Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

doi: 10.3791/59965 Published: July 20, 2019

Summary

Ce protocole décrit une approche pour produire des hépatosphères à partir de cellules souches pluripotentes humaines à l'aide d'un système de culture défini et de l'auto-assemblage cellulaire. Ce protocole est reproductible dans un certain nombre de lignées cellulaires, rentable et permet la production d'hépatosphères humaines stables pour une application biomédicale.

Abstract

Le développement de sources renouvelables de tissu hépatique est nécessaire pour améliorer la modélisation cellulaire et développer des tissus humains pour la transplantation. Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) représentent des sources prometteuses de sphères hépatiques humaines. Nous avons développé une méthode de différenciation cellulaire sans sérum et définie pour générer des sphères tridimensionnelles du foie humain formées à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Une limitation potentielle de la technologie est la production de sphères denses avec des matériaux morts à l'intérieur. Afin de contourner cela, nous avons utilisé la technologie de micropuits agarose à des densités cellulaires définies pour contrôler la taille des sphères 3D, empêchant la génération de noyaux apoptotiques et/ou nécrotiques.  Notamment, les sphères générées par notre approche présentent la fonction hépatique et le phénotype stable, représentant une ressource précieuse pour la recherche scientifique fondamentale et appliquée. Nous croyons que notre approche pourrait être utilisée comme une technologie de plate-forme pour développer d'autres tissus pour modéliser et traiter les maladies humaines et à l'avenir peut permettre la génération de tissus humains avec une architecture tissulaire complexe.

Introduction

La capacité des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) à s'auto-renouveler, tout en conservant la pluripotence, offre la possibilité de produire des types de cellules humaines et des tissus sur demande. les hPSC ont été efficacement différenciés en cellules hépatocytes (HLC) utilisant les systèmes de culture adhérents bidimensionnels (2D)1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Ces systèmes ont été utilisés pour modéliser avec succès les maladies monogéniques, le cycle de vie du virus, les lésions hépatiques induites par les médicaments (DILI), l'exposition fœtale aux toxines et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Cependant, ces modèles possèdent certains inconvénients, qui limitent leur utilisation de routine. Ceux-ci incluent l'expression foetale de marqueur, le phénotype instable et l'architecture pauvre de tissu16,17,18,19, qui pourrait également limiter l'extrapolation à la fonction d'organe in vivo.

Pour surmonter ces limitations, des plates-formes de différenciation tridimensionnelles (3D) ont été développées pour imiter l'architecture des tissus in vivo. Bien qu'elles soient habilitantes, ces approches reposent sur l'utilisation de produits et de matrices d'origine animale pour entraîner la genèse des tissus20,21,22, limitant l'échelle et l'application généralisée.

Ici, nous détaillons les procédures pour générer de grandes quantités d'hépatosphères 3D à partir de hPSCs utilisant des matériaux définis et l'auto-assemblage cellulaire. Notamment, le tissu généré par notre procédure reste fonctionnel pendant plus d'un an dans la culture cellulaire et est capable de soutenir la fonction hépatique in vivo23.

En résumé, notre approche de différenciation définie permet la génération d'hépatosphères humaines stables à partir à la fois de cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Nous croyons que la procédure décrite représente une percée significative dans la génération d'hépatosphères 3D pour la recherche scientifique fondamentale et appliquée.

Protocol

1. Préparation des moules à microplaques Agarose

REMARQUE: Les médias utilisés pour ces expériences doivent être stériles et à température ambiante (RT) pour la culture cellulaire.

  1. Préparer 2% moules agarose.
    1. Dissoudre 2 g d'agarose à basse température de fonte en 100 ml d'eau distillée stérilisée. Chauffer soigneusement au micro-ondes avec des secousses d'intervalle pour dissoudre complètement.
    2. Ajouter 520 l'agarose fondue dans un moule de format de 256 puits et laisser se solidifier.
    3. Transférer chaque microplaque d'agarose dans un seul puits d'une assiette de 12 puits.
    4. Ajoutez 1,5 ml de saline tamponnée de phosphate (DPBS) de 1x Dulbecco avec Ca2/Mg2 à chaque puits et retirez les bulles d'air des micropuits en faisant doucement monter et descendre plusieurs fois à l'aide d'une pointe de pipette P1000. Ceci est effectué pour assurer l'ensemencement cellulaire uniforme.
      REMARQUE: Les microplaques d'Agarose peuvent être stockées jusqu'à 6 mois à 4 oC dans 1x DPBS.

2. Ensemencement de cellules souches pluripotentes humaines dans des plaques de micropuits d'Agarose

  1. Préparation de la suspension cellulaire
    1. Aspirer le médium d'une culture indifférenciée de hPSCs comme précédemment décrit8.
      REMARQUE: hPSCs sont cultivés sur LN-521 en mTeSR1 avec le milieu changé tous les 24 h, et passages régulièrement une fois que les cellules atteignent 75% à 85% de la confluence comme précédemment décrit8.
    2. Rincer les cellules avec 5 ml de RT 1x DPBS sans Ca2/Mg2 et enlever le tampon.
    3. Ajouter 5 ml de réagent de dissociation cellulaire 1x (tableaudes matériaux)aux cellules et permettre la dissociation cellulaire en couvant des cellules à 37 oC pendant 6-8 min.
      REMARQUE: Pour arrêter la réaction, examinez le détachement cellulaire au microscope. Les cellules doivent être partiellement détachées de la plaque. Prolonger l'incubation pendant 1-2 min supplémentaire si un temps plus long est nécessaire.
    4. Arrêtez la réaction en enlevant le réactif de dissociation cellulaire et ajoutez 5 mL de milieu mTeSR1 frais complété par 10 M Rho-associé kinase (ROCK) inhibiteur Y27632 aux cellules. Dissocier les cellules en faisant monter et descendre plusieurs fois à l'aide d'une pointe de pipette P1000.
    5. Comptez les cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre et d'une exclusion de coloration bleu trypan. Après cela, préparer la suspension cellulaire à la concentration requise.
    6. Calculez le nombre total de cellules nécessaires. Pour la différenciation de l'hépatosphère 3D, les graines 3,84 x 105 cellules par microplaque d'agarose pour générer des sphéroïdes de 100 à 150 m de diamètre.
    7. Transférer le nombre désiré de cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml ou 50 ml et centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min à RT pour granuler les cellules.
    8. Aspirer et jeter les cellules supernatant et resuspendre dans le milieu mTeSR1 plus 10 'M inhibiteur ROCK Y27632. Diluer la pastille cellulaire dans le volume approprié de milieu à une concentration finale de 2,1 x 106 cellules/mL.
  2. Ensemencement des cellules aux microplaques d'agarose préparées
    REMARQUE :
    Si vous utilisez des microplaques d'agarose entreposées au réfrigérateur, placez-les dans l'incubateur cellulaire à 37 oC pendant au moins une heure avant d'être utilisés et aspirez le 1x DPBS du puits avant l'ensemencement cellulaire.
    1. Ajouter 190 l de la suspension cellulaire dans le micropuits d'agarose.
    2. Après l'ensemencement, remettre les plaques à l'incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 h pour permettre aux cellules de se déposer.
    3. Après 2 h, ajouter 1 ml de milieu mTeSR1 frais et chaud complété par un inhibiteur de 10 M ROCK Y27632 à chaque puits.
    4. Remettre les plaques à l'incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h et examiner la formation des sphères le lendemain pour permettre aux cellules de se fixer.

3. Différencier les hPSC des hépatosphères 3D sur les micropuits d'Agarose

  1. Préparation de puits enduits poly 2-hydroxyethyl (poly-HEMA)
    1. Dissoudre 2 g de poly-HEMA dans 100 ml d'éthanol à 95%. Remuer la solution pendant la nuit à l'aide d'une plaque chauffante à 55 oC. Ajouter 250 l de solution poly-HEMA par puits d'une assiette de 24 puits et sécher toute la nuit à 60 oC à l'aide d'un four.
  2. Préparation du milieu de différenciation
    1. Préparer une solution de stock 1000x de l'activine humaine A en dissolvant l'activine humaine Une protéine lyophilisée dans l'albumine stérile de sérum bovin 0.2% (BSA)/DPBS à une concentration finale de 100 'g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    2. Préparer une solution de stock 1000x de Wnt3a en dissolvant la souris Wnt3a protéine lyophilisée en stérile 0,2% BSA/DPBS à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:200.
    3. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance humain d'hépatocyte (HGF) en dissolvant la protéine lyophilisée humaine de HGF dans le BSA/DPBS stérile de 0.2% à une concentration finale de 10 'g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    4. Préparer une solution d'actions 1 000x d'oncostatin M (OSM) en dissolvant l'OSM en BSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 20 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    5. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance épithéliale (EGF) en dissolvant la protéine lyophilisée en bSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    6. Préparer une solution de 1 000 x stock du facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF) en dissolvant la protéine lyophilisée en BSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    7. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) en dissolvant la protéine lyophilisée dans 0.2% BSA/DPBS à une concentration finale de 10 'g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000.
    8. Faire le milieu de différenciation d'endoderm composé de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) milieu basal complété par 2% de supplément B27 (50x, sans insuline), et 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales: 100 UI/mL et 100 g/mL, respectivement). Sauf indication, à chaque changement moyen, compléter le volume requis avec Wnt3a et activinE A à une concentration finale de 50 ng/mL et 100 ng/mL, respectivement.
      REMARQUE: Conserver à 4 oC et l'utiliser dans les deux semaines.
    9. Faire le milieu de différenciation d'hépatoblaste se composant du milieu modifié d'aigle de Knockout dulbecco (KO-DMEM) avec le remplacement de sérum de KO de 20% (KOSR) et complété avec 0.5% d'un supplément alternatif à L-glutamine, 1% acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol, 1 % de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et 1 % de pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 g/mL, respectivement). Filtrer sous vide.
      REMARQUE: Conserver à 4 oC et l'utiliser dans les deux semaines.
    10. Faire le milieu de maturation d'hépatocyte se composant du milieu d'hépatocyte complété avec 1% d'un supplément alternatif à L-glutamine, 10 -M hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium sel (HCC), 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 IU/mL et 100 g/mL, respectivement). Pour chaque changement moyen, compléter le volume requis avec OSM et HGF (concentrations finales à 20 ng/mL et 10 ng/mL, respectivement).
      REMARQUE: Conserver le bouillon à 4 oC et l'utiliser dans les deux semaines.
    11. Faire le milieu d'entretien d'hépatocyte se composant du milieu d'E de William complété avec le remplacement de sérum de KO de 10%, se composant de 1% d'un supplément alternatif à l'alglutamine, 1% de pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 'g/mL, respectivement). Pour chaque changement moyen, compléter le volume requis avec HGF, EGF, bFGF et VEGF (concentration finale de chaque facteur de croissance à 10 ng/mL).
      REMARQUE: Conserver le bouillon à 4 oC et l'utiliser dans les deux semaines.
  3. Vérifier la formation de l'hépatosphère 24 h après l'ensemencement et initier la différenciation des hépatocytes. Retirez soigneusement le milieu mTeSR1 et remplacez-le par 1 mL de milieu frais de différenciation endoderm complété par 100 ng/mL activin A et 50 ng/mL Wnt3a.
  4. Changer le milieu d'amorçage d'endoderm complété tous les 24 h pendant 3 jours pour des hESCs. Lorsque vous travaillez avec des hiPSC, prolongez cette étape pendant 2 jours supplémentaires en complétant les médias avec l'activine A (100ng/mL) seule.
  5. Après l'induction définitive d'endoderm, passez au milieu de différenciation d'hépatoblaste pour la spécification d'hépatoblaste pendant 5 jours remplaçant le milieu tous les 2 jours et exécutez le dernier changement le dernier jour de la spécification d'hépatoblast.
  6. Transférer les hépatosphères dans les puits enduits poly-HEMA.
    1. Laver les cellules une fois avec le milieu de maturation d'hépatocyte sans suppléments après avoir enlevé le milieu de KSR/DMSO et ajouter 1 mL de milieu de maturation d'hépatocyte complété avec 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM.
    2. À l'aide d'une pipette P1000, soulever les hépatosphères de la microplaque de l'agarose en faisant monter et descendre la solution plusieurs fois.
    3. Transférer le milieu contenant les hépatosphères dans un puits poly-HEMA enduit.
    4. Laver la microplaque d'agarose à l'aide de 1 ml de milieu de maturation des hépatocytes complété avec 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM et transférer le milieu au poly-HEMA bien enduit.
    5. Répétez l'étape 3.6.4 autant de fois que possible afin de transférer toutes les hépatosphères de la microplaque agarose.
      REMARQUE: Il est essentiel de soigneusement pipette de haut en bas de la solution contenant les hépatosphères pour éviter de les endommager.
  7. Aspirez soigneusement l'excès de milieu sans enlever les hépatosphères à l'aide d'une pipette P100 jusqu'à ce que 1 ml de milieu contenant les hépatosphères reste dans le poly-HEMA bien enduit.
  8. Changer le milieu tous les 48 h pendant 12 jours.
  9. Au jour 20 lorsque vous travaillez avec des HESC ou le jour 22 si vous travaillez avec des hiPSC, passez le milieu au milieu d'entretien d'hépatocyte.
    1. Enlever le milieu de maturation d'hépatocyte et laver des cellules une fois avec le milieu d'entretien d'hépatocyte sans les suppléments. Ajouter 1 mL de milieu d'entretien d'hépatocyte complété avec 10 ng/mL de HGF, EGF, FGF et VEGF.
  10. Changer le milieu pour le milieu frais d'entretien d'hépatocyte tous les 48 h.

4. Analyse fonctionnelle des hépatosphères 3D cultivées à long terme

  1. Passer au milieu de maturation des hépatocytes complété par 10 M HCC, L-glutamine, 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 'g/mL, respectivement) et 10 ng/mL HGF 48 h avant d'effectuer l'analyse fonctionnelle.
  2. Analyser la fonction métabolique des hépatocytes à l'aide de tests Cytochrome (CYP) P450.
    1. Remplacer le milieu par un milieu de maturation d'hépatocyte frais complété par un substrat d'éther de luciferin-6'-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) pour détecter l'activité basale de CYP3A ou un substrat de 100 ether luciferin-méthyle (luciferin-ME) pour détecter CYP1A2 l'activité basale (nombre de répliques 3). Utilisez les médias de culture tissulaire comme un contrôle négatif.
      REMARQUE: Afin d'éviter la réactivité croisée, il est recommandé de ne pas utiliser les mêmes puits contenant des hépatosphères 3D pour tester différentes activités CYP P450, mais de les effectuer dans des puits individuels.
    2. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC.
    3. Recueillir les supernatants à l'aide d'une pointe de pipette P100 et effectuer le résultat selon les instructions du fabricant.
    4. Mesurer les niveaux relatifs d'activité basale et normaliser à la protéine mg selon l'analyse de l'acide bicinchoninique (BCA).
  3. Testez la production de protéines sériques à l'aide d'analyses immunosorbent liées aux enzymes (ELISA).
    1. Remplacer le milieu par 1 ml de milieu de maturation des hépatocytes frais complété par 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM (nombre de répliques 3). Utilisez les médias de culture tissulaire comme un contrôle négatif.
    2. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC.
    3. Recueillir le supernatant à l'aide d'une pointe de pipette P100 et mesurer les niveaux relatifs de production de protéines sériques selon les instructions du fabricant.
    4. Normaliser à la protéine par mg tel que déterminé par l'assay BCA.

5. Immunocytochimie

  1. Préparation de sections de paraffine contenant des hépatosphères.
    1. Laver les hépatosphères trois fois avec 1x DPBS.
    2. Fixer les hépatosphères avec du méthanol glacé pendant 30 min.
    3. Laver trois fois avec 1x DPBS.
    4. Intégrez les hépatosphères dans 300 L d'une solution tempérée de 2% d'agarose dissoute en H2O à l'aide d'un puits vide d'une plaque de 24 puits comme moule et laissez-le se solidifier pendant 30 min.
    5. Intégrer l'agarose contenant des hépatosphères dans la paraffine.
    6. Sectiondure le bloc de paraffine contenant des hépatosphères fixes dans des sections de 4 m d'épaisseur à l'aide d'un microtome.
  2. Décirage et réhydratation des sections.
    REMARQUE :
    Utilisez des solutions nouvelles chaque fois que c'est possible. N'utilisez pas de solutions qui sont sur le creux de coloration depuis plus d'une semaine.
    1. Placer les sections dans un toboggan.
    2. Immerger le toboggan contenant des sections dans une auge de coloration contenant 300 ml de xylène pendant 5 min.
    3. Répétez l'étape 5.2.2.
    4. Plongez dans l'éthanol absolu pendant 20 s.
    5. Immerger dans 95 % d'éthanol pendant 20 s.
    6. Immerger dans 90% d'éthanol pendant 20 s.
    7. Immerger dans 80% d'éthanol pendant 20 s.
    8. Immerger dans 70% d'éthanol pendant 20 s.
    9. Réhydrater les sections avec de l'eau pendant 5 min.
      REMARQUE: Maintenez les glissières dans le même support de glissière et déplacez-la d'un creux de coloration à l'autre. Le volume utilisé (généralement 300 ml) dépend de la taille de l'abreuvoir de coloration.
  3. Récupération d'antigène des sections de paraffine contenant des hépatosphères.
    1. Chauffer les sections désépilées et réhydratées dans la solution tampon 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 pendant 15 min au micro-ondes à 800 W.
    2. Refroidir les échantillons en les immergeant dans l'eau du robinet pendant 5 min.
  4. Immunomarquage.
    1. Incuber les diapositives avec solution de blocage faite de PBS avec 0,1% polysorbate 20 (PBS/T)/10% BSA pour 1 h à RT.
    2. Remplacez la solution de blocage par l'anticorps primaire approprié dilué dans le PBS/T/1% BSA et incubez à 4 oC par une douce agitation pendant la nuit.
    3. Laver les cellules avec PBS/T pendant 5 min et répéter trois fois.
    4. Incuber avec l'anticorps secondaire approprié dilué dans PBS/T/1% BSA et incuber dans l'obscurité à RT pendant 1 h avec une agitation douce.
      REMARQUE: Les anticorps primaires et secondaires optimisés sont répertoriés dans tableau des matériaux.
    5. Laver les cellules avec PBS/T pendant 5 min et répéter trois fois.
    6. Ajouter 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) aux cellules selon les instructions du fabricant et placer un bordereau en verre doucement pour réduire les bulles d'air. Maintenir les cellules fixes à 4 oC dans l'obscurité. Observez la coloration sous un microscope avec le filtre approprié et la lampe fluorescente.
      REMARQUE: Conserver les plaques à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à l'imagerie.

Representative Results

Les agrégats tridimensionnels de la lignée des cellules souches embryonnaires (H9) ou de la lignée de cellules souches pluripotentes induites (P106) ont été différenciés vers la lignée des hépatocytes à l'aide de notre procédure définie (figure 1). Les cellules souches pluripotentes ont d'abord été amorcées vers l'endoderm définitif avant la spécification de l'hépatoblaste. Par la suite, les hépatoblastes ont été élevés en hépatosphères 3D qui pouvaient être maintenus en culture jusqu'à un an23.

Pour étudier la structure des sphères 3D, des sphères dérivées de hESC- ou iPSC ont été fixées, sectionnés et tachées pour détecter la présence de protéines exprimées dans les hépatocytes et les cellules mésenchymales. Le facteur nucléaire d'hépatocyte 4 alpha (HNF4) et la vimentine de marqueur mésenchymale ont été employés, révélant la présence d'une couche externe composée d'hépatocytes comme des cellules entourant un noyau de cellules mésenchymales (figure 2). Nous avons suivi ces expériences analysant l'expression des protéines exprimées dans les hépatocytes : albumine, CYP3A et E-cadherin. Immunostaining a révélé que l'expression de ces protéines était limitée à la couche externe des sphères (Figure 3).

Des analyses fonctionnelles des hépatosphères ont été exécutées dans les cultures de jour 30. CYP1A2 et CYP3A sont des enzymes importantes dans les hépatocytes fonctionnels. Leur activité a été évaluée à l'aide d'essais établis. Les hépatosphères dérivées de H9 ont montré l'activité de CYP3A de 220 375 - 74514 protéine RLU/mL/mg et activité CYP1A2 de 732 440 à 33 330 RLU/mL/mg de protéines (Figure 4A). L'activité cyP3A dans les hépatosphères dérivées de P106 était de 132117 - 43 391 RLU/mL/mg protéine et l'activité CYP1A2 était de 409 907 - 121 723 RLU/mL/mg protéine (Figure 4B). Par rapport à deux lots d'hépatocytes primaires humains, les sphères hépatiques 3D présentaient des niveaux respectables d'activité CYP10.

L'analyse de la synthèse et de la sécrétion de l'albumine et de l'alpha-fétoprotéine (AFP) a révélé que les hépatosphères dérivées de H9 sécrétaient respectivement 683,9 et 84 et 159, 20 ng/mL/24 h/mg de protéines d'albumine et d'alpha-fétoprotéine (Figure 5A). Considérant que les hépatosphères dérivées de P106 sécrétaient respectivement 497 à 41 et 756, 24 ng/mL/24 h/mg de protéines d'albumine et d'alpha-fétoprotéine (Figure 5B).

Figure 1
Figure 1 : Procédure de différenciation stepwise pour générer des hépatosphères 3D à partir de HESCs. Les supports bleus représentent des jours de différenciation pour les hiPSC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Réorganisation structurelle des hépatosphères 3D. Images représentatives de l'expression du facteur nucléaire d'hépatocyte 4 alpha (HNF4MD - vert) et vimentine (rouge) dans (A) H9-dérivé des hépatosphères 3D et (B) P106-dérivé des hépatosphères 3D et leurs contrôles correspondants d'immunoglobuline G (IgG) . Les barres d'échelle représentent 60 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de l'expression des marqueurs hépatiques dans les hépatosphères 3D. Images représentatives de l'expression des marqueurs d'hépatocyte - albumine, CYP3A, E-cadherin et leurs contrôles IgG correspondants dans (A) H9- et (B) P106-dérivé des hépatosphères 3D. Barres d'échelle de 60 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Cytochrome P450 fonction dans les hépatosphères 3D. Mesure de l'activité cytochrome P450 1A2 et 3A dans les hépatosphères 3D dérivées de H9 et (B) les hépatosphères 3D dérivées deP106. Les données représentent la moyenne de trois répliques biologiques, et les barres d'erreur représentent l'écart standard (SD). L'activité est citée comme unités lumineuses relatives (RLU) par mL par mg de protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse de la sécrétion de protéines de l'hépatosphère. La sécrétion d'albumine et d'alpha-fétoprotéine (AFP) a été analysée dans (A) H9-dérivé des hépatosphères 3D et (B) P106-dérivé des hépatosphères 3D. Les données sont représentatives de trois répliques biologiques, et les barres d'erreur représentent le SD. La protéine sécrétée est citée comme nanogrammes de protéines par mL par 24 h par mg de protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Le développement de systèmes définis et sans xéno pour produire des hépatosphères humaines en 3D est nécessaire pour les efforts in vitro et in vivo. À l'heure actuelle, la plupart des approches de différenciation des hépatocytes des cellules souches pluripotentes humaines sont effectuées dans deux cultures adhérentes dimensionnelles. Ces environnements manquent de nombreux indices environnementaux impliqués dans la genèse des tissus et l'homéostasie qui comprennent; interactions cellulaires hétérorypiques, production de matrice et remodelage, résultant en une mauvaise traduction à la biologie in vivo18,19.

Par conséquent, la recherche s'est concentrée sur d'autres approches pour produire des hépatosphères à partir de cellules souches pluripotentes. Un certain nombre d'études 3D ont fait progresser le domaine, mais celles-ci dépendent des produits animaux20,22,24 pour fournir un soutien et / ou nécessitent l'utilisation de tissus humains21,22 ce qui complique l'échelle technologique et compromet la reproductibilité et l'application expérimentales.

La procédure décrite dans notre article (Figure 1) est définie, efficace, hautement reproductible et rentable, permettant la production de sphères hépatiques fonctionnelles, qui restent fonctionnelles sur un an in vitro et fournissent un soutien hépatique critique dans vivo14. Surtout, cette plate-forme permet à l'utilisateur de contrôler la taille des sphères hépatiques 3D, limitant la formation de centres nécrotiques denses et la perte de phénotype.

Le transfert des hépatosphères 3D aux plaques enduites poly-HEMA représente une étape critique dans ce protocole. Il est important de pipette doucement à ce stade de la procédure pour éviter d'endommager la sphère. En outre, les changements de médias doivent être effectués avec soin pour éviter le stress de cisaillement et la distorsion de la structure de la sphère.

Dans ces études, les hépatosphères 3D présentaient une structure organisée (figure2 et figure3), la fonction cytochrome P450 (Figure 4) et les protéines hépatiques sécrétées, y compris l'albumine et l'alpha-fétoprotéine (Figure 5). Cette procédure a été réalisée avec succès dans quatre lignées de cellules souches pluripotentes avec des résultats comparables. Pour l'avenir, cette technologie pourrait être utilisée comme une plate-forme pour développer d'autres tissus endodermal et mésenchymal avec des architectures complexes.

Disclosures

David C. Hay est cofondateur et actionnaire de Stemnovate Ltd et de HigherSteaks Ltd. Les autres auteurs certifient qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts dans le sujet ou les documents discutés dans cet article.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par des prix de la Plate-forme de médecine régénérative du Royaume-Uni (MRC MR/L022974/1) et du Chief Scientist's Office (TCS/16/37).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9, (1), 51-62 (2007).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26, (4), 894-902 (2008).
  4. Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8, (2), 430-437 (2013).
  5. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, (2), 237-252 (2014).
  6. Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51, (1), 329-335 (2010).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51, (1), 297-305 (2010).
  8. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5, (6), 1250-1262 (2015).
  11. Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3, (1), 204-214 (2014).
  12. Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (1750), 20170362 (2018).
  13. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5, (6), 764-772 (2016).
  14. Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91, (11), 3633-3643 (2017).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120, (9), 3127-3136 (2010).
  16. Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63, (4), 934-942 (2015).
  17. Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4, (20), 3433-3442 (2016).
  18. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22, (5), 456-472 (2017).
  19. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  20. Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9, (1), (2014).
  21. Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9, (2), 396-409 (2014).
  22. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  23. Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92, (10), 3117-3129 (2018).
  24. Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21, (10), 2661-2670 (2017).
Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).More

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter