Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

4-Thiouracil (Ers4tU) के साथ Vivo में आरएनए की अत्यंत तेजी से और विशिष्ट मेटाबोलिक लेबलिंग

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

थायोलेट यूरेसिल का उपयोग संवेदनशील और विशेष रूप से खमीर सकचरोमाइसीसेरेविसेसे नवलिखित आरएनए को शुद्ध करता है .

Abstract

न्यूक्लिओटाइड अनुरूप, 4-थायोरासिल (4tU), आसानी से कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है और आरएनए में शामिल किया जाता है क्योंकि यह विवो में लिखा जाता है, लेबलिंग की एक संक्षिप्त अवधि के दौरान उत्पादित आरएनए के अलगाव की अनुमति देता है। यह शामिल थायो समूह और आत्मीयता शुद्ध करने के लिए एक biotin moiety संलग्न द्वारा किया जाता है, streptavidin लेपित मोती का उपयोग कर. शुद्ध की एक अच्छी उपज प्राप्त करने, नव संश्लेषित आरएनए कि पूर्व मौजूदा आरएनए से मुक्त है कम लेबलिंग समय संभव बनाता है और गतिज अध्ययन में वृद्धि हुई अस्थायी संकल्प परमिट. यह नव संश्लेषित आरएनए के बहुत विशिष्ट, उच्च उपज शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि कैसे आरएनए खमीर Saccharomyces cerevisiae से निकाला जाता है. तथापि, कुल आरएनए से थायोलेटिड आरएनए के शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल किसी भी जीव से आरएनए का उपयोग कर प्रभावी होना चाहिए एक बार यह कोशिकाओं से निकाला गया है. शुद्ध आरएनए कई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों द्वारा विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, इस तरह के रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस-क्यूपीसीआर, आरएनए-सेक और SLAM-सेक के रूप में। विशिष्टता, संवेदनशीलता और इस तकनीक का लचीलापन आरएनए चयापचय में अद्वितीय अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं.

Introduction

आरएनए एक गतिशील प्रकृति है; इसके उत्पादन के तुरंत बाद बहुत आरएनए तेजी से संसाधित और निम्नीकृत है। वर्तमान में, आरएनए चयापचय के अधिकांश अध्ययन कुल सेलुलर आरएनए का विश्लेषण, जो ज्यादातर पूरी तरह से संसाधित है और स्थिर राज्य स्तर पर. यह स्तर प्रतिलेखन की दरों, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल परिपक्वता और निम्नीकरण के बीच संतुलन पर निर्भर करता है। स्थिर अवस्था संतुलन की ओर ले जाने वाली प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बहुत ही अल्पजीवी आरएनए प्रजातियों को पकड़ने के लिए विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है।

NUcleotide एनालॉग के साथ आरएनए की मेटाबोलिक लेबलिंग जैसे 4-thiouracil (4tU) या 4-thiouridine (4sU) (एक उत्कृष्ट समीक्षा के लिए Duffy एट अल.1 देखें), थायो लेबल नवजात RNAs और उनके प्रसंस्करण मध्यवर्ती को अलग करने की क्षमता प्रदान करता है. तथापि, प्रकाशित प्रोटोकॉल में कई मिनट2,3के लेबलिंग समय शामिल होते हैं, जो कई प्रतिलिपियों के उत्पादन की दर के सापेक्ष धीमा होता है। यह औसत खमीर जीन टाइप करने के लिए एक मिनट के क्रम में लेता है, तो कम से कम एक मिनट के लिए खमीर आरएनए लेबलिंग बहुत कम माना जा सकता है. अत्यंत तेजी से और विशिष्ट 4 thiouracil प्रोटोकॉल (ers4tU) 4tU निगमन को अधिकतम करने और unlabeled की वसूली को कम से कम द्वारा शोर अनुपात के लिए संकेत अधिकतम, पूर्व मौजूदा आरएनए बहुत कम लेबलिंग समय संभव4.

थायो-संशोधित आधार कोशिकाओं में तेजी से और पर्याप्त मात्रा में नए संश्लेषित आरएनए (nsRNA) लेबल करने के लिए आयात किया जाना चाहिए। इसे बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं को यूरेसिल-मुक्त माध्यम में उगाया जाता है, और एक उपयुक्त परमेज़ की अभिव्यक्ति 4tU या 4sU को बढ़ावा देने में मदद करती है (प्लाज्मिड की एक सूची के लिए तालिका 1 देखें जो उपयुक्त परमेज़ जीन और अनुपूरक चित्रा 1) लेते हैं। सोडियम हाइड्रॉक्साइड में 4tU की विलेयता अन्य न्यूक्लिओटाइड एनालॉग्स द्वारा आवश्यक विषाक्त कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता से बचा जाता है। दुर्भाग्य से, 50 डिग्री सेल्सियस से अधिक सांद्रता पर थायो-संशोधित न्यूक्लिओसाइड्स के साथ लंबी अवधि के लिए बढ़ती संस्कृतियों को राइबोसोम5को बाधित करने के लिए देखा गया है। तथापि, सांद्रता (10 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग यहाँ किया जाता है, और अत्यंत कम लेबलिंग समय, विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए देते समय हानिकारक प्रभावों को कम करता है

इस तकनीक को लक्ष्य प्रोटीन6,7 (चित्र 2) के तीव्र और विशिष्ट ऑक्सिन-मध्यस्थ अवक्षय के साथ संयोजित किया जा सकता है, जिसे "जेड-एएसटी एआईडी 4U" प्रोटोकॉल के रूप में जाना जाता है, जिसमें ऑक्सिन की जेड-एस्ट्राडियोल विनियमित अभिव्यक्ति inducible degron (AID) प्रणाली 4tU लेबलिंग के साथ संयुक्त है. जेड-एआईडी 4U दृष्टिकोण के साथ, एक लक्ष्य प्रोटीन को समाप्त कियाजा सकता है और आरएनए चयापचय पर प्रभाव बारीकी से निगरानी की जा सकती है (चित्र 2)। समय महत्वपूर्ण है; साथ वाले वीडियो को देखने और चित्र 2 और उसके एनिमेटेड रूप पर करीब से ध्यान देने की सलाह दी जाती है (पूरक चित्र 2देखें)।

आरएनए के प्रसंस्करण और गिरावट को सटीक समय समाधान के लिए बहुत तेजी से रोका जाना चाहिए। यह कम तापमान पर मेथनॉल का उपयोग करके हासिल किया जाता है, जो कोशिका की सामग्री को बहुत तेजी से ठीक करता है और न्यूक्लिक एसिड सामग्री8के संरक्षण के दौरान कोशिका झिल्ली को कम करता है। आरएनए निष्कर्षण कुशल होना चाहिए और आरएनए को नुकसान नहीं पहुंचाना चाहिए। यांत्रिक lysis chatropic एजेंटों की अनुपस्थिति में प्रभावी है (अक्सर इन थायो समूहों होते हैं, तो बचा जाना चाहिए). आरएनए की लिथियम क्लोराइड वर्षा को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि tRNAs कम कुशलता से वेग ित होते हैं। tRNAs तेजी से प्रतिलेखन कररहे हैं और स्वाभाविक रूप से thiolated 9, तो tRNAs हटाने biotinylation अभिकर्मक के लिए प्रतिस्पर्धा कम कर देता है. यदि छोटे, उच्च संरचित आरएनए ब्याज के हैं, शराब आधारित आरएनए वर्षा तरीकों की सिफारिश कर रहे हैं.

थायोलेटिड आरएनए को ठीक करने के लिए बायोटिन को 4tU के साथ आरएनए में शामिल थायो समूहों के माध्यम से सहसंयोजक रूप से संलग्न किया जाता है। संशोधित बायोटिन का उपयोग, जो एक क्लीवेबल डिसल्फाइड बांड (उदा., एचपीडीपी-बायोटिन (एन-$6-(बायोटिनामिडो)एचएक्सिल-3 - (2]पीयिडिलडीइथियो)पीरोपिओनामाइड, ) या एमटीएस-बायोटिन (मिथेन थियोसल्फोनेट) के माध्यम से देता है। के रूप में यह एक कम करने एजेंट के अलावा आरएनए की रिहाई की अनुमति देता है. जैव-ताइनित आरएनए चुंबकीय मनकों के साथ मिलकर स्ट्रेप्टेविडिन पर शुद्ध आत्मीयता है। यह प्रोटोकॉल पहले सूचीबद्ध अन्य लोगों के समान है10 लेकिन गहन पृष्ठभूमि को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

थायोल-लेबलिंग प्रयोग के दो प्रकार हैं जो किया जा सकता है, निरंतर और discontinuous लेबलिंग. प्रत्येक के अपने फायदे हैं। निरंतर लेबलिंग में 4tU संस्कृति और नियमित अंतराल पर लिया नमूने के लिए जोड़ा जाता है. इस प्रकार का प्रयोग दर्शाता है कि आरएनए को कैसे संसाधित किया जाता है और समय के साथ स्तर कैसे बदलते हैं। उदाहरण जंगली प्रकार के प्रयोगों और एक पल्स-चेज प्रयोग के साथ उत्परिवर्ती की तुलना शामिल हैं। चित्र 3ठ,ग में दिखाए गए प्रयोग इस प्रकार के हैं. विच्छिन्न लेबलिंग के लिए एक परिवर्तन प्रणाली में प्रेरित है और आरएनए निगरानी की. एक बार परिवर्तन प्रेरित किया गया है संस्कृति कई उप संस्कृति में विभाजित किया जाना चाहिए, और विशिष्ट समय पर, हर एक तो एक संक्षिप्त अवधि के लिए थायो लेबल है. इसका एक उदाहरण चित्र 27में दर्शाए गए एआईडी 4U है। इस प्रकार का प्रयोग आरएनए प्रक्रमण पर उपापचयी परिवर्तन के प्रभाव की निगरानी के लिए विशेष रूप से उपयोगी है (चित्र 3ददेखें ) ।

चित्र 4 और चित्र 5में थायो-लेबलिंग प्रयोग का आलेखीय निरूपण प्रस्तुत किया गया है और एक प्रदेषक जो प्रोटोकॉल के निष्पादन को बहुत सरल बनाता है , उपलब्ध है (4tU प्रयोग template.xlsxदेखें) . के रूप में अच्छी तरह से इस के रूप में पूरक जानकारी एक व्यापक समस्या निवारण मार्गदर्शिका शामिल हैं. $-एएसटी AID 4U प्रोटोकॉल के लिए जो 4tU लेबलिंग को औक्सिन अवक्षय प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत करता है, चित्र 2 और अनुपूरक चित्र 2देखें। विस्तृत AID कमी प्रोटोकॉल के लिए Barrass एट अल7 देखें।

Protocol

1. वृद्धि और थायो-लेबलिंग

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड को पूरा करने के लिए समय अत्यधिक चर है, सेल वृद्धि दर के आधार पर. नमूनों को संसाधित करने के लिए थायो-लेबलिंग से पहले समाधान और उपकरण तैयार करने के लिए 1 ज और 30 मिनट के बाद लेबलिंग की अनुमति दें।

  1. यह सुनिश्चित करें कि S. cerevisiae तनाव एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक permease (तालिका 1) सेल में 4tU आयात को बढ़ावा देने के लिए शामिल हैं।
    नोट: एक आयातक के बिना, कम से कम 2 मिनट के लिए लेबलिंग सफल होने की संभावना नहीं है11 (देखें अनुपूरक चित्र1). 4tU निगमन अधिक कुशल है अगर विकास uracil के बिना माध्यम में है, तो तनाव URA3होना चाहिए +; तालिका 1 में प्लाज्मिड के कई मार्कर के रूप में URA3 ले. यदि इस प्रोटोकॉल को $-एस्ट एड्स अवक्षय7के साथ संयोजित किया जाना है, तो अतिरिक्त तनाव संशोधनों की आवश्यकता होती है।
  2. एमिनो अम्लों के बिना 6ण्9 ग्राम खमीर नाइट्रोजन आधार, 20 ग्राम ग्लूकोज, तथा 1ण्92 ह एससीएसएम एकल बूंद-अप (सामग्रीकीसारणी) को 1 ल् जल में जोड़कर वाईएमएम यूरेसिल-मुक्त माध्यम को तैयार कीजिए। ऑटोक्लेव या फिल्टर उपयोग करने से पहले विकास माध्यम बाँझ।
    नोट: फ़िल्टर नसबंदी नमूना संग्रह में इस्तेमाल मेथनॉल में कोशिकाओं के साथ autoclaving सह-वेग द्वारा उत्पादित पेप्टाइड /चीनी परिसरों के रूप में पसंद किया जाता है।
  3. YMM uracil मुक्त माध्यम में खमीर बढ़ाएँ 600 एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए (ओडी600) 0.6 डिग्री 0.8 के. सुनिश्चित करें कि संस्कृति लॉग चरण विकास में है और कम से कम दो दोहरीकरण के लिए किया गया है. 30 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि सामान्य रूप से सिफारिश की है, लेकिन अन्य तापमान, उदाहरण के लिए, तापमान के प्रति संवेदनशील उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: तनाव पर निर्भर करता है, विकास की स्थिति और आरएनए उपज, लगभग 30 एमएल नमूना मात्रा की जरूरत होगी. यह राशि पूरे प्रोटोकॉल में मान ली जाएगी. संस्कृति के 30 एमएल सबसे अधिक है कि मेथनॉल के 20 एमएल के साथ एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फिट होगा, तो अनुकूलन शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक मात्रा है। आरएनए वसूली बढ़ाने के लिए प्रारंभिक समय अंक के लिए अधिक नमूना मात्रा का उपयोग करने पर विचार करें, अप करने के लिए 2000 एमएल वास्तव में कम लेबलिंग समय पर धीमी बढ़ती कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है (और lt;1 मिनट).
  4. बर्फ पर एच2ओ के 50 एमएल के बारे में ठंडा। प्रत्येक नमूने के लिए, एक 2 एमएल पेंच टोपी ट्यूब और बर्फ पर ठंडा करने के लिए zirconia मोती के 200 $L जोड़ें. इसके अलावा मेथनॉल (कौशन) के 20 एमएल, 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डाल दिया, और सूखी बर्फ पर जगह (कौशन)। मेथनॉल 1 /3 से 2/3 नमूने की मात्रा होना चाहिए।
    चेतावनी: मेथेनोल साँस लेना, संपर्क और खपत से विषाक्त है। एक धूआं हुड में बड़ी मात्रा में प्रसार, और दस्ताने के दो जोड़े पहनते हैं, के रूप में मेथनॉल nitrile प्रयोगशाला दस्ताने घुसना कर सकते हैं. मेथेनोल अत्यधिक ज्वलनशील है, प्रज्वलन के सभी स्रोतों से दूर रखना.
    नोट: के रूप में सूखी बर्फ संपर्क पर ठंड जलता पैदा कर सकता है और asphixiant गैस का उत्पादन, दस्ताने का उपयोग करें जब हैंडलिंग और एक अच्छी तरह से हवादार अंतरिक्ष में उपयोग करें.
    नोट: इस बिंदु पर मोती जोड़ने के बाद नमूना जोड़ा गया है के बाद से आसान है ट्यूब सूखी है और जब सेल गोली नीचे कताई मोती भी कुछ समय की बचत ट्यूब धागा के स्पष्ट काता रहे हैं. साथ ही, यह मोती नमूना जोड़ा गया है इससे पहले कि शांत करने के लिए अनुमति देता है।
  5. यदि एक एस pombe कील संस्कृति के लिए जोड़ा जा रहा है (बाद के बजाय), बर्फ और भंवर पर thiolated एस pombe कोशिकाओं के एक aliquot thaw अच्छी तरह से, कम से कम 30 s, तो संस्कृति में जोड़ें. यदि नीचे दिए गए निर्देशों के अनुसार तैयार, एक एस pombe alicot संस्कृति के 400 एमएल के लिए पर्याप्त है (बारह के लिए पर्याप्त 30 एमएल नमूने प्लस एक छोटे से हैंडलिंग में त्रुटियों के लिए अनुमति देने के लिए). यदि कम या ज्यादा संस्कृति का उपयोग किया जाता है, एस pombe की मात्रा को समायोजित संस्कृति में जोड़ा.
    1. एस pombe संस्कृति के 1 एल हो जाओ OD600 करने के लिए 0.8 बिल्कुल के रूप में एस cerevisiaeके लिए प्रोटोकॉल में वर्णित .
    2. कदम 1.7 के रूप में Thio लेबल, लेकिन 10 मिनट के लिए.
    3. सूखी बर्फ पर मेथनॉल के 400 एमएल का उपयोग कर संस्कृति के सभी ठीक, अनिवार्य रूप से चरण 1.9 में वर्णित के रूप में.
    4. 3 मिनट के लिए 3000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली।
    5. अधिनामी को त्याग ें और एच2ओ के 3.3 एमएल में कोशिका गोली को पुनः निलंबित करें।
    6. प्रत्येक 80 डिग्री सेल्सियस के ऐलिकोट में विभाजित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. 400 एमएल संस्कृति या 30 एमएल नमूने के प्रति 10 डिग्री एल के लिए एक alicot के सभी का प्रयोग करें।
      नोट: यदि RNAseQ कर रहा है, तो स्पाइक की मात्रा 1/10 करने के लिए कम करें। एलिकोट का पुन: उपयोग न करें; किसी भी अप्रयुक्त स्पाइक को छोड़ दें। यह स्पाइक समय बिंदुओं और प्रयोगों में परिणामों को सामान्य बनाने और तुलना करने के लिए उपयोगी है.
  6. विच्छिन्न लेबलिंग के लिए, आवश्यक चयापचय क्षोभ को प्रेरित करें (उदाहरण के लिए, वृद्धि की स्थिति, जीन प्रेरण या अवक्षय जैसे कि $-एस्ट एड7 (चित्र 2 और अनुपूरक चित्र2), फिर संस्कृति को विभाजित करें। सुनिश्चित करें कि सभी फ्लास्क और मीडिया आवश्यक तापमान पर हैं और, यदि संभव हो तो, संस्कृति जोड़ने से पहले माध्यम को हवा दें।
  7. 10 डिग्री मीटर की एकाग्रता के लिए संस्कृति में 4tU जोड़ें और जोरदार मिश्रण (1/10,000 की संस्कृति की मात्रा के 100 m 4tU 1 M NaOH में भंग). 15 s से 5 मिनट के लिए Thiol लेबल.
    नोट: तीस सेकंड एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है. 20 से कम समय के लिए थायो-लेबलिंग समय के दबाव में संस्कृति को जोड़-तोड़ करने में कठिनाइयों के कारण अधिक परिवर्तनीय परिणाम देता है। हालांकि, अधिक से अधिक 1 मिनट के लिए लेबलिंग तकनीक के अस्थायी संकल्प कम कर देता है.
  8. यदि एक चेस प्रयोग किया जाना है; को यो-लेबलिंग की अनुमति दें 20 $30 s तो पीछा 1 /200 संस्कृति मात्रा 1 M uridine (नहीं thiolated) जोड़ने के द्वारा, 5 m की एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
    नोट: Uridine पीछा के लिए uracil के लिए बेहतर है, के रूप में uridine अधिक पानी में घुलनशील एक छोटी मात्रा संस्कृति में जोड़ा जा करने की अनुमति है और इसलिए वहाँ कोशिकाओं के विकास के लिए कम अशांति है.
  9. नियमित अंतराल पर संस्कृति के नमूने ले लो (कम से कम 15 s), समय पाठ्यक्रम के अंत करने के लिए. इस से कम नमूना अंतराल मज़बूती से प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. चरण 1.4 में तैयार सूखी बर्फ पर मेथनॉल के लिए नमूना जोड़ें। सुविधा के लिए, एक 50 एमएल ट्यूब में 20 एमएल मेथनॉल युक्त संस्कृति के 30 एमएल जोड़ें।
    नोट: कार्बन डाइऑक्साइड मेथनॉल में घुल जब ठंड; इस नमूने और फोम के अलावा पर समाधान से बाहर आता है जोरदार मिश्रण पर-जिसनमूना नमूना हानि में. इससे बचने के लिए, मेथनॉल को एक कसकर सील ट्यूब में 70 डिग्री सेल्सियस ठंडा करें जब तक कि इसकी आवश्यकता के समय के करीब न हो, फिर सूखी बर्फ में स्थानांतरित करें।
  10. ट्यूब को सील करें और मिलाते हुए अच्छी तरह से मिलाएं। बर्फ पर नमूने रखें. जाँच करें कि नमूनों में से कोई भी जमे हुए है; यदि हां, तो धीरे हाथ में गर्म, लगातार उलटा. यह सबसे अच्छा हाथ में किया जाता है के रूप में नमूना तापमान का मूल्यांकन किया जा सकता है, यह हमेशा ठंड महसूस करना चाहिए. बर्फ पर रखें. यह विराम बिंदु नहीं है; एक बार सभी नमूना तरल पदार्थ अगले कदम के लिए आगे बढ़ना है.
  11. कोशिकाओं को गोली देने के लिए 2 मिनट (यदि संभव हो तो 4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 3000 x ग्राम पर स्पिन करें। तरल डालो और धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा बर्फ ठंडा पानी के कम से कम 1 एमएल में गोली resuspend.
    नोट: नमूना गोली एड्स resuspension में अवशिष्ट मेथनॉल.
  12. चरण 1.4 में तैयार के रूप में 2 एमएल पेंच टोपी ट्यूबों के लिए स्थानांतरण। संक्षेप में स्पिन करें (उदा., 10 s कुल समय) पर 13,000 x g कोशिकाओं को फिर से गोली, बर्फ पर वापस जगह है और तरल को दूर करने के लिए।
    नोट: सेल गोली कई महीनों के लिए -70 से -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. कुल आरएनए की तैयारी

नोट: पूरा करने के लिए समय 90 मिनट है.

  1. आरएनए को अवक्रमण से बचाने के लिए डाइएथिल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) का इलाज समाधान का उपयोग करें। अलीकोट फिल्टर पिपेट सुझावों का उपयोग कर समाधान और हर समय दस्ताने पहनते हैं।
    1. एक समाधान करने के लिए DEPC के 1/1000 मात्रा में जोड़ने के लिए और जोरदार मिलाते हुए मिश्रण।
    2. 24 ज के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें, फिर ऑटोक्लेव।
    3. अमीन समूहों के साथ समाधान (जैसे tris) DEPC इलाज नहीं किया जा सकता है। Alicot पाउडर और दुकान विशेष रूप से आरएनए काम के लिए. समाधान बनाने के लिए पहले DEPC का इलाज H2O का उपयोग करें।
      नोट: आरएनए पर थायो-समूह के रूप में photoactivatable है, पर इस बिंदु से यूवी प्रकाश के लिए जोखिम को कम से कम. भंडारण अंधेरे में होना चाहिए और ऊष्मायन सबसे अच्छा एक ढक्कन के साथ एक पीसीआर मशीन में किया जाता है।
  2. यदि एक एस pombe स्पाइक के बजाय संस्कृति (दोनों मत करो) सेल गोली में जोड़ा जा रहा है, अब इसे जोड़ें. गोली को जोड़ने से पहले, कम से कम 30 s, बर्फ और भंवर पर अच्छी तरह से थायोलेटेड एस पोम्बे कोशिकाओं के एक aliquot थाव।
    नोट: यदि चरण 1.5.1$1.5.7 के अनुसार तैयार किया जाए, तो 10 डिग्री सेल्सियस एस पोम्बे एलिकोट के 30 एमएल से प्राप्त एक गोली के लिए आवश्यक है।
  3. टोपी पर डालने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई zirconia मोती टोपी और ट्यूब के बीच फंस रहे हैं, जो नमूना और फिनोल ट्यूब से रिसाव करने के लिए पैदा कर सकता है 1 के लिए बहुत संक्षेप में स्पिन.
  4. एसीटेट EDTA (एई) बफर (50 एमएम सोडियम एसीटेट पीएच 5.3, 10 एमएम EDTA पीएच 8.0) के 400 $L में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, जोरदार भंवर द्वारा। 10% (w/v) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 40 डिग्री एल जोड़ें। भंवर मत करो, के रूप में एसडीएस फोम होगा.
  5. यदि $-एस्ट एआईडी 4U प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना है, तो प्रोटीनविश्लेषणके लिए सेल निलंबन का 40 डिग्री सेल्सियस 7 लें। मात्रा को 40 डिग्री सेल्सियस तक वापस करने के लिए एई के 40 $L जोड़ें।
  6. कम पीएच पर फीनॉल (कौशन) के 800 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 10 s के लिए भंवर.
    चेतावनी: फेनोल साँस लेना और संपर्क से विषाक्त और संक्षारक है. हमेशा एक धूआं हुड में फिनोल शामिल प्रक्रियाओं प्रदर्शन और दस्ताने के दो जोड़े पहनते हैं.
  7. सबसे कम बिजली की स्थापना पर तीन 2-मिनट फटने के लिए एक homogenizer (उदाहरण के लिए, सामग्री कीतालिका) में कोशिकाओं Lyse. एकरूपता की दालों के बीच 2 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने छोड़ दें.
    नोट: अन्य homogenizers का उपयोग कर, तो शर्तों का अनुकूलन। अपर्याप्त मिलाते हुए गरीब पैदावार में परिणाम होगा, जबकि अत्यधिक मिलाते हुए स्पष्ट उच्च उपज में परिणाम, के रूप में 260 एनएम (ए260)पर अवशोषण द्वारा निर्धारित, लेकिन आरएनए अपमानित किया जा सकता है. एक homogenizer पसंद किया जाता है, लेकिन गर्म फिनोल आरएनए शुद्धि12 इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर lysed नमूना प्लेस, जब तक यह solidifies, यह जीनोमिक डीएनए आरएनए में ले जाने को कम कर देता है. बहुत लंबे समय के लिए फ्रीज मत करो के रूप में नमूना thaw नहीं होगा. RT में माइक्रोफ्यूज में 5 मिनट स्पिन; 4 डिग्री सेल्सियस पर ऐसा करने के लिए परीक्षा नहीं है, के रूप में नमूना /
    नोट: नमूना अभी भी स्पिन के अंत में जमे हुए है, तो नमूना पूरी तरह से thawed है जब तक एक और 5 मिनट के लिए फिर से स्पिन.
  9. Phenol/chlorform निकालने तो एक बराबर मात्रा के साथ क्लोरोफॉर्म निकालने (लगभग 600 $L) phenol:chlorform 5:1 तो क्लोरोफॉर्म (कौशन). शीर्ष चरण को अन्य ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें फीनॉल:क्लोरोफॉर्म 5:1 या क्लोरोफॉर्म होता है। भंवर, तो आरटी पर एक microfuge में 5 मिनट के लिए स्पिन. फिर एक नया 1.5 एमएल ट्यूब के लिए शीर्ष चरण हस्तांतरण।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म साँस लेना और संपर्क से विषाक्त है. हमेशा एक धूआं हुड में क्लोरोफॉर्म शामिल प्रक्रियाओं प्रदर्शन और दस्ताने के दो जोड़े पहनते हैं।
  10. 10 एम लीसीएल का एक तिहाई से आधा खंड (लगभग 300 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, और आरएनए को वेग देने के लिए मिश्रण करें। नमूना तुरंत बादल जाना चाहिए, लेकिन बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए छोड़ दें (के रूप में यह फ्रीज होगा -20 डिग्री सेल्सियस नीचे की दुकान नहीं है), या जब तक वेग floculates.
  11. एक माइक्रोफ्यूज में 5 मिनट के लिए स्पिन और 13,000 x ग्राम। तरल पदार्थ निकालें, संक्षेप में फिर से स्पिन और dregs हटा दें. 70% इथेनॉल के 300 डिग्री $L के साथ गोली धो लें, संक्षेप में स्पिन और शेष इथेनॉल को हटा दें।
    नोट: इन washes के दौरान पहली स्पिन के रूप में ट्यूब के एक ही पक्ष पर गोली रखने के लिए, इस तरह गोली कदम और तोड़ नहीं होगा; अगर यह टूट जाता है आरएनए के कुछ दुर्घटनावश खो सकता है.
    नोट: गोली सूखी मत करो; जब तक तरल पदार्थ के अधिकांश हटा दिया गया है यह बाद के चरणों के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. आरएनए को इस स्तर पर कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -70 से -80 डिग्री सेल्सियस पर भी भंडारित किया जा सकता है।
  12. ते च ह 7.0 (10 एमएम ट्रास एचसीएल पीएच 7.0, 1 एमएम एएलटीए पीएच 8.0) के 90 डिग्री एल में आरएनए गोली को पुन: भंग कर के रूप में आरएनए गोली को फिर से भंग करने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में मिलाते हुए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके। यह कोई अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए होना चाहिए के रूप में आरएनए उच्च तापमान पर degrades. पूर्ण आरएनए solubilization के लिए जाँच करें और फिर एक 0.2 एमएल ट्यूब को स्थानांतरित. नमूने को ऊपर और नीचे पिपेट; वहाँ कोई "लंप" होना चाहिए, और तरल पदार्थ वृद्धि और टिप में आसानी से गिर जाना चाहिए. यह समाधान चिपचिपा है इसलिए अंतिम पाइपिंग गति धीमी होनी चाहिए।
    नोट: आरएनए इस स्तर पर अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; यह आरएनए विलेयता के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।

3. बायोटिनिलेशन

नोट: पूरा करने के लिए समय 60 मिनट है. निम्नलिखित चरणों को आसानी से अभिन्न टोपी के साथ ट्यूबों की एक पट्टी में किया जाता है के रूप में वे कम अलग टोपियां के साथ स्ट्रिप्स की तुलना में भंवर पर खोलने की प्रवृत्ति है.

  1. एक 5 एम एम HPDP-बायोटिन समाधान (MTS-बायोटिन) के 10 $L(1/10 अंतिम मात्रा) जोड़कर Biotinylate HPDP-बायोटिन के रूप में बिल्कुल उसी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, आरएनए और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए. बायोटिन जोड़ने से पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर कुछ सेकंड से अधिक समय तक आरएनए को प्रीहीट करें। अंधेरे में अधिकतम 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: इस हीटिंग के रूप में कुछ HPDP बैचों आरएनए नमूना में आरटी पर वेग की आवश्यकता है. एक गर्म ढक्कन के साथ एक पीसीआर ब्लॉक इस के लिए आदर्श है।
  2. अनिगमित बायोटिन को बाहर करने के लिए एक छोटा सा राल मात्रा, आकार बहिष्करण कॉलम (सामग्रीकीतालिका) तैयार करें। स्तंभ के नीचे टैग निकालें और टोपी ढीला, एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है. 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए 1500 x g पर स्पिन बफर जोड़ें 0.3 एमएल TE के धीरे से स्तंभ के शीर्ष करने के लिए और फिर से स्पिन. धोने दोहराएँ और 3 washes की कुल के लिए दो बार और स्पिन. अंत में एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब के लिए धोया स्तंभ हस्तांतरण.
  3. नमूना ऊष्मायन (चरण 3.1) पूरा होने के बाद, स्तंभ के शीर्ष पर नमूना जोड़ें. 2 मिनट के लिए 1500 x ग्राम पर स्पिन. बायोटिनलेटित आरएनए नमूना अब ट्यूब के नीचे है।
    नोट: एक 1 मिनट स्पिन पूरे नमूने को पूरा करने के लिए पर्याप्त नहीं है।
  4. 10 एम लीसीएल की एक तिहाई से आधी मात्रा (लगभग 40 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, चरण 2.10 के रूप में आरएनए को फिर से निर्धारित करने के लिए मिश्रण करें। नमूना तुरंत बादल जाना चाहिए, लेकिन बर्फ पर कम से कम 5 मिनट के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक वेग floculates के लिए छोड़ दें; -20 डिग्री सेल्सियस के नीचे स्टोर नहीं है क्योंकि यह स्थिर हो जाएगा। एक माइक्रोफ्यूज में 5 मिनट के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज।
  5. 80% इथेनॉल के साथ धो लें, $ 1 एच घूर्णन. चरण 2.11 में प्रक्रिया का पालन करें संभव के रूप में तरल पदार्थ के रूप में ज्यादा हटाने के लिए.
    नोट: के रूप में HPDP-बायोटिन 80% इथेनॉल में बहुत घुलनशील है, यह एक अतिरिक्त शुद्धि कदम है.
  6. 80% इथेनॉल धोने दोहराएँ जितना संभव हो उतना संयुक्त राष्ट्र शामिल बायोटिन को दूर करने के लिए।
    नोट: आरएनए भी अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर इस स्तर पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. नए संश्लेषित आरएनए की शुद्धि

नोट: पूरा करने के लिए समय 2 ज है।

  1. डीईपीसी उपचारित एच2ओ (65 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन का उपयोग चरण 2.12) में प्रक्रिया के समान 200 डिग्री सेल्सियस में आरएनए को पुनः भंग करना।
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर एक260 पर आरएनए एकाग्रता को मापने; नमूना पतला किया जा करने के लिए हो सकता है 1/10 यह स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक रेंज के भीतर प्राप्त करने के लिए. चिपचिपा आरएनए समान रूप से भंग है यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 s के लिए इस कमजोर पड़ने भंवर.
    नोट: biotinylation की दक्षता डॉट ब्लॉट13 द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है यदि आवश्यक हो.
  3. एक ताजा ट्यूब के लिए आरएनए के बराबर मात्रा में जोड़ें और DEPC में 200 डिग्री सेल्सियस तक बनाने के इलाज एच2ओ. सबसे कम आरएनए एकाग्रता के साथ नमूने के सभी का उपयोग करें और प्रत्येक के लिए आरएनए की एक समान राशि के लिए अन्य नमूनों की एक उचित मात्रा का उपयोग करें।
    नोट: स्प्रेडशीट 4tU प्रयोग template.xlsx इस गणना सहायता करने के लिए एक प्रपत्र है।
  4. जब नमूना आरटी पर है, जोड़ें 25 $L 10 x NaTM बफर (0.1 M Tris HCl पीएच 7.0, 2 एम NaCl, 250 m MgCl2), 1 M NaPi pH 6.8 के 25 $L (0.5 एम NaH2पीओ4 0.5 एम Na2HPO4) , और 10% एसडीएस के 2.5 $L. अच्छी तरह से मिलाएं और धीरे से स्पिन करें ([lt;30 s; लगभग 100 x g)।
    नोट: एसडीएस और लवण की वर्षा से बचने के लिए, नमूने 4.13 कदम अप करने के लिए निम्नलिखित प्रक्रियाओं के दौरान आरटी पर रखा जाना चाहिए।
  5. 1x NaTM बफर, 0.1 एम NaPi, और 0.1% एसडीएस, प्रति नमूना 2 एमएल युक्त मनका बफर बनाओ. H2O की आवश्यक राशि पहले जोड़ें और SDS अंतिम. यह 24 ज के बाद एक वेग रूपों के रूप में हर बार ताजा किया जाना चाहिए.
    नोट: वेग के गठन से बचने के लिए, मनका बफर निम्नलिखित प्रक्रियाओं के दौरान आरटी में रखा जाना चाहिए। DEPC इलाज या ऑटोक्लेव न करें।
  6. एक कम प्रतिधारण 1.5 एमएल ट्यूब के लिए streptavidin मोती के 50 डिग्री एल जोड़ें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब प्लेस, बसने के लिए मोती के लिए प्रतीक्षा करें और फिर तरल पदार्थ को दूर
  7. स्ट्रेप्टाविडिन मोती धो लें।
    1. मनका गोली पूरी तरह से resuspended है जब तक मनका बफर और भंवर के 200 $L जोड़ें. आम तौर पर 3 "5 s सब है कि आवश्यक है. आरएनए नमूना जोड़ा जाता है इससे पहले कि washes के लिए यह ट्यूब दौर बारी करने के लिए पर्याप्त है तो मोती ट्यूब भर में दूसरी तरफ यात्रा. फिर ट्यूब वापस मूल पक्ष को बारी तो मोती ट्यूब भर में एक बार फिर से यात्रा.
    2. तरल पदार्थ नीचे स्पिन करने के लिए 5 s की एक अधिकतम के लिए कम गति (लगभग 100 x ग्राम) पर ट्यूब स्पिन, लेकिन मोती नहीं.
    3. चुंबकीय रैक में रखें मोती चुंबक द्वारा कब्जा कर लिया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
    4. नमूनों की एक छोटी संख्या के लिए आकांक्षा द्वारा तरल पदार्थ निकालें; यदि कई नमूने लिए जाते हैं तो तरल को उतार लें।
      नोट: नमूनों की एक बड़ी संख्या के साथ, आकांक्षा द्वारा विशुद्ध रूप से सभी तरल पदार्थ को हटाने समस्याग्रस्त हो सकता है, के रूप में पहले नमूने में मोती बाहर सूख जा सकता है इससे पहले कि पिछले नमूना समाप्त हो गया है, यह पृष्ठभूमि बढ़ जाती है. चुंबक पर एक बार whilst में सभी नमूनों से तरल पदार्थ डालने से धुलाई तेजी से किया जा सकता है. वे डालने से पहले चुंबक पर एक छोटे से लंबे समय तक छोड़ दिया जाना चाहिए और तरल पदार्थ की छोटी राशि है कि दूर aspirated किया जाना है, लेकिन कुल मिलाकर, यह चुंबक पर और तरल पदार्थ के बिना कम समय का मतलब है. इस तरह, यह जल्दी से 24 या अधिक extractions करने के लिए संभव है।
  8. 200 डिग्री एल मनका बफर, 10 डिग्री एल 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन, और 2.5 डिग्री एल 5 मिलीग्राम/एमएल टीआरएनए, 20 मिनट घूर्णन अंत में आरटी पर मध्यम गति से समाप्त होता है। रोटेशन के लिए निलंबन में मोती रखने के लिए है. एक बार अवरुद्ध पूरा हो गया है चरण के रूप में तरल पदार्थ को हटा 4.7.2 $4.7.4 और फिर से धोने, अनुभाग 4.7 में कदम के रूप में.
  9. नमूने में मोती को पुन: निलंबित करें। 30 मिनट के लिए रोटेशन के साथ आरटी में इनक्यूबेट।
  10. ऊष्मायन के दौरान, प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें। जोड़ें 1/10 मात्रा (लगभग 10 $L) के 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.3 और ग्लाइकोजन के 20 डिग्री ग्राम, और एक रैक में 3 s. स्टोर के लिए लगभग 100 x g पर स्पिन जब तक की जरूरत है.
  11. मनकों से अनबाउंड आरएनए निकालें, चरण 4.7.2 $4.7.4 के रूप में. असीम आरएनए एक ताजा ट्यूब में दृढ़ किया जा सकता है, लेकिन लवण और एसडीएस यह बहुत मुश्किल शुद्ध करने के लिए बनाते हैं। फिर मोती धोने, के रूप में अनुभाग 4.7 भंवर के साथ, 3 की एक न्यूनतम करने के लिए 5 बार की एक अधिकतम करने के लिए.
  12. अंतिम धोने के बाद सभी तरल aspirate करने के लिए विशेष ध्यान रखना; प्रत्येक ट्यूब पर लौटने और एक बार फिर बफर के dregs aspirate.
  13. आरएनए को हल करने के लिए, मोतियों में नए सिरे से तैयार 0ण्7 एमजेड-मेरकैप्टोथेनोल (जेडएमई) का 50 डिग्री सेल्सियस मोती (1 /20 व्यावसायिक रूप से आपूर्ति किए गए स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने) को जोड़ें। भंवर और स्पिन संक्षेप में, कदम के रूप में 4.7.1 और 4.7.2. चुंबकीय रैक में घोल रखें और पिपेट को आरएनए में रखें जिसमें समाधान को चरण 4.10 में तैयार 1.5 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में रखा गया है।
  14. Elute एक बार फिर चरण 4.13 के रूप में मोती से अवशिष्ट आरएनए ठीक करने के लिए और इन मोती से पहले elution युक्त ट्यूब के लिए eluted नमूना जोड़ें.
  15. चुंबकीय रैक में वापस नमूना रखकर और एक ताजा, कम बाध्यकारी 0.5 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब के लिए तरल पदार्थ स्थानांतरित करके eluted आरएनए से अवशिष्ट मोती निकालें।
  16. नमूना मिश्रण और फिर इथेनॉल के 2.5x मात्रा (280 डिग्री सेल्सियस) जोड़कर nsRNA वेग और एक बार फिर मिश्रण. -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए 1 एच के लिए छोड़ दें। अधिकतम गति (कम से कम 13,000 x ग्राम) पर 20 मिनट के लिए एक पूर्व ठंडा अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में स्पिन करें।
  17. -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल के 200 डिग्री एल के साथ अच्छी तरह से धो लें। के रूप में अवशिष्ट जेडएमई बहाव अनुप्रयोगों को बाधित करेगा, संभव के रूप में dregs के रूप में ज्यादा हटाने के लिए हर कदम पर स्पिन; अंत में नमूना $ME की गंध नहीं होना चाहिए.
  18. DEPC के 10 डिग्री 20 डिग्री एल में फिर से भंग 1x TE 0.005 के बराबर के साथ $L RNase अवरोध करनेवाला.
    नोट: सभी बाद के चरणों बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  19. आरएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापने।
    1. एक कम नमूना मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक260 और एक225 को मापने.
      नोट: एक अवशोषण अधिकतम के पास $ 225 एनएम मोती से एक अपरिहार्य संदूषक से है. आरएनए की अनुपस्थिति में संदूषक से संकेत 260 दउ पर 35% तक गिर जाता है। इसलिए, आरएनए की वास्तविक राशि सूत्र द्वारा अनुमानित है: (A260-(A225* 0.35))*40 ng/
    2. वैकल्पिक रूप से, इस तरह के एक bioanalyzer के रूप में एक सूक्ष्म fluidics इलेक्ट्रोफोरोसिस प्रणाली पर नमूने का विश्लेषण.
      नोट: यह विश्लेषण आरएनए अखंडता का मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए बेहतर है, संदूषक परिमाणीकरण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है और कम नमूना की आवश्यकता है.
  20. NSRNA का विश्लेषण करें.
    नोट: उदाहरण के लिए, विशिष्ट RNAs मानक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज QPCR तकनीकों द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। आरएनए इस तरह से तैयार किया गया आरएनए-सेक के लिए पुस्तकालय की तैयारी के साथ संगत है। आरएनए को 5 मिनट से कम समय लेबलिंग के लिए आवश्यक नहीं है। इस आरएनए पर भी एसएलएएमसेक14 को पुन: कोडन किया जा सकता है।

Representative Results

इस ers4tU प्रोटोकॉल का उपयोग कर बरामद nsRNA के लिए विशिष्ट पैदावार चित्र 1bमें प्रदर्शित कर रहे हैं, यह एक bioanalyzer द्वारा उत्पादित किया गया है और ट्रेस आरएनए बनाम आकार की उपज से पता चलता है (nucleotides [nt]). ध्यान दें, दोनों bioanalyzer ट्रेस और इनसेट ग्राफ में, कि समय बिंदु से आरएनए वसूली 0 का एक बहुत छोटा सा हिस्सा है कि अब समय अंक से बरामद - लगभग 0.3 $g आरएनए के लगभग 109 कोशिकाओं से बरामद के रूप में दो बार से अधिक के रूप में ज्यादा के साथ तुलना में कोशिकाओं की समान संख्या से लेबलिंग (0ण्8 ख्ृग एन एस आर ए) के केवल 30 षोंद के बाद। 15 ै पर आरएनए वसूली अधिक चर है क्योंकि नमूने के निष्पादन में छोटे अंतर आरएनए वसूली पर आनुपातिक रूप से बड़ा प्रभाव डालते हैं। bioanalyzer ट्रेस में, rRNA अग्रदूतों 1000 nt के पास एक चोटी के रूप में देखा जा सकता है और चोटियों के एक डबल1700 पर 1800 nt. इन मध्यवर्तीों की बहुतायत के रूप में थायोलेशन जारी है बढ़ जाती है.

थायो-लेबलिंग का प्रयोग ACT1 प्रतिलिपि के splicing के लिए किया गया था (चित्र 3)। थाइलेशन किया गया और थायो-लेबलिंग के प्रारंभ से 15 अंतरालों पर लिए गए नमूने तथा ACT1 RNA की निगरानी की गई प्रक्रिया (चित्र 3क, ख) की गई थी। जैसा कि देखा जा सकता है, पूर्व mRNA उत्पन्न होता है (प्रतिलेखन द्वारा), और lariats (पूर्व mRNA से splicing के पहले चरण के द्वारा), यहां तक कि लेबलिंग के सिर्फ 15 s के बाद. के बारे में 45 s से 1 मिनट के बाद, lariats और पूर्व MRNA की मात्रा के रूप में इन आरएनए प्रजातियों के रूप में ज्यादा के साथ संतुलन तक पहुँचने प्रतिलेखन द्वारा बनाया जा रहा है के रूप में splicing द्वारा दूर संसाधित कर रहे हैं.

चित्र 3c में दिखाए गए आंकड़ों का उत्पादन करने के लिए तनाव 25 s के लिए 4tU के साथ स्पंदित किया गया था और फिर uridine के साथ पीछा किया. प्री-एमआरएनए और लारिएट्स की पीढ़ी 1 मिनट में अधिकतम पहुंच जाती है। यह चित्र 3खके साथ अच्छी तरह से तुलना करता है ; संतुलन के साथ-साथ लेबलिंग के 25 s तक पहुँचने के लिए 45 s के बाद अधिकतम प्राप्त किया जा रहा है। चोटी के बाद, थायो लेबल आरएनए के रूप में स्तर गिरावट splicing प्रक्रिया के माध्यम से पीछा कर रहे हैं.

चित्र 3क प्रोटीन स्पेलिकिंग कारक की कमी और आरएनए चयापचय पर इसके प्रभावको दर्शाता है, जो कि जेड-एआईडी 4U प्रणाली 6,7का उपयोग करता है। यहाँ, Prp16p के पास शारीरिक स्तर से कम है 5% इस स्तर के 25 मिनट के बाद कमी. Prp16p15splicing के दूसरे चरण के लिए एक आवश्यक splicing कारक है. Lariats splicing के दूसरे चरण के दौरान हटा रहे हैं (चित्र 3a),लेकिन यहाँ वे Pre-mRNA के स्तर से ऊपर वृद्धि के रूप में Prp16 सीमित हो जाता है. बाद में कमी के समय में, अन्य कारकों माध्यमिक प्रभाव के कारण सीमित हो जाते हैं, ताकि lariat के स्तर में कमी, और पूर्व mRNA स्तर वृद्धि. spliced MRNA का स्तर कम हो जाता है।

Figure 1
चित्र 1: 4tU और आरएनए वसूली में वृद्धि. (क) 4-थयौरासिल वृद्धि को प्रभावित करता है। यूरासिल के बिना YMM ड्रॉप-आउट विकास माध्यम में 4tU की एकाग्रता में वृद्धि एस सेरेविसिया (BY4741) p4Fui-PEST प्लाज्मिड ले जाने के दोहरीकरण समय बढ़ जाती है। एक Tecan अनंत प्रो 200 में 30 डिग्री सेल्सियस पर चार प्रतिकृति संस्कृतियों के विकास की निगरानी की गई थी. सभी संस्कृतियों लॉग चरण में भर में थे, OD600 के साथ 0.1 और 0.6 के बीच. मॉक NaOH के बराबर राशि के साथ एक नियंत्रण संस्कृति है जोड़ा है, जो अपने आप में विकास दर को बदल नहीं करता है. यह ग्राफ दर्शाता है कि थायो-लेबलिंग सेल को तीव्र लेबलिंग और क्षति के बीच समझौता है। त्रुटि पट्टियाँ 4 प्रतिकृतियां के मानक त्रुटि हैं। (ख) एन एस आर एन ए उपज लगभग 15 एस लेबलिंग से रैखिक रूप से बढ़ जाती है। मुख्य आंकड़ा शुद्ध के bioanalyzer निशान से पता चलता है, nsRNA से 0 (नहीं thiolated) करने के लिए 2 मिनट के अलावा 4tU के बाद 15 s अंतराल पर. ध्यान दें कि 15 s नमूना नहीं दिखाया गया है, क्योंकि यह unlabeled नमूना से अविवेच्य था. दो बड़ी चोटियों रिबोसोमल आरएनए (RRNAs) के अनुरूप हैं। RRNA अग्रदूतों और मध्यवर्ती परिपक्व RRNAs की तुलना में अधिक आणविक वजन पर कई चोटियों के रूप में दिखाई दे रहे हैं. समय के साथ इन अग्रदूतों और मध्यवर्ती की वसूली बढ़ जाती है। एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम दिखाए जाते हैं. इनसेट ग्राफ 4tU के साथ ऊष्मायन में वृद्धि के साथ nsRNA की वसूली से पता चलता है. 4tU के साथ विकास के बढ़ते समय के साथ nsRNA की उपज बढ़ जाती है। वसूली उल्लेखनीय रैखिक है (आर2 $ 0.934) इस प्रयोग के timescale भर में और भी 4tU के साथ 15 s लेबलिंग पर पृष्ठभूमि पर एक मामूली वृद्धि से पता चलता है भले ही bioanalyzer से आंख द्वारा unlabeled नमूना से अलग नहीं ट्रेस. त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियां के लिए मानक त्रुटि दिखाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: $-est AID 4U ]-est AID 4U आलेखी प्रोटोकॉल। $-एआईडी 4U प्रोटोकॉल के प्रोटोकॉल का एक आलेखी सारांश. एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक AID * टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को कम करने वाले ऑक्सिन प्रेरक degron (AID) प्रणाली की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है। इस मामले में, प्रोटीन अवक्रमण शुरू होने से 25 मिनट पहले डिग्रन प्रणाली अभिव्यक्ति शुरू की जाती है और प्रत्येक समय बिंदु पर थायोलेशन 1 मिनट के लिए होता है। नमूने प्रेरण से पहले और अवक्षय के दौरान हर 2 मिनट के लिए लिए लिया जाता है। पूरक चित्र 2में एक एनिमेटेड संस्करण प्रकट होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ACT1 आरएनए splicing के अग्रदूतों और मध्यवर्ती. ACT1 पूर्व MRNA प्रतिलिपि के splicing मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर16द्वारा नजर रखी गई थी. ACT1 अग्रदूत (पूर्व mRNA), मध्यवर्ती lariat-exon2 (Lariat) और spliced उत्पाद (mRNA) के स्तर के स्तर को ACT1 Exon2 के स्तर और स्थिर राज्य स्तर इन RNAs के खिलाफ सामान्यीकृत दिखाया जाता है. (क) ACT1 प्रतिलिपि पर QPCR उत्पादों का स्थान. ACT1 प्रतिलिपि16के splicing प्रतिक्रिया के अग्रदूतों, मध्यवर्ती और उत्पादों के स्तर परख करने के लिए इस्तेमाल किया QPCR उत्पादों के स्थानों की योजना बनाई। Exons बक्से द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, एक पंक्ति के रूप में intron और या तो अंत में हीरे के साथ लाइनों के रूप में QPCR उत्पादों, रंग रेखांकन में इस्तेमाल किया उन से मेल खाता है. पूर्व-mRNA पीसीआर पूर्व-mRNA के लिए विशिष्ट है और नहीं splicing के किसी भी मध्यवर्ती के रूप में इस उत्पाद शाखा बिंदु है जो splicing के पहले चरण के बाद बाधित है पार. Lariat PCR splicing के पहले चरण के उत्पाद का पता लगाने और दूसरे के बाद उत्पादित excised lariat होगा. MRNA पीसीआर splicing के उत्पाद के लिए विशिष्ट है, MRNA. एक्सऑन पीसीआर से परिणाम (सभी अग्रदूतों में मौजूद, मध्यवर्ती और उत्पादों, excised lariat को छोड़कर) रेखांकन में नहीं दिखाया गया है के रूप में इस डेटा को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और इसलिए हमेशा के बराबर है 1. (ख) सतत थायोलेबलिंग। पूर्व MRNA की मात्रा समय के साथ बढ़ जाती है के रूप में 4tU प्रतिलेखन द्वारा शामिल किया गया है और, एक छोटी देरी के बाद, splicing यह lariat-exon2 मध्यवर्ती और spliced उत्पादों के लिए धर्मान्तरित. इन पूर्व mRNA और lariat प्रजातियों के स्तर के रूप में कम के रूप में 4tU के साथ विकास के 15 s के रूप में कम के बाद पृष्ठभूमि से ऊपर का पता लगाने योग्य हैं और 4tU के साथ निरंतर लेबलिंग के लगभग 45 s के बाद एक अधिकतम तक पहुँचने, जिस पर बिंदु उनके उत्पादन spliced करने के लिए रूपांतरण द्वारा संतुलित है MRNA और/या गिरावट. मान उनके स्थिर राज्य के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं (ग्राफ के बाएँ सबसे बिंदु), और exon 2 स्तरों पर उनकी उपस्थिति दिखाने के लिए और एक्सऑन 2 के प्रतिलेखन की तुलना में प्रसंस्करण. के रूप में आरएनए SPlicing के रूप में मोटे तौर पर सह-प्रतिलेखन4,17 spliced MRNA तेजी से सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों हो जाता है, अपने स्तर exon 2 के समान है. तीन जैविक प्रतिकृति के मानक त्रुटि, प्रत्येक trilicate में परख. (ग) पल्स/ 25 सेकंड के थिओलेशन पल्स के बाद यूरिडीन के साथ पीछा किया। इन RNAs (बाएं सबसे बिंदु) के स्थिर राज्य के स्तर की तुलना में, वे शुरू में नए संश्लेषित पूल में बहुत प्रचुर मात्रा में हैं. स्तर धीरे-धीरे गिरावट के रूप में वे mRNA में संसाधित कर रहे हैं (या अपमानित), बहुत स्थिर राज्य के स्तर के समान स्तर तक आ 5 मिनट तीन जैविक प्रतिकृति के मानक त्रुटि, प्रत्येक triplicate में परख. (घ) एन एस एन ए और प्रोटीन की कमी। ACT1 पूर्व MRNA प्रतिलिपि की जांच मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर द्वारा निगरानी के रूप में पैनल में (एक) के रूप में चित्र 2में वर्णित auxin degron प्रणाली का उपयोग कर Prp16 प्रोटीन की कमी पर. Prp16 प्रोटीन का स्तर भी auxin कमी से पहले के स्तर के प्रतिशत के रूप में दूसरे वाई अक्ष के खिलाफ साजिश रची ग्राफ में प्रदर्शित कर रहे हैं. Prp16 spliceosome का एक महत्वपूर्ण घटक है, विशेष रूप से पैनल में दिखाया गया splicing के दूसरे चरण के लिए महत्वपूर्ण है (एक), जिसके बाद lariats अपमानित कर रहे हैं. जब यह कदम सीमित हो जाता है lariats शुरू में जमा. बाद के समय में अंक splicing पूरी तरह से विफल रहता है, lariats अब उत्पादन कर रहे हैं और पूर्व mRNA स्तर वृद्धि. त्रुटि सलाखों के तीन जैविक प्रतिकृति, प्रत्येक trilicate में परख की मानक त्रुटि कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रोटोकॉल अनुभाग 1 से 3 का ग्राफ़िकल सारांश. कोशिकाओं 4tU के साथ thiolated और आरएनए में संशोधित न्यूक्लिओटाइड को शामिल करने के लिए विकसित करने की अनुमति दी जाती है। समय बिंदुओं और प्रयोगों में सामान्यीकरण की अनुमति देने के लिए एक थायोलेटेड एस पोम्बे स्पाइक जोड़ा जा सकता है। 4tU की नाड़ी संयुक्त राष्ट्र-thiolated uridine का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है. लेबलिंग या तो लगातार 4tU इसके अलावा से या विकास की स्थिति के लिए एक परिवर्तन से किया जा सकता है, संस्कृति विभाजन और 4tU विकास की स्थिति में परिवर्तन से बढ़ते समय संस्कृतियों के लिए जोड़ा है, लेकिन केवल एक संक्षिप्त समय के लिए प्रत्येक लेबलिंग. कोशिकाओं एकत्र कर रहे हैं, और आरएनए कोशिकाओं से तैयार, अधिमानतः एक homogenizer और फिनोल आधारित तरीकों का उपयोग कर. आरएनए biotinylated है और फिर biotinylated आरएनए एक आकार बहिष्करण स्तंभ का उपयोग कर unincorporated बायोटिन से शुद्ध. एन.एस.आर.एन.ए. अब स्ट्रेप्टाविडिन मनकों के साथ शुद्धि के लिए तैयार है (खंड 4, चित्र 5)। लाल रंग में संख्या प्रोटोकॉल में चरण संख्या के अनुरूप है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रोटोकॉल अनुभाग 4 का ग्राफ़िकल सारांश. खंड 1 से 3 (चित्र 4) के बाद स्ट्रेप्टाविडिन मोती अवरुद्ध हो जाते हैं और बायोटिनीलेडेड आरएनए नमूना तैयार मोती में जोड़ा जाता है। बायोटिनीलेटिड आरएनए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को बांधता है और संयुक्त राष्ट्र-बायोटिनिनलेटिड आरएनए को हटा दिया जाता है और धोया जाता है। बायोटिनलेटित आरएनए को जेडएमई का उपयोग करके मोतियों से हटा दिया जाता है और आगे के अनुसंधान के लिए तैयार किया जाता है। लाल रंग में संख्या प्रोटोकॉल में चरण संख्या के अनुरूप है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: खमीर कोशिकाओं से एन एस आर ए वसूली में सुधार के साथ और आयातक की अतिरिक्त प्रतियों के बिना 1 और 3 मिनट थायो-लेबलिंग केलिए । ध्यान दें कि Fui1 खमीर के अपने प्रमोटर एक 2 m प्लाज्मिड से व्यक्त की है. इस जीन की जीनोमिक प्रति इन दोनों उपभेदों में विद्यम् में होती है। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2: $-est AID 4U ]-est AID 4U आलेखी प्रोटोकॉल का एनिमेटेड संस्करण। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: 4tU[experiment]template.xltx. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें. 

प्लाज़्मिड नाम आयातक/ मार्कर टिप्पणी
पी4एफई एस सेरेविसे ई Fui1 URA3 Fui1 आयात Uracil और Uridine, यह पल्स के लिए आदर्श बना /
पीएटी2 एस सेरेविसे ई Fui1 एलईयू 2
p4Fui-$PEST एस सेरेविसे ई Fui1 URA3 Fui1 के PEST आकृति निष्क्रिय कर दिया गया है, तो permease अपमानित नहीं है जब वहाँ सेल की जरूरतों के लिए पर्याप्त intracellular uracil है. लेबलिंग प्रयोगों में अच्छी तरह से काम करता है और पल्स /
p4Fur एस सेरेविएसिया फर4 URA3 यूरेसिल परमेज़
येपबी311 एच सैपिएन्स ईएनटी1 एलईयू 2 मिलर एट अल11. इसके अलावा एक एचएसवी थाइमिडीन काइनेज़ जीन शामिल हैं।
(समलाभ न्यूक्लिओसाइड ट्रांसपोर्टर)
सभी प्लाज्मिड 2 डिग्री मीटर आधारित हैं। सभी p4 प्लाज्मिड और पीएटी प्लाज्मिड की पीआरएस16 श्रृंखला पर आधारित हैं। FUI1 और FUR4 अपने स्वयं के, अंतर्जात प्रमोटरों से व्यक्त कर रहे हैं.

तालिका 1: Plasmids इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जाता है.

Discussion

यह लेख अत्यंत तेजी से और विशिष्ट 4tU लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, नवजात की वसूली के लिए, नए संश्लेषित आरएनए एस से cerevisiae के रूप में छोटे रूप में 15 लेबलिंग के बाद, unlabeled आरएनए द्वारा बहुत कम संदूषण के साथ.

उपयोगकर्ता हमेशा ठंड तापमान और DEPC इलाज अभिकर्मकों का उपयोग करके आरएनए की अखंडता को बनाए रखने के लिए ध्यान रखना चाहिए. Streptavidin मनका शुद्धि आम तौर पर विश्वसनीय है; हालांकि, मनका बफ़र को हैंडल करने के लिए कठिन है; यह हौसले से बनाया जाना चाहिए, इसके घटकों के साथ सही क्रम में जोड़ा, और ठंडा या autoclaved नहीं. आम असफलताओं में आरएनए को वर्षा चरणों के बाद अपूर्ण रूप से भंग किया जा रहा है, और इसलिए या तो बायोटिनलेट नहीं किया जा रहा है या अन्यथा प्रसंस्करण चरणों के दौरान खो दिया है। अनुपूरक सामग्री में व्यापक समस्या निवारण सहायता है।

वहाँ कुछ सीमाओं ers4tU में के बारे में पता होना करने के लिए कर रहे हैं। एक पहले से ही उल्लेख किया है कि 4tU खमीर की वृद्धि को धीमा कर देता है (चित्र 1a) अंतर्जात थायोलेट्ड आरएनए9के अलावा, लेबलिंग अवधि के दौरान केवल आरएनए को ही शुद्ध किया जा सकता है। थायोlation समय भर में जीन पर रुके हुए पॉलिमरेज थायोलेटेड ट्रांसक्रिप्ट्स का उत्पादन नहीं करेंगे जिन्हें शुद्ध किया जा सकता है, हालांकि थायोlation के दौरान एक रुका हुआ राज्य में प्रवेश करने या छोड़ने के कारण आंशिक रूप से लेबल किए गए ट्रांसक्रिप्ट्स को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। तनाव है कि खराब टाइप, या तो उत्परिवर्तन या विकास की स्थिति की वजह से, थोड़ा nsRNA का उत्पादन, हालांकि तकनीक यहाँ इस्तेमाल फिर भी अन्य तरीकों की तुलना में nsRNA की वसूली में सुधार होगा. लंबे समय तक और बढ़ी हुई संस्कृति की मात्रा इन उपभेदों और स्थितियों में आवश्यक हो सकती है। ध्यान दें कि यूरेसिल नाइट्रोजन का एक अच्छा स्रोत है और इसलिए नाइट्रोजन भुखमरी से संबंधित अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने से पहले इस विधि का परीक्षण किया जाना चाहिए।

ers4tU प्रोटोकॉल अल्पकालिक आरएनए के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जिनमें से कई इतनी तेजी से अपमानित कर रहे हैं कि वे गिरावट मशीनरी गंभीर बिना पहचान ासाई नहीं जा सकता है. उदाहरणों में क्रिप्टोक अस्थिर प्रतिलिपि (CUTs)4,और समय से पहले समाप्ति या प्रमोटर द्वारा उत्पादित लघु प्रतिलिपि 18 और एक प्रमोटर (PROMPTs)19से एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्शन "अपस्ट्रीम" शामिल हैं। स्थिर आरएनए प्रजातियों के प्रसंस्करण के दौरान उत्पादित मध्यवर्ती भी क्षणिक होते हैं लेकिन उन्हें ers4tU प्रतिलेखन4का उपयोग करके समृद्ध किया जा सकता है . ers4tU प्रोटोकॉल इसलिए अत्यधिक क्षणिक आरएनए प्रजातियों का विश्लेषण किया जा करने की अनुमति में असाधारण है और अन्य तरीकों पर एक बड़ा लाभ है, जो निकट शारीरिक स्थितियों के तहत कब्जा कर लिया. इस तकनीक का उपयोग आरएनए पॉलिमरेज म्यूटेंटों में प्रतिलेखन और डाउनस्ट्रीम आरएनए प्रसंस्करण गतिज का अध्ययन करने के लिए किया गया है जो सामान्य20की तुलना में अधिक या धीमी गति से लंबा होता है .

Thiolation भी आरएनए-सेक और SLAM-सेक21के साथ संगत है, सभी आरएनए एक बहुत ही कम समय खिड़की के भीतर उत्पादित उत्तम विस्तार में विशेषता होने की अनुमति.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को जेबी [104648] को वेलकम फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। सेल जीव विज्ञान के लिए वेलकम सेंटर में काम वेलकम कोर फंडिंग [092076] द्वारा समर्थित है। लेखक ों को उनकी मदद के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करते हैं: बेला Maudlin, Emanuela सैनी, सुज़ाना डी लुकास-Arias और शाइनी जॉर्ज. लेखक भी प्लाज्मिड YEpEBI31111के लिए पैट्रिक Cramer धन्यवाद देना चाहते हैं .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
4-Thiouracil (Ers4tU) के साथ Vivo में आरएनए की अत्यंत तेजी से और विशिष्ट मेटाबोलिक लेबलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter