该协议描述了一种使用定义的培养系统和细胞自组装从人类多能干细胞中产生肝球的方法。该协议可重复在多个细胞系中,具有成本效益,并允许生产稳定的人类肝球用于生物医学应用。
需要开发可再生的肝组织,以改善基于细胞的建模,并开发用于移植的人体组织。人类胚胎干细胞(hESCs)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs)代表了人类肝脏领域的有希望的来源。我们开发了一种无血清和定义的细胞分化方法,以产生由人类多能干细胞形成的三维人类肝球。该技术的一个潜在限制是生产带有死料的密集球体。为了规避这种情况,我们采用在定义的细胞密度下采用的角糖微孔技术来控制3D球体的大小,防止产生凋亡和/或坏死核。 值得注意的是,我们的方法产生的球体显示肝功能和稳定表型,是基础和应用科学研究的宝贵资源。我们相信,我们的方法可以作为一个平台技术,以进一步开发组织,以建模和治疗人类疾病,并在未来可能允许生成具有复杂组织结构的人体组织。
人类多能干细胞(hPSCs)自我更新的能力,同时保持多能性,为按需生产人类细胞类型和组织提供了机会。hPSCs 已经有效地分化成肝细胞样细胞 (HLCs) 使用二维 (2D) 附着培养系统1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10.这些系统已用于成功模拟单源疾病、病毒生命周期、药物诱发肝损伤 (DILI)、胎儿接触毒素和非酒精性脂肪肝 (NAFLD)11、12、13 ,14,15.但是,这些模型确实存在一些缺点,限制了它们的日常使用。这些包括胎儿标记表达,不稳定的表型和不良的组织结构16,17,18,19,这也可能限制外推器官功能在体内。
为了克服这些限制,已经开发了三维(3D)分化平台来模拟体内组织架构。虽然实现了,这些方法依赖于使用动物衍生产品和基质驱动组织成因20,21,22,限制扩大和广泛应用。
在这里,我们详细介绍了使用定义的材料和细胞自组装从 hPSC 生成大量 3D 肝球的过程。值得注意的是,我们的程序产生的组织在细胞培养中保持一年以上的功能,并能够支持体内的肝功能23。
总之,我们定义的分化方法允许从人类胚胎干细胞 (hESCs) 和诱导多能干细胞 (iPSCs) 生成稳定的人类肝球。我们认为,所述程序代表了在基础和应用科学研究的3D肝球的生成上的重大突破。
开发定义和无异种系统,以产生人类肝球在3D是需要体外和体内的努力。目前,人类多能干细胞的肝细胞分化方法大多在二维粘附培养物中进行。这些环境缺乏许多涉及组织成因和平衡的环境线索,包括:异质细胞相互作用,基质生成和重塑,导致对体内生物学的翻译不良18,19。
因此,研究的重点是从多能干细胞中产生肝球的替代方法。一些3D研究已经推进了这一领域,但这些依赖于动物产品20,22,24提供支持和/或使用人体组织21,22,这使得技术扩展,并损害实验的可重复性和应用。
本文中描述的程序(图1)是定义的,效率高,可重复和成本效益高,允许功能性肝球的生产,在体外保持一年的功能,并提供关键的肝脏支持活体14.重要的是,该平台允许用户控制3D肝球的大小,限制密集坏死中心的形成和表型的丢失。
3D肝球转移到多HEMA涂层板是该协议的关键步骤。在手术的这一阶段,轻轻移液,以避免损坏球体,这一点很重要。此外,必须小心进行介质更换,以避免剪切应力和球体结构失真。
在这些研究中,3D肝球显示了一个有组织的结构(图2和图3),细胞色素P450功能(图4)和分泌的肝蛋白,包括白蛋白和α-脂肪蛋白(图5)。这个程序已经成功地在四个多能干细胞系中进行,具有类似的结果。展望未来,该技术可以作为一个平台,开发具有复杂体系结构的进一步内皮和中相组织。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了英国再生医学平台(MRC MR/L022974/1)和首席科学家办公室(TCS/16/37)的奖项的支持。
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |