleştirin ve yatay olarak kesin.
    2. Herhangi bir kanamayı durdurmak için kesi bölgesine pamuklu bezle basın.
      NOT: Bıçak dikey tutmayın, aksi takdirde karaciğer kırmak ve karaciğer ortasında büyük damarları zarar.
  17. Kesi bölgesini açmak için pamuk lu bezi yukarı doğru yuvarlayın ve kavisli ultra ince forceps ile cebine 1 mm3 küp tümör dokusu yerleştirin. Pamuk bezi ters döndürme de yuvarlar ken ve aşağı bastırırken forcep'leri geri çekin.
    NOT: Forceps geri çekerken pamuklu bez ile kesi yerinde bastırarak cebiiçinde tümörün yerinden önlemeye yardımcı olur.
  18. İmplantasyondan sonra pamuklu bezi kesi bölgesinden hafifçe alın. En kısa sürede adım 3.19'a geçin.
  19. Kesi bölgesine emilebilir bir hemostat koyun.
  20. Hemostazolduğunu doğrulayın. Kanama devam ederse, kesi bölgesine daha fazla hemostat ekleyin.
  21. Forceps ile kumaş levha kapalı karaciğer Peel (tercihen künt uçlu) ve karın boşluğuna geri karaciğer koymak.
  22. 5-0 emilebilir dikiş kullanarak çift ligatür ile dikiş periton.
  23. 5-0 emilebilir dikiş kullanarak üçlü ligature ile dikiş cilt.
    NOT: Üçlü ligatür cerrahi kesi dehiscence önlemeye yardımcı olur.
  24. Tamamen uyanana kadar faregözlemlemek ve kafese geri koymak.
  25. Ameliyat sırasında kanama hacmi için pamuklu bez ve kumaş levha nın ağırlığını kanla ölçün. Ameliyattan önce orijinal ağırlıkları ile karşılaştırın. Ameliyat sırasında kanamayı farede dolaşan kan hacminin %10'una düşürün.

4. Toplama ve Kültürlü İnsan Karaciğer Metastatik Uveal Melanom Hücre Hattı İşlenmesi

  1. Kültürlü hücreler hazırlayın.
  2. Hücreleri toplayın ve hücre sayacı kullanarak hücre numarasını hesaplayın.
  3. 15 mL'lik bir tüpte 10,0 x 106 hücre için uygun miktarda hücre süspansiyonu hazırlayın.
  4. Tüpü oda sıcaklığında bir santrifüjde 5 dk 300 x g'da döndürün.
  5. 15 mL tüpteki süpernatantı çıkarın. Hücre peletini tüpün alt kısmında bırakın.
  6. 1,7 mL'lik bir tüpe 50 μL RPMI 1640 orta ekleyin.
  7. Uç açıklığı büyütmek için 200 μL ucunun ucunu makasla kesin.
  8. RPMI olan 1,7 mL tüp içine kesme ucu ile bir pipet kullanarak bodrum membran matris 60 μL ekleyin.
  9. 1.7 mL tüpte RPMI ve matrisi karıştırın. Girdap yap.
  10. 15 mL tüpteki hücre peletinin içine karışımın 110 μL'sini ekleyin. Hücre süspansiyonuna yeni bir 1.7 mL tüp aktarın.
  11. İğne enjeksiyonundan önce tüpü buzda tutun.

5. Kültürlü İnsan Karaciğer Metastatik Uveal Melanom Hücre Hattının Karaciğere Cerrahi İğne İmplantasyonu

  1. Yukarıdaki protokolü 3.1'den 3.15'e kadar izleyin.
  2. 27 G iğne ile bir mikroşiniş ile hücre süspansiyon toplayın.
  3. İğneyi karaciğer yüzeyi boyunca takın ve iğnenin ucunu 5 mm daha derine doğru ilerletin.
  4. Karaciğere 20 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
  5. Enjekte edilen hücrelerin dışarı sızmasını önlemek için karaciğerin ekleme noktasını kauterize edin. Hemostazolduğunu doğrulayın.
  6. Yukarıdaki protokolü 3.21'den 3.24'e kadar izleyin.

6. CT Taraması

  1. Uyanık durumda bir dizginleyici içine fare yerleştirin.
  2. Dezenfeksiyon ve vazodilatasyon için steril bir alkol yastığı ile kuyruk silin.
  3. 1 mL şırıngaüzerinde 27 G iğne ile kuyruk damarına 100 μL CT kontrast maddesi enjekte edin.
  4. CT taraması almadan önce enjeksiyondan sonra 4 saat bekleyin.
    NOT: Bu ajan karaciğer Kupffer hücreleri tarafından alınır kadar 4 saat sürer.
  5. Enjeksiyondan dört saat sonra tümör taşıyan fareyi %3-5 buharlaştırılmış izofluran ile indüksiyon odasına yerleştirerek anestezi edin.
  6. Fare tamamen anestezi yedikten sonra, ct'ye yatkın konuma yerleştirin.
  7. Farenin ayağı ultra ince forceps ile dikilmiş olduğunda hiçbir tepki ile uygun anestezi onaylayın.
  8. 15 dakika boyunca ct taraması alın.
  9. CT taramasından sonra farenin tamamen uyanAna kadar olduğundan emin olun ve kafese geri koyun.
  10. Tümörün varlığını değerlendirin ve BT görüntülerinde tümör boyutunu ölçün.
    NOT: Kontrast madde, normal karaciğer parankimini geliştirir, böylece unenhanced tümör tanımak kolaydır. Safra kesesini ve mideyi tümör olarak yanlış yorumlamayın.

7. Hasat ve İşleme Doku

  1. CO2 kullanarak fareleri ötenazi yaparak, işaret parmağını ve başparmağını kafatasının arkasına yerleştirerek ve vücudu kuyruğun tabanından çekerek servikal çıkık ı takip edin. En kısa sürede adım 7.2'ye geçin.
  2. Fareyi bir supine pozisyonda yerleştirin ve% 70 etil alkol ile karın sprey.
  3. Karın organlarını ortaya çıkarmak için ksifoid sürecinin altında 3 cm'lik enine kesi yapmak için steril çiller ve steril makas kullanın.
  4. Tümör dokusunu çıkar ve 2.1-2.2 adımlarını gerçekleştirin.
  5. Petri kabında 2 mm küpler halinde tümörün geri kalanını kesin.
  6. Kriyopreservation sonra yeniden implantasyon için kriyomedium ile bir kriyojenik tüp e nakledin.
  7. Tüpleri iyopropanol dolu kriyojenik bir dondurucu kapta koyun.
  8. Geçici depolama için kabı -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. Kriyomedium içeren kriyotüpleri doğrudan sıvı nitrojen tankına koymayın. Tümör dokusunu korumak için -1 °C/dk soğuma hızında yavaşça dondurun.
  9. Ertesi gün, tüpleri kalıcı depolama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

8. Yeniden implantasyon

  1. Tüpleri, doku implantına hazır olana kadar sıvı nitrojen içeren sıvı nitrojen kavanozunda dondurun. Canlılığı korumak ve engraftment şansını artırmak için oda sıcaklığına doku maruz ilerler.
  2. 37 °C'lik su banyosunda cryopreserved tüp eritme.
  3. 2.2-2.4 adımlarını gerçekleştirin.
  4. 3.1-3.24 adımlarında açıklandığı gibi çözülmüş tümörü farelere yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karaciğer cep yöntemi kullanılarak cerrahi ortotopik implantasyon altı ay içinde% 80 yüksek başarı oranı ile fare karaciğeriçine insan karaciğer metastatik uveal melanom tümörü nakli yapabilirsiniz. Ksenogreft tümörü, kız nodülleri olmadan tek başına tümör olarak karaciğerde engreftler(Şekil 1 ve Şekil 3A). Mikroiğneler kullanılarak karaciğere yapılan cerrahi ortotopik enjeksiyon tekniği, her durumda karaciğerde kültürlü insan karaciğer-metastatik üveal melanom hücrelerini başarıyla engrafted(Şekil 2 ve Şekil 3B). Ancak bazı olgularda ana tümör çevresinde yayılma vardı. Kontrast madde, 1 mm boyutundaki küçük tümörler de dahil olmak üzere BT'de karaciğerdeki tümörleri algılar(Şekil 3B). Kriyopayrılmış tümörlerin yeniden implantasyonu başarıile yüksek başarı oranları ile fare karaciğerinde onları kurdu. Kriyopreservation sonrası yeniden implante edilen ksenogreft tümörleri orijinal hasta tümörlerinin ve prekropayrılmış tümörlerin özelliklerini korur.

Figure 1
Şekil 1: Cerrahi ortotopik karaciğer implantasyonu ile hasta kaynaklı tümör ksenogreft fare modeli. Fare tümör implantasyonundan 6 ay sonra ötenazi yedirildi. Pigmentli siyah tümör (siyah ok) uveal melanomdur. Tümör karaciğerin sol lobunda engrafted olduğunu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İğne enjeksiyon yöntemi ile karaciğer ortopik insan hücre hattı kaynaklı tümör ksenograft fare modeli. Fare tümör enjeksiyonundan 8 hafta sonra ötenazi yedirildi. Pigmentli siyah tümör (siyah ok) uveal melanomdur. Tümör karaciğerin sol lobunda engrafted olduğunu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Karaciğerin sol lobundaki karaciğer tümörlerinin CT görüntüleri. Karaciğer tümörleri gelişmiş BT tespit edilir. Normal karaciğer dokusu kontrast ajan ile geliştirilmiştir. Beyaz oklar karaciğerin yanındaki mideyi gösteriyor. (A) Daha önce Şekil 1'degösterilen tümör (siyah ok). Cerrahi ortotopik implantasyon yalnız bir tümör oluşturur. (B) Şekil 2'dedaha önce gösterilen tümörler (siyah ok). İğne enjeksiyonu yöntemi birçok küçük tümörlerin bir küme oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Karaciğer cebi yöntemi için teknik ipuçları. (A-C) Karaciğerin sol lobu (beyaz oklar) 1 cm'lik bir kesi ile pamuklu bir bez (siyah ok) kullanılarak karın dan dışarı yaslanabilir. Kesigenişletmek için retraktör gerekmez. (D) Pamuklu bez kesiye yumuşak bir şekilde bastırır. Neşter (yeşil ok) ile kesi yaptıktan sonra hemostaz elde eder. (E) Pamuklu bez yukarı doğru yuvarlanır (kavisli kırmızı ok). Bu kesi açmak için karaciğer parankim kaldırır. Tümör sarı ok) ultraince forceps (mavi ok) tarafından kesi yoluyla karaciğer cebine yerleştirilir. (F) Pamuklu bez aşağı doğru yuvarlanır (kavisli kırmızı ok) cebine yerleştirilen bir tümörün geri adım atmasını önler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut ortotopik ksenogreft modelleri emek yoğun, zaman alıcı ve oluşturmak için pahalı. Karaciğer kanseri için ortotopik tümör ksenograft fare modelleri fazla yirmi yıl önce kurulmuştur19,20,21. Ancak, bu teknik karmaşıktır ve mikro iğne tutucu ve 6-0-8-0 gibi özel ekipman kullanımını gerektirir bir mikroskop altında ince dikişler. Tümör ve normal karaciğer dokusu dikiş kırılgan karaciğer dokusuzarar vermez, böylece dikkatle dikilmelidir. Konvansiyonel teknikler hematom ve nekroz gibi komplikasyonlara yol açar22. Son zamanlarda, modifiye tekniği bu sorunları çözmek için geliştirilmiştir23. Bu modifiye teknik karaciğer yüzeyinde tümör kapsayacak şekilde dikiş yerine emilebilir hemostatik malzemeler kullanır. Ancak, Bu modifiye yöntem tamamen karaciğer parankim içinde tümör kapsamaz. Tümörün bir kısmı dışarıya maruz kalır. Biz bir cerrahi ortotopik implantasyon tekniği geliştirdik-karaciğer cep yöntemi-parenkim içinde tamamen tümör ev18. Bizim yöntem tümörler için doğal bir ortam sağlamak için karaciğerde bir cep yapar. Karaciğer cebi yöntemi konvansiyonel teknikten daha basittir, bu da operasyonun başlangıcından itibaren birkaç dakika içinde karaciğere implantasyonu bitirmemizi sağlar. Bu yöntem karaciğerde bir soliter tümör oluşumu ile sonuçlanır ve metastaz tetiklemiyor, en azından biz fareler gözlenen sürece, tek bir hücre süspansiyon iğne enjeksiyonu intra-hepatik metastaz olarak yaymak eğilimindedir ise17. Bir soliter tümör tümör büyümesini değerlendirmek için daha uygundur ve bir ilaç denemesinde etkinliğini değerlendirmek için yararlı olacaktır.

Orijinal karaciğer cep yöntemi18ile karşılaştırıldığında, biz implantasyon tekniklerini geliştirmek için yöntemlerimizi modifiye ettik. İlk olarak, kesi boyutunu en aza indirmek için ameliyat sırasında bir retraktör kullanılmadı. Kesi küçüldüğünde, ameliyatta dikiş süresini kısaltabiliriz. Karnında 1 cm'lik bir kesi ile sol lobu pamuklu bir bezle kolayca dışarı çıkarabiliriz (Şekil 4A-C). İkinci olarak, bir pamuklu bez karaciğer cebini yaptıktan sonra hemostaz durdurarak üç önemli rol oynar, bir tümör parçası eklemek ve tümör geri itmeden cebinde tümör yığını istinat edebilmek için karaciğer cebini açma (Şekil 4D- F). Ortalama kanama hacmi farelerde dolaşan kan hacminin yaklaşık %10'undan daha azdı. Daha az kanama cerrahide büyük güven sağladı. Üçüncü olarak, bir kumaş levha karın dışında karaciğer lobu sabitleme için yararlıdır. Karaciğer lobu çarşafa yapışır ve böylece lobun karnına geri kaymasını önler (Şekil 4C). Bir kolayca bir neşter ile karaciğer yüzeyini kesmek ve karaciğer yüzeyine bir iğne enjekte edebilirsiniz. Sonuç olarak, kırılgan karaciğer dokusu yaralanmaz.

Bu yöntem için iki sorun giderme ipucu sunabiliriz. İlk olarak, küçük bir kesi bölgesi kullanıldığında, bazen sol lob görünmez. Bu durumda, sol lob muhtemelen diyafram yapışmasını. Sol lob ve diyafram arasında sol lob ve diyafram arasında açıkptaki kenar forceps sokup lobun soyulmasını önleyin. İkinci olarak, bir tümör parçası forceps ile karaciğer cebine yerleştirilir, tümör forceps sopa ve onunla geri çekin. Forceps geri çekilirken bir pamuklu bez ile kesi basın. Bu iyi cebinden tümörün çıkığı önlemek için çalışır.

Ksenogreft tümörleri ortokik implante olmasına rağmen fare dokusu ile çevrilidir. Hasta kaynaklı tümörlerde insan stromal hücreleri kaçınılmaz olarak fare stromal hücreleri ile değiştirilir. İdeal olarak, fare modeli daha iyi tümörler etrafında insan stromal doku sağlamak vardı. Chimeric humanized karaciğer fare veya insanize bağışıklık fare modelleri uveal melanom engraftment çalışma ve ilaç metabolizması bir insan-karaciğer veya insan-bağışıklık ortamı24,25aynı olup olmadığını değerlendirmek için yararlı olacaktır.

Ortotopik karaciğer tümörü ksenogreft fare modelleri görüntüleme çalışmaları ile tümör kurulmasının doğrulanmasını gerektirir. Fare karaciğer BT görüntüleri için geliştirilen ticari olarak kullanılabilir CT kontrast ajan, CT canlı durumda iç karaciğer tümörlerinin tespitine olanak sağlar. Kontrast madde özellikle BT normal karaciğer geliştirir. Bu tümörün gelişmiş olmayan site ayırt etmek kolaydır26. Ajan, BT'deki ana tümörlerin çevresinde 1 mm'den (kız nodülleri) daha az küçük tümörler tespit eder. Ajan fare tarafından tolere edilebilir, ve mümkün periyodik olarak karaciğer tümörleri izlemek için yapar. Ajan karaciğer lokalize ksenogreft tümörlere karşı anti-kanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılacak.

Genellikle, pdx modellerinin nispeten düşük geçiş numarasında (10'dan az) korunması, orijinal hasta kaynaklı tümörün genetik ve histolojik bütünlüğünükoruması tavsiye edilir27,28,29. Çoğu araştırmacı, pasaj ve hayvan sayısını azaltmak için PDX modellerinin birden fazla pasajı yapmaktan kaçınır. Hasta kaynaklı tümörler geçici olarak dondurucuda muhafaza edildikten sonra, pdx modellerini fareisi israf etmeden daha düşük bir geçit numarasıyla kontrol edebiliyoruz. Buna biyobankacılık stratejisi denir. Bir kanser biobank tümör özelliklerini korumak ve fare sayısını azaltmak için rasyonel biryaklaşımdır 28,30. Uygun bir biyobankacılık yönteminin oluşturulması, hastanın tedavi planını veya gelecekte fare ilaç etkinliği denemesini karşılayacak PDX modellerinin tedarikini ayarlayabilir. Kanser biyobankacılığı için kriyopayrılmış tümörlerin yeniden implantasyonu na ulaştık. Bu başarının yakın gelecekte PDX platformu kullanımını kolaylaştırdığını umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Taslağı gözden geçiren Mösyö Ohara, K. Saito ve M. Terai'ye müteşekkiriz. Yazarlar Fox Chase Kanser Merkezi'nde Dr R. Sato tarafından bu el yazması editoryal ve İngilizce yardım için eleştirel inceleme kabul. Burada açıklanan çalışma Bonnie Kroll Araştırma Fonu, Mark Weinzierl Araştırma Fonu, Thomas Jefferson Üniversitesi Göz Melanomaraştırma Fonu, Osaka Toplum Vakfı ve JSPS KAKENHI Grant Numarası JP 18K15596 Osaka City tarafından desteklendi Üniversitesi. Dr. Aplin'in laboratuvarındaki çalışmalar NIH hibe R01 GM067893 tarafından desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda Bir Dekan Dönüştürücü Bilim Ödülü, Thomas Jefferson Üniversitesi Programlı Girişim Ödülü tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4, (3), 145-151 (2018).
  2. Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
  3. Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98, (3), 383-389 (1991).
  4. Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123, (12), 1639-1643 (2005).
  5. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119, (5), 670-676 (2001).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4, (11), 1670-1680 (2009).
  8. Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16, (8), 2352-2362 (2010).
  9. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3, (3), 413-422 (1993).
  10. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1, (3), 471-475 (2010).
  11. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14, (20), 6456-6468 (2008).
  12. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3989-3998 (2007).
  13. Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3, (5-6), 469-482 (2009).
  14. Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
  15. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, (8), 451-452 (2015).
  16. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85, (2), 217-221 (2009).
  17. Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186, (1), 43-56 (2016).
  18. Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15, (1), 145 (2017).
  19. Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, (20), 9345-9349 (1991).
  20. Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6, (6), 2556-2561 (2000).
  21. Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72, (10), 2683-2691 (2012).
  22. Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
  23. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25, (79), e50544 (2013).
  24. Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46, (4), 1186-1190 (2014).
  25. Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
  26. Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6, (9), e25692 (2011).
  27. Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14, (5), 574-583 (2012).
  28. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12, (15), 4652-4661 (2006).
  29. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  30. Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6, (5), 14495 (2015).
İmmünficient Farelerde Karaciğer Ortotopik İnsan Uveal Melanom Xenograft Platformu Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter