Detta protokoll beskriver en metod för att producera hepatospheres från humana pluripotenta stamceller med hjälp av ett definierat kultur system och cell Self-församling. Detta protokoll är reproducerbara i ett antal cellinjer, kostnadseffektiv och tillåter produktion av stabila mänskliga hepatospheres för biomedicinsk tillämpning.
Utvecklingen av förnybara källor av levervävnad krävs för att förbättra cellbaserad modellering, och utveckla mänsklig vävnad för transplantation. Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) representerar lovande källor till mänskliga lever sfärer. Vi har utvecklat en serum fri och definierad metod för cellulära differentiering att generera tredimensionella mänskliga lever sfärer bildas från mänskliga pluripotenta stamceller. En potentiell begränsning av tekniken är produktionen av täta sfärer med döda material inuti. För att kringgå detta har vi anställt aguppstod mikrobrunn teknik vid definierade cell tätheter för att kontrollera storleken på 3D-sfärer, vilket förhindrar generering av apoptotiska och/eller nekrotiska kärnor. Särskilt, de sfärer som genereras av vår strategi visar leverfunktion och stabil fenotyp, som representerar en värdefull resurs för grundläggande och tillämpad vetenskaplig forskning. Vi anser att vår strategi skulle kunna användas som en plattformsteknik för att utveckla ytterligare vävnader för att modellera och behandla mänskliga sjukdomar och i framtiden kan tillåta generering av mänsklig vävnad med komplex vävnads arkitektur.
Förmågan hos humana pluripotenta stamceller (hPSCs) att själv förnya, samtidigt behålla pluripotensen, ger en möjlighet att producera mänskliga celltyper och vävnader på efterfrågan. hpscs har effektivt differentierats till hepatocyte-liknande celler (hlcs) med hjälp av tvådimensionella (2D) anhängare kultur system1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Dessa system har använts för att framgångsrikt modellera monogena sjukdomar, virusets livscykel, läkemedelsinducerad leverskada (Dili), fosterexponering för toxiner och alkoholfria fettlever (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men dessa modeller har vissanackdelar, som begränsar deras rutinmässig användning. Dessa inkluderar fetalt markör uttryck, instabil fenotyp och dålig vävnads arkitektur16,17,18,19, som också kan begränsa extrapolering till organfunktion in vivo.
För att övervinna dessa begränsningar, tredimensionell (3D) differentiering plattformar har utvecklats för att efterlikna in vivo vävnad arkitektur. Även om det är möjligt, dessa metoder förlitar sig på användningen av animaliska produkter och matriser för att driva vävnad Genesis20,21,22, begränsa skala upp och utbredd tillämpning.
Här, vi detaljförfaranden för att generera stora mängder 3D hepatospheres från hPSCs med definierade material och cell Self-församling. Särskilt, vävnaden som genereras av vårt förfarande förblir funktionell för mer än ett år i cellkulturen och kan stödja leverfunktionen i vivo23.
Sammanfattnings, vår definierade differentiering tillvägagångssätt möjliggör generering av stabila mänskliga hepatospheres från både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Vi anser att det beskrivna förfarandet utgör ett betydande genombrott i utvecklingen av 3D-hepatosfärer för grundläggande och tillämpad vetenskaplig forskning.
Utvecklingen av definierade och Xeno-fria system för att producera mänskliga hepatospheres i 3D krävs för både in vitro-och in vivo strävanden. För närvarande de flesta hepatocyte differentiering metoder från mänskliga pluripotenta stamceller utförs i två dimensionella anhängare kulturer. Dessa miljöer saknar många av de miljömässiga signaler inblandade i vävnad Genesis och homeostas som inkluderar; heterotypic cell interaktioner, matris produktion och Remodeling, vilket resulterar i dålig översättning till in vivo biologi18,19.
Som ett resultat, forskning har fokuserat på alternativa metoder för att generera hepatospheres från pluripotenta stamceller. Ett antal 3D-studier har avancerat området, men de är beroende av animaliska produkter20,22,24 för att ge stöd och/eller kräva användning av mänsklig vävnad21,22 som komplierar teknik skala upp och äventyrar experimentell reproducerbarhet och tillämpning.
Det förfarande som beskrivs i vår artikel (figur 1) är definierad, effektiv, mycket reproducerbar och kostnadseffektiv, vilket möjliggör produktion av funktionella lever sfärer, som förblir funktionella över ett år in vitro och ge kritisk leverstöd i vivo14. Viktigare, denna plattform tillåter användaren att kontrollera storleken på 3D-levern sfärer, begränsa bildandet av täta nekrotiska centra och förlust av fenotyp.
Överföringen av 3D hepatospheres till Poly-HEMA belagda plattorna utgör ett kritiskt steg i detta protokoll. Det är viktigt att Pipettera försiktigt i detta skede i förfarandet för att undvika att skada sfären. Dessutom måste media förändringar utföras noggrant för att undvika skjuvning stress och snedvridning av sfär struktur.
I dessa studier, 3D-hepatosfärer visas en organiserad struktur (figur 2 och figur 3), cytokrom P450-funktionen (figur 4) och utsöndrat lever proteiner, inklusive albumin och alfa-fetoprotein (figur 5). Detta förfarande har framgångsrikt utförts i fyra pluripotenta stamcellslinjer med jämförbara resultat. Framöver skulle denna teknik kunna användas som en plattform för att utveckla ytterligare endodermala och mesenkymala vävnader med komplexa arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes med utmärkelser från den brittiska regenerativ medicin plattform (MRC MR/L022974/1) och Chief Scientist ‘ s Office (TCS/16/37).
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |