Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.

Abstract

Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5' непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.

Introduction

Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 'непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез частичных постсинаптических белков3,4,5,6,7.

Динамический вариант с CGG повторить размер йgt;200 описывается как полная мутация, которая вызывает аномальные гиперметилирования и последующего транскрипционного глушить FMR1 промоутер8. В результате отсутствие или отсутствие белка FMRP нарушает нормальное развитие нейронов и вызывает FXS9, характеризуется различными клиническими симптомами, в том числе умеренной до тяжелой умственной неполноценности, задержки развития, гиперактивного поведения, плохие контакты и аутичные проявления10,11,12. Презентация у женщин FXS пациентов, как правило, мягче, чем у мужчин. Размер повтора CGG в диапазоне от 55 до 200 и 45 до 54 классифицируются как премутационный и промежуточный статус, соответственно. Из-за высокой степени нестабильности, CGG повторить размер в премутации или промежуточный аллель предположительно расширяется при передаче от родителей к потомству13,14. Таким образом, носители с аллелями премутации подвергаются высокому риску иметь детей, пострадавших от FXS из-за повторного расширения, а в некоторых случаях, промежуточные аллели могут расширить их размер повторения до полного диапазона мутации в течение двух поколений15, 16. Кроме того, мужчины с премутацией также передать повышенный риск развития позднего начала FX-TAS17,18,19, в то время как премутации женщины предрасположены как fx-TAS и FX-POI20, 21,22. Недавно было сообщено, что расстройства аутистического спектра с задержкой развития и проблемы в социальном поведении представлены у детей с перестановкой FMR1 аллелей23,24.

Для определения точного cGG повторить размер имеет большое значение для классификации и прогнозирования FXS и хрупкие X-ассоциированных расстройств25,26. Исторически сложилось так, что CGG повторить регион-специфических полимеразы цепной реакции (PCR) с размером фрагмента плюс анализ южной подевой были золотым стандартом для молекулярного профилирования FMR1 CGG повторить27. Тем не менее, традиционные специфические ПЦР менее чувствительны к большим премутации с более чем 100 до 130 повторов и не способен к усилению полной мутации27,28. Кроме того, капиллярный электрофорез на традиционном генетическом анализаторе для повторного калибровки не обнаруживает продукты ПЦР FMR1 с более чем 200 cGG повторами. Анализ южной подётой поля позволяет дифференизировать более широкий диапазон повторяющихся размеров, от нормальных до полных мутаций повторяющихся чисел, и широко используется для подтверждения полных мутаций (у мужчин) и дифференциации гетерозиготных аллелей с полной мутацией от по-видимому гомозиготные аллели с нормальными размерами повтора (у женщин). Однако резолюция для количественной оценки повторов ограничена. Что еще более важно, эта пошаговая стратегия тестирования является трудоемкой, трудоемкой и неэффективной с точки зрения затрат.

Здесь мы представляем точный и надежный метод на основе ПЦР для количественной оценки CGG повторов FMR1. Первым шагом этого теста является pcR усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект. Продукты ПЦР очищаются, а размер фрагментов выполняется на микрофлюидном инструменте электрофорасиса капилляров, а последующая интерпретация количества CGG повторяется с помощью программного обеспечения анализа, ссылаясь на стандарты с известными повторами, основанными на обоснование того, что длина фрагмента ПЦР прямо пропорциональна количеству повторов CGG. Система ПЦР включает в себя реагенты, которые облегчают усиление высоко богатой ГК области тринуклеотида. Этот ПЦР-ассес воспроизводим и способен идентифицировать все диапазоны CGG повторов промоутеров FMR1. Это экономически эффективный метод, который может найти широкое применение в молекулярной диагностики и скрининга FXS и хрупких X связанных расстройств с меньшим оборотом вокруг времени и инвестиций в оборудование и, таким образом, могут быть использованы в более широком спектре клинических Лаборатории.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этические утверждения были предоставлены Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (Справочный номер: 2013.055)

1. Усиление ПЦР

  1. Перед началом, удалить ПЦР буферсмесь, образец разбавитель и образцы ДНК (как тест и ссылка ДНК) (см. таблицу материалов) из -20 qC морозильник и держать их при комнатной температуре в течение 20-30 минут, чтобы убедиться, что все реагенты и ДНК полностью разморожены. Вихрь и кратко спина вниз перед использованием.
  2. Измерьте концентрацию образцов ДНК с помощью спектрофотометра (см. Таблицу Материалов). Концентрация ДНК должна быть 25 нг/Л; разбавить образец разбавитель до соответствующей концентрации, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна быть извлечена и очищена для удаления интерферирующих веществ, таких как белки и высокая концентрация соли. Недеградированная, высококачественная ДНК должна использоваться для последующего усиления и анализа ПЦР (A260/A280: 1.8-2.0 и A260/A230:
  3. Этикетка скважины пЦР пластины или 0,2 мл ПЦР труб для выявления ссылки и испытания образцов ДНК.
  4. Рассчитайте количество реакций ПЦР, необходимых для тестовых образцов, 2 эталонных образцов и отрицательного контрольного образца. Подготовьте PCR Master Mix, добавив 15 qL буферной смеси ПЦР, 2,6 л разбавителя образцов и 0,4 л полимеразы для каждой реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль с использованием разбавитель образец имеет важное значение для мониторинга производительности ПЦР. Подготовка PCR мастер смесь при комнатной температуре, не пипетка на льду. Буферная смесь ПЦР вязкая. Смешайте трубку, а затем кратко спина вниз до использования.
  5. Vortex МАСТЕР-микс ПЦР от шага 1,4 на 10-20 с и спина вниз. Медленно распределяйте 18 л смеси в каждую скважину или трубку.
  6. Вихрь и спина вниз образцы ДНК. Пипетка 2 зл и л каждой ДНК в соответствующую скважину или трубку для окончательного объема ПЦР 20 ЗЛ. Mix путем пипетки вверх и вниз 5 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ДНК на реакцию должно быть 50-100 нг. Количество ДНК, превышающее 150 нг на 20 ПЦР, может привести к плохому усилению больших повторных аллелей. Для низкоконцентрированных ДНК количество разбавительа образцов в мастер-миксе ПЦР может быть заменено раствором ДНК.
  7. Запечатайте тарелку клеевым уплотнителем пластины или трубчатыми колпачками.
  8. Поместите герметичную пластину ПЦР или трубки в тепловой циклс с нагретой крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, затем 25 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию на 35 с, аннулирование при 59 градусах по Цельсию на 35 с и расширение на 72 градуса х 4 мин; заключительный шаг при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Держите продукты ПЦР при 4 градусах по Цельсию в циклере до удаления для дальнейшей обработки.
  9. После усиления ПЦР очистите и проанализируйте продукты немедленно, или храните на уровне от 2 до 8 градусов Цельсия на ночь. Кроме того, продукт может храниться до 30 дней при от -30 до -16 градусов по Цельсию.

2. Очистка продуктов ПЦР

  1. Разогреть инкубатор шейкер до 65 градусов по Цельсию.
  2. Для каждой реакции ПЦР добавьте 80 кЛ буфера 1x TE (см. таблицу материалов)к 20 Зл каждого продукта ПЦР из раздела 1.
  3. Перенесите образец смеси в чистую пластину ПЦР (см. Таблицу Материалов)с помощью многоканального пипетка.
  4. Держите пластину непокрытой и поместите его в шейкер инкубатора, и инкубировать при 65 градусов по Цельсию, вторите при 1200 об/мин в течение 10 минут.
  5. После инкубации установите вакуумный инструмент на 250 мбар (или 25 кПа, 188 мм рт. ст., 7,4 в Hg) и аспирируй раствор через фильтр в течение 15 мин. Уэллс не должно иметь жидкости.
  6. Охладите вшейку инкубатора до 25 градусов по Цельсию.
  7. После первого стремления выключите вакуум и добавьте 50 кВ 1x TE буфера к каждой скважине. Не смешивайте. Приготовьте раствор в течение 10 минут, используя вакуумные настройки в шаге 2.5.
  8. Высушите дно фильтра пластины, нажав его твердо на стопку бумажных полотенец.
  9. Добавьте 20 кЛ 1x TE буфера в нижний центр каждого колодца. Поместите тарелку в шейкер инкубатора и инкубировать при 25 градусах Цельсия, встряхивая при 1200 об/мин в течение 5 минут.
  10. После инкубации, передача йgt;15 qL каждой очищенной ПЦР ДНК от шага 2.9 к свежей 96-хорошо ПЦР пластины. Очищенная ДНК может быть проанализирована непосредственно, или же может храниться при -30 до -16 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо.

3. Размер фрагмента продуктов ПЦР

  1. Перед началом, позволяют ДНК красителя концентрат, матрицы геля ДНК, ДНК маркер, ДНК лестницы и очищенных образцов ДНК от шага 2 до уравновешивают до комнатной температуры в течение 30 минут.
  2. Настроили грунтовочная станция.
    1. Замените шприц (см. таблицу материалов)при использовании новой партии реагентов.
    2. Отрегулируйте базовую пластину и отпустите рычаг зажима шприца и сдвиньте его до верхнего положения.
  3. Начните программное обеспечение для размеров (см. Таблица материалов)и подготовьте смесь гель-красителя.
  4. Vortex красителя концентрат на 10 с и спина вниз. Добавьте 25 л красителя в флакон гелевой матрицы. Vortex смешанное решение хорошо и спина вниз.
    1. Перенесите смесь геля-красителя на спин-фильтр. Поместите спин-фильтр в микроцентрифуге и вращайтесь в течение 10 минут при комнатной температуре при температуре 1500 х г и 20%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор краситель от света и храните при 4 градусах Цельсия после использования. Смесь гель-красителя может быть использована для около 15 фишек после того, как подготовлены. Разрешить гель-краситель смесь уравновесить до комнатной температуры в течение 30 минут каждый раз перед использованием.
  5. Загрузите смесь гель-красителя.
    1. Вставьте новый чип ДНК на грунтовке станции. Добавьте 9 л гель-красителя в хорошо отмеченный "G". Пожалуйста, убедитесь, что поршень расположен на отметке 1 мл, а затем закройте грунтовую станцию.
    2. Нажмите шприц поршень вниз, пока он не удерживается клип. Подождите ровно 30 с, а затем выпустить клип. Подождите 5 с, а затем медленно потяните поршень обратно в положение 1 мл.
    3. Откройте грунтовочная станцию и добавьте 9 л гель-красителя в колодцы, отмеченные "G".
  6. Добавьте 5 зл маркера в колодец, отмеченный символом лестницы, а также добавьте 5 зл маркера в каждую из 12 образецов скважин. Не оставляйте колодцы пустыми.
  7. Добавьте 1 зл днк-лестницы в колодец, отмеченный символом лестницы. Добавьте 1 зЛ продукта ПЦР (использованные скважины) из ступени 3,1 или 1 л ультрачистой воды (неиспользованных скважин) в каждую из 12 образов скважин. Поместите чип горизонтально в адаптер вихревого миксера и вихря в течение 1 мин при указанной настройке (2400 об/мин).
  8. Вставьте чип в инструмент биоанализатора и запустите чип в инструменте в течение 5 минут.
  9. После завершения ассеа немедленно удалите использованный чип с инструмента.
  10. Медленно добавьте 350 л деионизированной воды в одну из колодцев электродного очистителя. Откройте крышку биоанализатора и поместите в него очиститель электрода. Закройте крышку и инкубировать около 10 с. Откройте крышку и удалите электрод чище. Подождите еще 10 с, чтобы вода на электродах испарилась, а затем закрыла крышку.

4. Проанализируйте результаты размеров фрагмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонные образцы должны быть усилены и проанализированы тем же тепловым велосипедистом и биоанализатором в одной партии с неизвестными образцами.

  1. После завершения запуска биоанализа экспортируйте пиковые данные с каждого запуска в виде файла таблицы .csv для последующего анализа.
  2. Запустите программное обеспечение для анализа и откройте экспортируемый файл пиковой таблицы .csv с шага 4.1.
  3. Через вкладку меню КК просмотрите линию регрессии, установленную на четыре точки (показанные как синие бриллианты на участке) из двух эталонных образцов. Значение R2 регрессионной линии должно быть 0,98 (типичные значения превышают 0,999).
  4. Через вкладку меню «Результаты» проверьте размер повтора каждого образца, длина фрагмента которого (s) автоматически накладывается на стандартную кривую линейной регрессии, полученную из эталонных образцов. Программное обеспечение также обеспечивает классификацию каждого образца в соответствии с различными руководящими принципами.
  5. Через вкладку меню «Экспорт» вывемите отчет о результатах по каждому образцу с повторными числами и диагностической классификацией, а также резюме информации о выборке и отчета к КК для каждого запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа позволяет использовать пользовательские руководящие принципы классификации, такие как Американский колледж медицинской генетики (ACMG) или Клинической молекулярной генетики общества / Европейского общества генетики человека (CMGS/ESHG) руководящие принципы, а также предопределенная классификация Критерии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты размеров женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полная женская эталонная выборка мутации (NA20239, повторные размеры 20 и 200) показаны на рисунке 1A и Рисунке 1B, соответственно. Как правило, в профиль размера фрагмента включены два маркера пиков (нижний маркер 50 базовых пар «bp» и верхний 10,380 б.п.). Существует, как правило, грунтовый комплекс пик с размером почти 95 bp. Через эталонный образец может быть построена стандартная кривая линейной регрессии с четырьмя точками, как это представлено на рисунке 1С.

Особенности репрезентативного размера клинических нормальных, промежуточных, премутационных и полных образцов мутаций показаны на рисунке 2A-D. В частности, мозаика полные мутации с двумя расширенными пиками фрагментов и одним нормальным пиком представлены на рисунке 2E. В некоторых женских случаях, только один пик отображается в микрофлюидных результатов электрофорез, как показано на рисунке 2F. Это можно объяснить представлением нормальных гомозиготных аллелей (с теми же номерами CGG в двух аллелях) в этих случаях или неспособностью дифференциировать гетерозиготные аллели, которые имеют повторные различия числа в четыре или менее29. Тем не менее, эти однопиковые результаты можно классифицировать как нормальные, потому что было подтверждено, что конвейер на основе ПЦР обеспечивает надежное усиление и обнаружение полной мутации или аллелей премутации, что сводит к минимуму возможность ложного негатива в этой ситуации. Одним из видов неоптимальной ситуации является базовая предвзятость, как показано на рисунке 2G,которая может привести к неоднозначным или неистолитытельным результатам в некоторых случаях. Такое состояние, как предполагается, вызвано проблемой с инструментом. Измеренные размеры фрагментов неизвестных образцов построены на основе стандартной кривой линейной регрессии, полученной из эталонных образцов, чтобы автоматически вычислить размеры повторов с помощью программного обеспечения анализа, как показано на рисунке 2H. Размеры фрагментов менее 200 повторов интерполируются в стандартную кривую линейной регрессии, в то время как более крупные размеры аллелей полной мутации измеряются путем экстраполяции по той же стандартной линии. Программное обеспечение также отображает классификацию каждого образца в соответствии с различными руководящими принципами.

Figure 1
Рисунок 1: Результаты размеров женских эталонных образцов и соответствующая кривая линейной регрессии. (A, B) показывают размеры женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полную женскую мутационную выборку (NA20239, повторные размеры 20 и 200), соответственно. Два маркера (нижний маркер, 50 bp и верхний маркер 10380 bp) включены в результат электрофореза для каждого образца. Пик с размером почти 95 bp указывает на грунтовые комплексы. Черные стрелки указывают на пиковый размер грунтового комплекса, а синие стрелки представляют длину фрагмента эталонного образца. (C) Линейная стандартная кривая регрессии с четырьмя точками (голубые алмазы) из двух эталонных образцов построена в программном обеспечении для анализа. Горизонтальные и вертикальные оси показывают расчетные числа повторений CGG и измеренную длину фрагмента в микрофлюидном электрофорезе. Значение R2 регрессии составило 0,99967. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты клинических образцов с разным размером повтора CGG. (A-E) показать особенности репрезентативного размера биоанализатором в порядке нормального (с длиной фрагмента 328 bp и 353 bp, соответствующими повторяющиеся числам 28 и 36), промежуточные (с длиной фрагмента 335 bp и 390 bp, что соответствует повторить номера 30 и 49), премутации (с длиной фрагмента 332 bp и 439 bp, соответствующие повторным номерам 29 и 65), полная мутация (с длиной фрагмента 337 bp и 1911bp, соответствующие повторяющиеся числа 31 и 545) и мозаика полной мутации (с длиной фрагмента 349 bp, 1201 bp и 2688 bp, что соответствует повторным числам 33, 294 и 751) образцов. (F) представляет собой однопиковый микрофлюидный результат электрофорез (с длиной фрагмента 334 bp, что соответствует повторному числу 30) самки, которая, вероятно, имеет гомозиготные аллели (с теми же номерами CGG повторяющихся в двух аллелях) или heterozygous аллелей (с CGG повторить число различия в четыре или менее). (G) показывает один тип неоптимальной ситуации, который является базовым смещением. Черные стрелки указывают на пиковый размер грунтового комплекса, а красные стрелки представляют длину фрагмента образца. (H) отображает основной интерфейс результата программного обеспечения анализа. Измеренные размеры фрагментов неизвестных образцов построены на линионной стандартной кривой регрессии для автоматического расчета повторяющихся размеров. Нормальный аллель мозаичной полной мутации женский образец показано в (E) отображается на стандартную кривую в нижнем левом углу области оси координат (построен в зеленом), и больше полной мутации аллелей (нарисованы красным) экстраполируется за пределами четыре стандартные точки (голубые бриллианты на кривой). Табличных секций в нижней половине фигуры представлены размеры фрагментов и соответствующая диагностическая классификация в соответствии с выбранными границами руководства ACMG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-1000 женщин нести премутации, и эта частота составляет 1 в 250-1600 у мужчин26,31,32,33. Так как риск повторения CGG до полных мутаций при передаче аллелей премутации потомству резко повышается, например, с 4%, когда размер материнского повторения составляет 55-59 до 98%, когда размер 100-20014, определение CGG повторный размер на более широком диапазоне может облегчить диагностику FXS и скрининг автором премутации носителей для их репродуктивного планирования. Метод на основе ПЦР, представленный здесь, является точным, быстрым и надежным для усиления повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 и количественной оценки всего спектра CGG повторяющихся чисел на микрофлюидных приборах электрофореза, и, таким образом, может повысить его широкое применение в молекулярной диагностики и скрининга FXS и хрупких X связанных расстройств с меньшим оборотом вокруг времени и инвестиций в оборудование. Инструмент биоанализатора можно уверенно использовать в низких и умеренных настройках теста пропускной всей проходицы для измерения размера повтора. Оборудование гораздо меньше, дешевле и проще в обслуживании, чем другие инструменты капиллярного электрофораса, такие как аpillarлярные анализаторы капилляров ABI. Для скрининга большого объема система MultiDX, содержащая до 384 образцов модели, обеспечивает большую гибкость и пропускную выливку для испытаний.

Анализ включает в себя четыре основных шага: ПЦР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 (настройка ПЦР и усиление ПЦР занимает почти 3,5 ч), очистка продуктов ПЦР (занимает почти 1 ч), размер фрагмента на микрофлюидной инструмент капиллярного электрофорасиса (занимает почти 1 ч) и интерпретация количества CGG повторяется с помощью программного обеспечения анализа, выводя из эталонных стандартов с известными повторами (занимает почти 0,5 ч). В общей сложности время поворачивания этого асссе составляет примерно 6 ч. Для оптимальной производительности образцы ДНК должны быть очищены, чтобы удалить предположительно интерферирующие вещества, такие как белки и высокие концентрации соли. Кроме того, рекомендуемое количество входной ДНК составляет 50-100 нг на 20 Л ПЦР реакции. Было показано, что количество ДНК, превышающее 150 нг на 20 зЛ системы ПЦР, приводит к плохому усилению больших повторяющихся аллелей. Кроме того, настоятельно рекомендуется установить по крайней мере два эталонных образца с хорошо охарактеризованными размерами повтора в каждом запуске ПЦР для одновременного анализа повторяющихся чисел в качестве контроля качества и последующего автоматизированного размера фрагмента в программном обеспечении анализа 29. Как правило, значение R2 кривой линейной регрессии, полученной из эталонных образцов, должно быть больше 0,98. Кроме того, продукты ПЦР должны быть очищены до микрофлюидного капиллярного электрофорасиса для повышения эффективности обнаружения. Поскольку праймер ПЦР помечен флуоресценцией FAM29,размер фрагментов с соответствующей системой электрофорезов (например, биоанализатор и система MultiDX) может быть непосредственно выполнен без дополнительной маркировки.

Разнообразие методологий для диагностики и изучения FXS и связанных с ними расстройств были всесторонне рассмотрены Брюс E. Хейворд и др., в том числе ДНК-анализы и FMRP белка анализы34. Как и в большинстве случаев молекулярной основой FXS является динамическая мутация характеризуется расширением CGG повторить в области промотора FMRP1 гена, южные blotting и усиливающий основе анализы с помощью геномной ДНК являются наиболее часто используемыми анализы для определение повторного числа. Хорошо известно, что ПЦР-анализы перевешивают южные промотирование в экономической эффективности и минимальной потребности в размере ДНК. Тем не менее, усиление CGG-повторить является основной проблемой, поскольку высокий содержание GC может повлиять на эффективность, и много усилий было сделано для оптимизации системы ПЦР на протяжении34лет . Хрупкий комплект X PCR был оптимизирован для точного усиления всего тринуклеотида CGG, и исследование проверки производительности этого метода на основе ПЦР было ранее сообщено нашей группой29. Аналогичный метод на основе ПЦР был зарегистрирован Mailick Seltzer et al. в 2012 году35, но инструмент ABI 3730xl был использован для определения размера повтора и были идентифицированы только люди с повторным размером менее 200. Это может быть связано с тем, что выбранная ими платформа не смогла обнаружить более крупные повторы с размером повтора выше 200. В отличие от этого, биоанализатор инструмент, который мы используем предлагает более надежный анализ размеров фрагмента, так как он может точно и экономически эффективно обнаружить весь спектр FMR1 CGG повторить включая полные мутации29.

Кроме повторного числа, несколько других факторов, также должны быть установлены для соответствующего диагноза FXS и FXS связанных расстройств, в том числе FMR1 мутации, степень метилирования и мозаикизма34. Состояние метилирования может контролироваться различными методами, такими как включение допищеварения шаги с использованием метилирования чувствительных ограничения фермента или бисульфит модификации асссы34, однако, наш ассе не в состоянии определить метилирование статус 5'UTR промоутера FMR1. Кроме того, риск расширения аллеля FMR1 также зависит от наличия перерывов AGG, которые могут стабилизировать ген во время передачи. ПЦР основе повторных анализов были изменены для обнаружения AGG-прерывания в то время как нестабильность ферментов пищеварения является одним из основных ограничений. Triplet-primed (TP) PCR с помощью гибридного пряточного ПРЦ в CGG повторяется или AGG перерывов является еще одним типом ПЦР-асс, который может обнаружить CGG повторить размер и AGG перерывов одновременно. Тем не менее, генно-специфический метод ПЦР FMR1 не способен определить прерывания AGG, если не будет выполнено секвенирование гена FMR1 после усиления. Недавно Hayward et al. сообщили о методах ПЦР, используемых в их собственной лаборатории для определения всех параметров, необходимых для полной генетической работы или тщательного лабораторного исследования, включая анализы, которые могут обнаружить повторный номер, статус прерывания AGG и метилирование статус36. К сожалению, ни один из них не способен всесторонне определить все эти факторы в актуальном состоянии.

Стоит отметить, что ассеиненей не в состоянии обнаружить удаления или однонуклеотидные варианты в гене FMR1, на который приходится примерно 1% случаев FXS27. Редко, у людей, которые имеют клеточной мозаичности для повторения FMR1, ПЦР может дать ложный отрицательный результат из-за неудачи в обнаружении мозаики для больших премутации и полной мутации аллелей37,38. Было продемонстрировано, что порог этого ПЦР основе анализ мозаики полный образец мутации мужской (341 повторяется) составляет 2,5%, когда пиковый порог детекторустановленного установлен на три флуоресценции единиц выше базовогоуровня 29. Анализ южной подьекрекомендуется в тех случаях, когда указаны мозаичные аллели. Кроме того, что касается платформ электрофорексиса, предыдущее исследование показало, что по сравнению с капиллярными электрофорексио систем (например, aBI 3130XL инструмент), биоанализатор инструмент не способен дифференциации нормального гомозигоуса женские образцы с отдельными пиками фрагмента из женских образцов с гетерозиготными повторяючими размерами, которые имеют повторные различия числа в четыре или менее29. Тем не менее, эти однопиковые образцы можно классифицировать как нормальные, потому что было подтверждено, что этот трубопровод на основе ПЦР обеспечивает надежное усиление и обнаружение полной мутации или аллелей премутации, что сводит к минимуму возможность ложного негатива в этой ситуации. Несмотря на вышеуказанные ограничения, метод может быть использован в качестве трубопровода первого уровня для молекулярной идентификации FXS и хрупких X-связанных заболеваний с экономической эффективностью, надежностью и быстрым временем отчетности, дополненной секвенированием Анализ уровня метилирования геном FMR1 и южным помотным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

Генетика Выпуск 151 Полимераза цепная реакция микрофлюидный капиллярэлектрорез цитозин-гуанин-гуанин повторяет тринуклеотид Хрупкий X умственной отсталости-1 промоутер хрупкий синдром Х полная мутация премутация
Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter