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Developmental Biology

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

doi: 10.3791/59965 Published: July 20, 2019

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Abstract

Die Entwicklung erneuerbarer Quellen von Lebergewebe ist erforderlich, um die zellbasierte Modellierung zu verbessern und menschliches Gewebe für die Transplantation zu entwickeln. Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) stellen vielversprechende Quellen menschlicher Lebersphären dar. Wir haben eine serumfreie und definierte Methode der zellulären Differenzierung entwickelt, um dreidimensionale menschliche Lebersphären zu erzeugen, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gebildet werden. Eine mögliche Einschränkung der Technologie ist die Herstellung dichter Kugeln mit totem Material im Inneren. Um dies zu umgehen, haben wir Agarose-Mikrowell-Technologie in definierten Zelldichten eingesetzt, um die Größe der 3D-Kugeln zu kontrollieren und die Erzeugung von apoptotischen und/oder nekrotischen Kernen zu verhindern.  Insbesondere zeigen die durch unseren Ansatz erzeugten Sphären die Leberfunktion und den stabilen Phänotyp, der eine wertvolle Ressource für die grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung darstellt. Wir glauben, dass unser Ansatz als Plattformtechnologie zur Entwicklung weiterer Gewebe zur Modellierung und Behandlung menschlicher Krankheiten genutzt werden könnte und in Zukunft die Erzeugung von menschlichem Gewebe mit komplexer Gewebearchitektur ermöglichen könnte.

Introduction

Die Fähigkeit menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs), sich selbst zu erneuern, während die Pluripotenz erhalten bleibt, bietet die Möglichkeit, menschliche Zelltypen und Gewebe auf Anfrage zu produzieren. hPSCs wurden effizient in hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) mit zweidimensionalen (2D) haftenden Kultursystemen1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Diese Systeme wurden verwendet, um monogene Krankheiten, Virus-Lebenszyklus, medikamentöse Leberschäden (DILI), fetale Exposition gegenüber Toxinen und nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen (NAFLD) erfolgreich zu modellieren11,12,13 ,14,15. Diese Modelle haben jedoch einige Nachteile, die ihre Routinenutzung einschränken. Dazu gehören fetale Markerexpression, instabiler Phänotyp und schlechte Gewebearchitektur16,17,18,19, die auch die Extrapolation auf die Organfunktion in vivo begrenzen könnte.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Differenzierungsplattformen entwickelt, um in vivo Gewebearchitektur nachzuahmen. Obwohl diese Ansätze dies ermöglichen, stützen sie sich auf die Verwendung von tierischen Produkten und Matrizen, um die Gewebegenese20,21,22zu fördern, was das Scale-up und die weit verbreitete Anwendung begrenzt.

Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung großer Mengen von 3D-Hepatosphären aus hPSCs unter Verwendung definierter Materialien und Zellselbstmontage. Insbesondere bleibt das durch unser Verfahren erzeugte Gewebe für mehr als ein Jahr in der Zellkultur funktionsfähig und ist in der Lage, die Leberfunktion in vivo23zu unterstützen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser definierter Differenzierungsansatz die Erzeugung stabiler menschlicher Hepatosphären sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) ermöglicht. Wir glauben, dass das beschriebene Verfahren einen bedeutenden Durchbruch bei der Erzeugung von 3D-Hepatosphären für die Grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung darstellt.

Protocol

1. Herstellung von Agarose Mikroplattenformen

HINWEIS: Die für diese Experimente verwendeten Medien müssen steril und bei Raumtemperatur (RT) für die Zellkultur sein.

  1. Bereiten Sie 2% Agarose-Formen vor.
    1. 2 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in 100 ml sterilisiertes destilliertes Wasser auflösen. Vorsichtig in einer Mikrowelle mit Intervallschütteln erhitzen, um sich vollständig aufzulösen.
    2. 520 L geschmolzene Agarose zu einer 256-Well-Form hinzufügen und erstarren lassen.
    3. Übertragen Sie jede Agarose-Mikroplatte in einen einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte.
    4. Fügen Sie 1,5 ml 1x 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) mit Ca2+/Mg2+ zu jedem Brunnen hinzu und entfernen Sie die Luftblasen aus den Mikrobrunnen, indem Sie mit einer P1000 Pipette-Spitze mehrmals sanft nach oben und unten pfeifen. Dies wird durchgeführt, um eine gleichmäßige Zellaussaat zu gewährleisten.
      HINWEIS: Agarose Mikroplatten können bis zu 6 Monate bei 4 °C in 1x DPBS gelagert werden.

2. Aussaat humaner pluripotenter Stammzellen in Agarose Microwell Platten

  1. Vorbereitung der Zellsuspension
    1. Aspirieren Sie das Medium aus einer undifferenzierten Kultur von hPSCs, wie zuvor beschrieben8.
      ANMERKUNG: hPSCs werden auf LN-521 in mTeSR1 kultiviert, wobei das Medium alle 24 h gewechselt wird, und regelmäßig durchgedrungen, sobald die Zellen 75% bis 85% der Konfluenz erreichen, wie zuvor beschrieben8.
    2. Spülen Sie die Zellen mit 5 ml RT 1x DPBS ohne Ca2+/Mg2+ und entfernen Sie den Puffer.
    3. Fügen Sie den Zellen 5 ml 1x Zelldissoziationsreagenz (Materialtabelle) hinzu und lassen Sie die Zelldissoziation durch Inkubation von Zellen bei 37 °C für 6-8 min zu.
      HINWEIS: Um die Reaktion zu stoppen, untersuchen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Die Zellen sollten teilweise von der Platte gelöst werden. Verlängern Sie die Inkubation um zusätzliche 1-2 min, wenn längere Zeit erforderlich ist.
    4. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Zelldissoziationsreagenz entfernen und 5 ml frisches mTeSR1-Medium, ergänzt durch 10 M Rho-assoziierte Kinase (ROCK)-Hemmer Y27632, zu den Zellen hinzufügen. Trennen Sie Zellen, indem Sie mithilfe einer P1000-Pipettenspitze mehrmals nach oben und unten pfeifen.
    5. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung Ausschluss. Anschließend bereiten Sie die Zellsuspension in der erforderlichen Konzentration vor.
    6. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen. Zur 3D-Hepatosphärendifferenzierung, Samen 3,84 x 105 Zellen pro Agarose Mikroplatte, um Sphäroide mit 100-150 m Durchmesser zu erzeugen.
    7. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 15 ml oder 50 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min bei RT, um die Zellen zu pellet.
    8. Aspirieren und entsorgen Sie die Überstands- und Resuspendzellen in mTeSR1 medium plus 10 'M ROCK-Hemmer Y27632. Das Zellpellet im entsprechenden Mediumvolumen auf eine Endkonzentration von 2,1 x 106 Zellen/ml verdünnen.
  2. Aussaat der Zellen an die vorbereiteten Agarose-Mikroplatten
    HINWEIS:
    Wenn Sie kühl gelagerte Agarose-Mikroplatten verwenden, legen Sie sie mindestens eine Stunde vor der Verwendung bei 37 °C in den Zellinkubator und saugen Sie die 1x DPBS vor der Zellaussaat aus dem Brunnen ab.
    1. Fügen Sie 190 l der Zellsuspension in den Agarose-Mikrowell ein.
    2. Nach der Aussaat die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 2 h in den Zellinkubator zurück, damit sich die Zellen absetzen können.
    3. Nach 2 h 1 ml frisches und warmes mTeSR1-Medium hinzufügen, ergänzt mit 10 'M ROCK-Hemmer Y27632 zu jedem Brunnen.
    4. Geben Sie die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h in den Zellinkubator zurück und untersuchen Sie die Bildung von Kugeln am nächsten Tag, damit sich die Zellen anheften können.

3. Unterscheidung von hPSCs zu 3D-Hepatosphären auf Agarose Microwells

  1. Herstellung von Poly 2-Hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) beschichteten Brunnen
    1. 2 g Poly-HEMA in 100 ml 95% Ethanol auflösen. Die Lösung über Nacht mit einer Kochplatte bei 55 °C umrühren. Fügen Sie 250 l Poly-HEMA-Lösung pro Bohrung einer 24-Well-Platte hinzu und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 °C mit einem Ofen.
  2. Vorbereitung des Differenzierungsmediums
    1. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von humanem Aktivin A vor, indem Sie humanes Aktivin Ein lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% Rinderserumalbumin (BSA)/DPBS auf eine Endkonzentration von 100 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    2. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von Wnt3a vor, indem Sie die Maus Wnt3a lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung um 1:200.
    3. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des humanen Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF) vor, indem Sie das humane HGF-lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    4. Bereiten Sie eine 1.000-fache Lagerlösung von Oncostatin M (OSM) vor, indem Sie OSM in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 20 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    5. Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung des epithelialen Wachstumsfaktors (EGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    6. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    7. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.
    8. Endoderm Differenzierungsmedium bestehend aus Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Basalmedium ergänzt mit 2% B27 Ergänzung (50x, ohne Insulin) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen: 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Sofern nicht angegeben, wird bei jeder mittleren Veränderung das erforderliche Volumen mit Wnt3a und Aktivin A bei einer Endkonzentration von 50 ng/ml bzw. 100 ng/ml ergänzt.
      HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden.
    9. Herstellung eines Hepatoblast-Differenzierungsmediums bestehend aus dem modifizierten Eagle-Medium (KO-DMEM) von Knockout Dulbecco mit 20% Knockout-Serumersatz (KOSR) und ergänzt durch 0,5% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol, 1% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml). Filter unter Vakuum.
      HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden.
    10. Herstellung von Hepatozytenreifungsmedium bestehend aus Hepatozytenmedium, ergänzt durch 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 10 M Hydrocortison 21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC), 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml). Für jede mittlere Veränderung das benötigte Volumen mit OSM und HGF (Endkonzentrationen bei 20 ng/ml bzw. 10 ng/ml) ergänzen.
      HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen.
    11. Hepatozyten-Wartungsmedium, bestehend aus Williams E-Medium, ergänzt durch 10% Knockout-Serum-Ersatz, bestehend aus 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Für jede mittlere Veränderung das erforderliche Volumen mit HGF, EGF, bFGF und VEGF (Endkonzentration jedes Wachstumsfaktors bei 10 ng/ml) ergänzen.
      HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen.
  3. Überprüfen Sie die Hepatosphärenbildung 24 h nach der Aussaat und initiieren Sie die Hepatozytendifferenzierung. Entfernen Sie das mTeSR1 Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Endoderm-Differenzierungsmedium, ergänzt durch 100 ng/ml Activin A und 50 ng/ml Wnt3a.
  4. Änderung ergänzt Endoderm Grundierung Medium alle 24 h für 3 Tage für hESCs. Bei der Arbeit mit hiPSCs, verlängern Sie diese Phase um weitere 2 Tage und ergänzen Sie die Medien allein mit Aktivin A (100ng/ml).
  5. Nach der endgültigen Endoderm-Induktion, wechseln Sie auf Hepatoblast Differenzierungsmedium für Hepatoblast Spezifikation für 5 Tage ersetzen das Medium alle 2 Tage und führen Sie die letzte Änderung am letzten Tag der Hepatoblast Spezifikation.
  6. Übertragen Sie Hepatosphären in die poly-HEMA beschichteten Brunnen.
    1. Waschen Sie die Zellen einmal mit Hepatozyten reifung Medium ohne Ergänzungen nach dem Entfernen KSR / DMSO Medium und fügen Sie 1 ml Hepatozyten reifung Medium ergänzt mit 10 ng/ mL HGF und 20 ng/mL OSM.
    2. Heben Sie mit einer P1000 Pipette die Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte an, indem Sie die Lösung mehrmals auf und ab pfeifen.
    3. Übertragen Sie das Medium, das die Hepatosphären enthält, auf einen poly-HEMA-beschichteten Brunnen.
    4. Waschen Sie die Agarose-Mikroplatte mit 1 ml Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM, und übertragen Sie das Medium auf das poly-HEMA beschichtete Gut.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.6.4 so oft wie möglich, um alle Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte zu übertragen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Lösung, die die Hepatosphären enthält, sorgfältig nach oben und unten zu pipette, um zu vermeiden, dass sie beschädigt werden.
  7. Sorgsam überschüssiges Medium ansaugen, ohne Hepatosphären zu entfernen, indem man eine P100-Pipette verwendet, bis 1 ml Medium, das die Hepatosphären enthält, gut in der Poly-HEMA beschichtet bleibt.
  8. Wechseln Sie das Medium alle 48 stunden für 12 Tage.
  9. Wechseln Sie an Tag 20 bei der Arbeit mit hESCs oder tag 22 bei Arbeiten mit hiPSCs das Medium auf Hepatozyten-Wartungsmedium.
    1. Entfernen Hepatozyten Reifung Medium und waschen Zellen einmal mit Hepatozyten-Wartungsmedium ohne die Ergänzungen. Fügen Sie 1 ml Hepatozyten-Wartungsmedium mit 10 ng/ml HGF, EGF, FGF und VEGF ergänzt.
  10. Ändern Sie das Medium für frische Hepatozyten-Wartungsmedium alle 48 h.

4. Funktionelle Analyse von langzeitgecultureten 3D-Hepatosphären

  1. Wechseln Sie auf Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 M HCC, L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml) und 10 ng/ml HGF 48 h vor der Durchführung einer funktionellen Analyse.
  2. Analysieren Sie die metabolische Funktion von Hepatozyten mit Cytochrom (CYP) P450-Assays.
    1. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml frisches Hepatozyten-Reifungsmedium, ergänzt durch 50 -M-Luciferin-6'-Pentafluor-Benzyl-Ether (Luciferin-PFBE)-Substrat zum Nachweis der CYP3A-Basalaktivität oder 100 -M-Luciferin-Methylether(Luciferin-ME)-Substrat zum Nachweis von CYP1A2 Basalaktivität (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle.
      HINWEIS: Um Kreuzreaktivität zu vermeiden, wird empfohlen, nicht die gleichen Brunnen mit 3D-Hepatosphären zu verwenden, um verschiedene CYP P450-Aktivitäten zu testen, sondern sie in einzelnen Brunnen durchzuführen.
    2. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C.
    3. Sammeln Sie die Überräube mit einer P100 Pipettenspitze und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    4. Messen Sie die relative Basalaktivität und normalisieren Sie sich auf pro mg-Protein, wie durch den Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt.
  3. Testen Sie die Serumproteinproduktion mit enzymgebundenem Immunsorbent Assay (ELISA).
    1. Ersetzen Sie Medium durch 1 ml frischehe Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle.
    2. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C.
    3. Sammeln Sie den Überstand mit einer P100 Pipettenspitze und messen Sie die relativen Mengen der Serumproteinproduktion gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Normalisieren Sie auf pro mg-Protein, wie durch den BCA-Assay bestimmt.

5. Immunzytochemie

  1. Herstellung von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten.
    1. Waschen Sie die Hepatosphären dreimal mit 1x DPBS.
    2. Fixieren Sie die Hepatosphären mit eiskaltem Methanol für 30 min.
    3. Waschen Sie dreimal mit 1x DPBS.
    4. Die Hepatosphären in 300 l einer gehärteten Lösung von 2% Agarose, die inH2O gelöst ist, mit einem leeren Brunnen einer 24-Well-Platte als Form einbetten und 30 min verfestigen lassen.
    5. Einbetten sie die Agarose mit Hepatosphären in Paraffin.
    6. Abschnitt des Paraffinblocks mit festen Hepatosphären in 4 m dicken Abschnitten mit einem Mikrotome.
  2. De-Waxing und Rehydratation der Abschnitte.
    HINWEIS:
    Verwenden Sie neue Lösungen, wann immer es möglich ist. Verwenden Sie keine Lösungen, die länger als eine Woche auf dem Färberrog waren.
    1. Platzieren Sie Abschnitte in einem Schiebeträger.
    2. Eintauchen Sie das Schielengestell mit Abschnitten in einen Färbetrog mit 300 ml Xylol für 5 min.
    3. Wiederholen Sie Schritt 5.2.2.
    4. Tauchen Sie in absolutes Ethanol für 20 s ein.
    5. Tauchen Sie in 95% Ethanol für 20 s ein.
    6. Tauchen Sie in 90% Ethanol für 20 s ein.
    7. Tauchen Sie in 80% Ethanol für 20 s ein.
    8. Tauchen Sie in 70% Ethanol für 20 s ein.
    9. Rehydrieren Sie die Abschnitte mit Wasser für 5 min.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Dias im selben Schiebeträger auf und verschieben Sie sie von einem Färberrog zum nächsten. Das verwendete Volumen (in der Regel 300 ml) hängt von der Größe des Färbetrogs ab.
  3. Antigen-Retrieval von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten.
    1. Entwachste und rehydrierte Abschnitte in 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 Pufferlösung für 15 min in einer Mikrowelle bei 800 W erhitzen.
    2. Abkühlen von Proben, indem Sie sie 5 min in Leitungswasser eintauchen.
  4. Immunostaining.
    1. Inkubieren Sie Dias mit Blockierlösung aus PBS mit 0,1% Polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA für 1 h bei RT.
    2. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch den entsprechenden Primärantikörper, der in PBS/T/1% BSA verdünnt ist, und inkubieren Sie bei 4 °C mit sanfter Rührung über Nacht.
    3. Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal.
    4. Mit dem entsprechenden sekundären Antikörper in PBS/T/1% BSA inkubieren und im Dunkeln bei RT 1 h mit sanfter Rührung inkubieren.
      HINWEIS: Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
    5. Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal.
    6. Fügen Sie 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu den Zellen nach den Anweisungen des Herstellers hinzu und legen Sie einen Glasdeckel vorsichtig, um Luftblasen zu reduzieren. Fixzellen bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren. Beobachten Sie die Färbung unter dem Mikroskop mit entsprechender Filter- und Leuchtstofflampe.
      HINWEIS: Platten bei 4 °C im Dunkeln bis zur Bildgebung aufbewahren.

Representative Results

Dreidimensionale Aggregate aus der embryonalen Stammzelllinie (H9) oder der induzierten pluripotenten Stammzelllinie (P106) wurden nachunserem definierten Verfahren (Abbildung 1) zur Hepatozytenlinie differenziert. Pluripotente Stammzellen wurden vor der Hepatoblast-Spezifikation zunächst auf endgültiges Endoderm umgesiebt. Danach wurden Hepatoblasten zu 3D-Hepatosphären gereift, die in der Kultur für bis zu einem Jahr23erhalten werden konnten.

Um die Struktur von 3D-Kugeln zu untersuchen, wurden 30 Tage alte hESC- oder iPSC-abgeleitete Kugeln fixiert, geschnitten und gebeizt, um das Vorhandensein von Proteinen zu erkennen, die in Hepatozyten und mesenchymalen Zellen exprimiert werden. Hepatozyten-Kernfaktor 4 alpha (HNF4) und das mesenchymale Marker-Vimentin wurden eingesetzt, was das Vorhandensein einer äußeren Schicht offenbart, die aus Hepatozyten-ähnlichen Zellen besteht, die einen Kern mesenchymaler Zellen umgeben (Abbildung 2). Wir folgten diesen Experimenten und analysierten die Expression von Proteinen, die in Hepatozyten exprimiert werden: Albumin, CYP3A und E-Cadherin. Immunostaining ergab, dass die Expression dieser Proteine auf die äußere Schicht der Kugeln beschränkt war (Abbildung 3).

Funktionelle Analysen der Hepatosphären wurden in Tag-30-Kulturen durchgeführt. CYP1A2 und CYP3A sind wichtige Enzyme in funktionellen Hepatozyten. Ihre Tätigkeit wurde anhand etablierter Assays bewertet. H9-abgeleitete Hepatosphären wiesen eine CYP3A-Aktivität von 220.375 x 74514 RLU/mL/mg-Protein und CYP1A2-Aktivität von 732.440 x 33.330 RLU/mL/mg-Protein auf (Abbildung 4A). Die CYP3A-Aktivität in P106-abgeleiteten Hepatosphären betrug 132117 x 43.391 RLU/mL/mg-Protein und die CYP1A2-Aktivität betrug 409.907 x 121.723 RLU/mL/mg-Protein (Abbildung 4B). Im Vergleich zu zwei Chargen menschlicher Primärhepatozyten zeigten 3D-Leberkugeln respektable CYP-Aktivitätswerte10.

Die Analyse der Synthese und Sekretion von Albumin und Alpha-Fetoprotein (AFP) ergab, dass H9-abgeleitete Hepatosphären 683,9 x 84 und 159 x 20 ng/mL/24 h/mg-Protein von Albumin bzw. Alpha-Fetoprotein sezernierten (Abbildung 5A). Während P106-abgeleitete Hepatosphären 497 x 41 und 756 x 24 ng/mL/24 h/mg-Protein von Albumin bzw. Alpha-Fetoprotein sezernierten (Abbildung5B).

Figure 1
Abbildung 1 : SchrittweiseDifferenzierungsverfahren zur Erzeugung von 3D-Hepatosphären aus hESCs. Blaue Klammern stellen Tage der Differenzierung für hiPSCs dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Strukturelle Reorganisation von 3D-Hepatosphären. Repräsentative Bilder der Expression des Hepatozyten-Kernfaktors 4 alpha (HNF4- - grün) und vimentin (rot) in (A) H9-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und den entsprechenden Immunglobulin-G-Kontrollen (IgG) . Skalenbalken stellen 60 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Bewertung des lebermarkerischen Ausdrucks in 3D-Hepatosphären. Repräsentative Bilder des Ausdrucks von Hepatozytenmarkern - Albumin, CYP3A, E-Cadherin und deren entsprechenden IgG-Steuerungen in (A) H9- und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären. Skalenbalken = 60 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Cytochrom P450 Funktion in 3D-Hepatosphären. Messung der Cytochrom-P450-1A2- und 3A-Aktivität in (A) H9-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären. Die Daten stellen den Mittelwert von drei biologischen Replikationen dar, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Die Aktivität wird als relative Lichteinheiten (RLU) pro ml pro mg Protein angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Analyse der Hepatosphärenproteinsekretion. Die Sekretion von Albumin und Alpha-Fetoprotein (AFP) wurde in (A) abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären analysiert. Die Daten sind repräsentativ für drei biologische Replikationen, und die Fehlerbalken stellen die SD dar. Sezersier Protein wird als Nanogramm Protein pro ml pro 24 h pro mg Protein zitiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Entwicklung definierter und xenofreier Systeme zur Herstellung menschlicher Hepatosphären in 3D ist sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Bemühungen erforderlich. Derzeit werden die meisten Hepatozytendifferenzierungsansätze aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in zweidimensional entämmten anhaftenden Kulturen durchgeführt. In diesen Umgebungen fehlen viele der Umwelthinweise, die an der Gewebegenese und Homöostase beteiligt sind. heterotypische Zellinteraktionen, Matrixproduktion und Remodellierung, was zu einer schlechten Übersetzung in die in vivo Biologie18,19führt.

Infolgedessen konzentrierte sich die Forschung auf alternative Ansätze zur Erzeugung von Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen. Eine Reihe von 3D-Studien haben das Feld vorangebracht, aber diese sind auf tierische Produkte angewiesen20,22,24, um Unterstützung zu bieten und/oder erfordern die Verwendung von menschlichem Gewebe21,22, was erschwert technologie scale-up und gefährdet experimentelle Reproduzierbarkeit und Anwendung.

Das in unserem Artikel beschriebene Verfahren (Abbildung 1) ist definiert, effizient, hochreproduzierbar und kostengünstig, was die Produktion funktioneller Leberkugeln ermöglicht, die über ein Jahr in vitro funktionsfähig bleiben und kritische Leberunterstützung bei vivo14. Wichtig ist, dass diese Plattform dem Benutzer ermöglicht, die Größe der 3D-Leberkugeln zu kontrollieren, wodurch die Bildung dichter nekrotischer Zentren und der Verlust des Phänotyps begrenzt werden.

Die Übertragung der 3D-Hepatosphären auf die poly-HEMA-beschichteten Platten stellt einen entscheidenden Schritt in diesem Protokoll dar. Es ist wichtig, Pipette in diesem Stadium des Verfahrens sanft zu pipette, um zu vermeiden, die Kugel zu beschädigen. Darüber hinaus müssen Medienänderungen sorgfältig durchgeführt werden, um Scherspannung und Verzerrung der Kugelstruktur zu vermeiden.

In diesen Studien zeigten 3D-Hepatosphären eine organisierte Struktur (Abbildung 2 und Abbildung 3), Cytochrom-P450-Funktion ( Abbildung4) und sezernierte Leberproteine, einschließlich Albumin und Alpha-Fetoprotein (Abbildung 5). Dieses Verfahren wurde erfolgreich in vier pluripotenten Stammzellenlinien mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. Mit Blick auf die Zukunft könnte diese Technologie als Plattform zur Weiterentwicklung von endodermalen und mesenchymalen Geweben mit komplexen Architekturen eingesetzt werden.

Disclosures

David C. Hay ist Mitbegründer und Aktionär von Stemnovate Ltd und HigherSteaks Ltd. Die übrigen Autoren bescheinigen, dass sie keine Interessenkonflikte in den in diesem Artikel behandelten Themen oder Materialien haben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde mit Auszeichnungen der UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1) und des Chief Scientist es Office (TCS/16/37) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

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References

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Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen
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Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).More

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

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