Denne protokollen beskriver en tilnærming til å produsere hepatospheres fra menneskelige Pluripotent stamceller ved hjelp av et definert kultur system og celle selv montering. Denne protokollen er reproduserbar i en rekke cellelinjer, kostnadseffektive og tillater produksjon av stabile menneskelige hepatospheres for biomedisinsk anvendelse.
Utviklingen av fornybare kilder av leveren vev er nødvendig for å forbedre celle-basert modellering, og utvikle menneskelig vev for transplantasjon. Human embryonale stamceller (hESCs) og humant indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) representerer lovende kilder til menneskelige lever kuler. Vi har utviklet en serum fri og definert metode for cellulær differensiering å generere tredimensjonale menneskelige lever kuler dannet av humant Pluripotent stamceller. En potensiell begrensning av teknologien er produksjon av tette sfærer med dødt materiale inni. For å omgå dette har vi benyttet agarose mikrotiterplateleser teknologi ved definerte celle tetthet for å kontrollere størrelsen på 3D-kulene, og hindre generering av apoptotisk og/eller nekrotisk kjerner. Spesielt, kulene som genereres av vår tilnærming viser leverfunksjon og stabile fenotype, som representerer en verdifull ressurs for grunnleggende og anvendt vitenskapelig forskning. Vi tror at vår tilnærming kan brukes som en plattformteknologi for å utvikle ytterligere vev til modell og behandle menneskelig sykdom, og i fremtiden kan tillate generering av menneskelig vev med komplekse vev arkitektur.
Muligheten av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) til selv-fornyelse, mens beholde pluripotency, gir en mulighet til å produsere menneskelige celletyper og vev på forespørsel. hPSCs har vært effektivt differensiert i hepatocytter celler (HLCs) ved hjelp av to-dimensjonale (2D) tilhenger kultur systemer1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Disse systemene har blitt brukt for å kunne modellere monogenic sykdom, virus livssyklus, narkotikaindusert leverskade (DILI), fosterets eksponering for giftstoffer og alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men disse modellene har noen ulemper, som begrenser deres rutine bruk. De inkluderer fosterets markør uttrykk, ustabil fenotype og dårlig vevs arkitektur16,17,18,19, som også kan begrense ekstrapolering til organfunksjon in vivo.
For å overkomme disse begrensningene har tredimensjonale (3D) differensiering-plattformer blitt utviklet for å etterligne in vivo vevs arkitektur. Selv om aktivering, de tilnærminger stole på bruk av animalske avledede produkter og matriser til å drive tissue Genesis20,21,22, begrenser oppskalering og utbredt anvendelse.
Her har vi detaljerte prosedyrer for å generere store mengder 3D-hepatospheres fra hPSCs ved hjelp av definerte materialer og celle selv montering. Spesielt er vevet generert av vår prosedyre fortsatt funksjonell i mer enn ett år i cellekultur og er i stand til å støtte leverfunksjon i vivo23.
Oppsummert gjør vår definerte differensiering tilnærming generering av stabile menneskelige hepatospheres fra både menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs). Vi mener at den beskrevne prosedyren representerer et betydelig gjennombrudd i genereringen av 3D-hepatospheres for grunnleggende og anvendt vitenskapelig forskning.
Utviklingen av definerte og Xeno systemer for å produsere humant hepatospheres i 3D kreves for både in vitro-og in vivo-bestrebelser. I dag mest hepatocytter differensiering tilnærminger fra menneskelige Pluripotent stamceller utføres i todimensjonale tilhenger kulturer. Disse miljøene mangler mange av de miljømessige signaler involvert i vev Genesis og homeostase som inkluderer; heterotypic celle interaksjoner, matrise produksjon og remodeling, noe som resulterer i dårlig oversettelse til in vivo biologi18,19.
Som et resultat, forskning har fokusert på alternative tilnærminger til å generere hepatospheres fra Pluripotent stamceller. En rekke 3D studier har avansert feltet, men de er avhengige av animalske produkter20,22,24 for å gi støtte og/eller krever bruk av menneskelig vev21,22 som kompliserer teknologi skalerer og kompromisser eksperimentell reproduserbarhet og anvendelse.
Fremgangsmåten som er beskrevet i vår artikkel (figur 1) er definert, effektiv, svært reproduserbar og kostnadseffektiv, slik at produksjonen av funksjonelle lever kuler, som forblir funksjonell over et år in vitro og gi kritisk lever støtte i vivo14. Viktigere, tillater denne plattformen brukeren å kontrollere størrelsen på 3D lever kuler, begrenser dannelsen av tette nekrotisk sentre og tap av fenotype.
Overføringen av 3D-hepatospheres til Poly-HEMA belagte plater representerer et kritisk trinn i denne protokollen. Det er viktig å Pipetter forsiktig på dette stadiet i prosedyren for å unngå skade på sfæren. I tillegg må Media endringer utføres nøye for å unngå skjær stress og forvrengning av sfære struktur.
I disse studiene viste 3D-hepatospheres en organisert struktur (figur 2 og Figur 3), cytokrom P450-funksjon (Figur 4) og utskilt lever proteiner, inkludert albumin og alpha-fetoprotein (figur 5). Denne prosedyren har blitt utført i fire Pluripotent stamceller linjer med sammenlignbare utfall. Ser fremover, kan denne teknologien være ansatt som en plattform for å utvikle ytterligere endodermal og mesenchymal vev med komplekse arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet med priser fra den britiske regenererende medisin plattformen (MRC MR/L022974/1) og Chief Scientist ‘ s Office (TCS/16/37).
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |