Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de transplante heterotópico da aorta em camundongos usando a técnica de manguito não sutura em um modelo de urina cervical. Este modelo pode ser usado para estudar a patologia subjacente da vasculopatia aloenxerto crônica (CAV) e pode ajudar a avaliar novos agentes terapêuticos, a fim de evitar a sua formação.
Abstract
Com a introdução de poderosos protocolos imunossupressores, avanços distintos são possíveis na prevenção e terapia de episódios de rejeição aguda. No entanto, apenas pequenas melhorias nos resultados a longo prazo de órgãos sólidos transplantados puderam ser observadas nas últimas décadas. Nesse contexto, a vasculopatia crônica do aloenxerto (CAV) ainda representa a principal causa de insuficiência de órgãos tardia em transplante cardíaco, renal e pulmonar.
Até agora, a patogênese subjacente do desenvolvimento da CAV permanece obscura, explicando por que as estratégias de tratamento eficazes estão atualmente ausentes e enfatizando a necessidade de modelos experimentais relevantes, a fim de estudar a fisiopatologia subjacente Formação CAV. O seguinte protocolo descreve um modelo heterotópico da transplantação do aortic do heterotópico do murine usando uma técnica modificada do punho da não-sutura. Nesta técnica, um segmento da aorta torácica é interposicionado na artéria carótida comum direita. Com o uso da técnica de manguito não sutura, um modelo fácil de aprender e reproduzível pode ser estabelecido, minimizando a possível heterogeneidade do micro anastomoses vascular suturado.
Introduction
Ao longo das últimas seis décadas, o transplante de órgãos sólidos evoluiu de um procedimento experimental para um padrão de atendimento para o tratamento da falência de órgãos em estágio final1. Devido à melhoria dos agentes antimicrobianos, técnicas cirúrgicas e avanço em regimentos imunossupressores, a taxa de sucesso precoce do transplante de órgãos sólidos aumentou significativamente nas últimas décadas2.
No entanto, as taxas de sobrevivência a longo prazo do enxerto não melhoraram significativamente da mesma forma3. O desenvolvimento da CAV é o principal fator que limita a sobrevivência a longo prazo4,5,6. Esta patologia é caracterizada pela formação de uma camada neointimal concêntrica composta por células musculares lisas, levando ao estreitamento progressivo do vaso e à malperfusão consecutiva do órgão sólido transplantado. Em receptores de transplante cardíaco, lesões CAV podem ser diagnosticadas em até 75% dos pacientes 3 anos após o transplante7.
A fisiopatologia da CAV ainda não é totalmente compreendida. Parece estar relacionado a inúmeros fatores imunológicos e não imunológicos, levando a danos endotélios com posterior ativação endotelial e disfunção8. Até agora, não existe opção de tratamento causal para a prevenção da CAV, enfatizando a necessidade de um modelo animal pequeno reproduzível, a fim de estudar a formação e potencial terapia da CAV.
Com o uso de modelos de transplante de aorta murine, CAV como lesões podem ser vistos 4 semanas após o transplante. Essas lesões consistem principalmente de células musculares lisas vasculares, assim, assemelhando-se à patologia humana. Devido a uma grande variedade de camundongos transgênicos e nocauteados, o uso de modelos de camundongos em patologias associadas ao transplante oferece uma oportunidade única para identificar novas opções terapêuticas e entender seu desenvolvimento. Devido ao pequeno diâmetro dos vasos transplantados no entanto, o uso de modelos de camundongos é comumente associado a curvas de aprendizagem longas e uma alta taxa de complicação inicial9. Com a introdução da técnica de manguito não sutura, esta parte mais desafiadora da operação pode ser facilitada e o diâmetro da anastomose é mantido constante10,11.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do ato alemão de bem-estar animal (TierSchG). (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).
1. Habitação animal
- Para experimentos, use camundongos C57BL/6 masculinos e BALB/c pesando 20-25 g com camundongos C57BL/6 como animais receptores e camundongos BALB/c como animais doadores.
- Compre os animais e a casa em uma instalação livre de patógenos de barreira, de acordo com as diretrizes felasa para monitoramento de saúde12.
- Mantenha os ratos em gaiolas padrão de Makrolon com material de nidificação do enriquecimento. Fornecer acesso ad libitum à água e alimentos pelleted em um ciclo de dia / noite de 12 h.
- Mantenha a temperatura ambiente em 22 ± 2°C e a umidade relativa em 55 ± 5%.
2. Preparação do destinatário
- Primeiro, anestesiar o animal receptor (C57BL/6) com injeção intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL).
NOTA: A profundidade correta da anestesia deve ser alcançada em 5-10 min.- Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar a profundidade da anestesia.
- Corte todo o cabelo da região lateral cervical com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos e aplique a pomada oftalmológico com cotonetes do algodão para impedir que os olhos sequem durante o procedimento.
- Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
- Incline a cabeça para trás e esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
- Faça uma incisão da pele da incisão jugular à mandíbula inferior direita com tesourapequena.
- Retire o lobo inferior direito da glândula submandibular através do cautery bipolar do pedicle da embarcação e da excisão subseqüente com microtesouras.
- Retire o músculo sternocleidomastoide direito através do cautery bipolar da porção superior e inferior e excisão subseqüente com microtesourapara ter acesso à artéria carótida comum.
- Mobilizar a artéria carótida comum, tanto destally e proximally quanto possível, puxando o tecido conjuntivo circundante para além com fórceps finos.
- Amarre duas ligaduras de seda 7-0 com distância mínima entre cada uma em torno do meio da artéria carótida comum e transect a artéria carótida comum com microtesourafina entre as ligaduras.
- Passe a extremidade proximal, ligada através do punho e conserte-o com uma braçadeira pequena da artéria.
NOTA: Os punhos que foram usados neste procedimento foram cortados com microtesouras de tubos de poliida com um diâmetro externo de 0,610 mm e uma espessura da parede de 0,0254 mm. Os punhos terminados tiveram um comprimento de ~2 milímetros com uma metade, que é usada para o processo cuffing, sendo um cilindro cheio e a outra metade, que é apertou, sendo um metade-cilindro. - Retire a ligadura com microtesoura fina, o mais próximo possível da ligadura, e lave o lúmen com soro salina heparinizada (50 IU/mL) com uma agulha de 30 G, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso.
- Distenda o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e sempre o coto carótida sobre o punho, puxando-o suavemente sobre o tubo de poliimida.
- Imediatamente corrigir o carótida everted com um loop de seda vagamente pré-amarrado 7-0.
NOTA: Vagamente pré-tie 4 7-0 loops de seda com um diâmetro de cerca de 1,5 mm antes da cirurgia para tornar o procedimento de algemas mais suave e mais fácil. - Realize o mesmo procedimento (2.10-2.13) na outra extremidade da artéria carótida.
- Defina o animal receptor de lado e hidratar o campo operativo com soro para soro até que o segmento da aorta é explantado.
3. Operação de doadores
- Anestesie o rato doador (BALB/c) da mesma forma que o animal receptor.
- Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar anestesia suficiente.
- Corte todo o cabelo da região abdominal e torácica com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos e aplique a pomada oftalmológico com cotonetes do algodão para impedir que os olhos sequem durante o procedimento.
- Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
- Esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
- Realize uma laparotomia abdominal midline com tesouras pequenas e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava de vena inferior (IVC).
- Injete a veia cava inferior (IVC) com 1 mL de soline heparinizado usando uma agulha de 30 G.
- Corte a aorta abdominal e IVC abaixo das artérias renais com pequenas tesouras para exsanguinate o animal doador. Vagamente colocar uma compressa no abdômen para absorver o sangue.
- Realize uma toracotomia no desvio bilateral das costelas com tesoura e incline a parede do peito anterior cranially com uma braçadeira cirúrgica para expor o mediastinum.
- Corte o IVC e o esôfago diretamente acima do diafragma com microtesoura.
- Retire o coração e os pulmões, inclinando-os para cima com fórceps segurando o ivc corte / esôfago e, em seguida, extirque-os com microtesouras de sua base para ter acesso à aorta torácica no mediastinum dorsal.
- Mobilize a aorta torácica de seu tecido circundante, separando o tecido conjuntivo circundante e gordura com fórceps finos, tendo o cuidado de não danificar quaisquer artérias intercostais.
- Cauterize todos os ramos da aorta torácica com fórceps bipolares cautery e extirpar o segmento da aorta entre o diafragma e o arco da aorta usando microtesouras.
- Nivele o segmento extótico da aorta com soro fisiológico heparinizado com uma agulha de 30 G, tomando cuidado para não danificar as paredes dos vasos, para remover qualquer sangue ou coágulos restantes e transferir o enxerto para o animal receptor.
NOTA: Coloque diretamente o enxerto da aorta na posição aproximadamente certa no destinatário durante a transferência. Se há uns problemas que confundem as extremidades diferentes da corrupção no animal receptor, uma ligadura frouxa em torno da extremidade distal poderia ajudar.
4. Implantação
- Puxe a extremidade proximal do segmento aórtico doador sobre o manguito proximal em cima da artéria carótida sempre com fórceps finos e imediatamente corrigi-lo com um loop de seda livremente pré-amarrado 7-0.
- Apare a extremidade distal, livre da corrupção aórtica com microtesouras de modo que o comprimento da corrupção caiba a distância entre os dois punhos.
- Repita o passo 4.1 do outro lado da aorta com o outro manguito para completar a anastomose.
- Retire a braçadeira distal para permitir a perfusão retrógrada.
- Depois de alcançar a hemostasis, retire a braçadeira proximal para completar a anastomose.
- Finalmente, feche a ferida com 6-0 sutura contínua.
5. Cuidados pós-operatórios
- Monitore o mouse de perto no primeiro 6 h após a operação e, em seguida, várias vezes ao dia para o primeiro 72 h após o transplante para detectar quaisquer complicações instantaneamente.
- Para a analgesia pós-operatória, injete o camundongo transplantado com buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) subcutâneamente diretamente após o transplante e, em seguida, a cada 12 h para 72 h para fornecer aalgesia apropriada e de longo prazo.
6. Explicações do enxerto aórtico
- Anestesia o animal transplantado com injeção intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL) 4 semanas após o transplante.
- Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar anestesia suficiente.
- Corte todo o cabelo da região abdominal, torácica e cervical com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos.
- Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
- Esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
- Realize uma laparotomia abdominal midline com tesouras pequenas e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava de vena inferior (IVC).
- Injete a veia cava inferior (IVC) com 1 mL de soline heparinizado usando uma agulha de 30 G.
- Corte a aorta abdominal e IVC abaixo das artérias renais com pequenas tesouras para exsanguinate o animal doador. Vagamente colocar uma compressa no abdômen para absorver o sangue.
- Faça uma incisão da pele da incisão jugular à mandíbula inferior direita com tesouras pequenas correspondentes à incisão da pele feita durante o procedimento da transplantação.
- Identificar o enxerto aórtico transplantado, juntamente com o manguito distal e proximal e blunt remover qualquer tecido circundante com fórceps.
- Usando microtesouras, corte através da artéria carótida comum distal e proximal ao enxerto aórtico com os punhos, a fim de explantar o enxerto aórtico, juntamente com as duas extremidades do punho.
- Corte o segmento da aorta ao meio e preserve os espécimes para análises adicionais (seções congeladas, seções embutidas de parafina, material congelado instantâneo)13,14.
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Representative Results
No modelo de transplante totalmente incompatível com O MHC, uma camada neoinsinual concêntrica pode ser vista 4 semanas após o transplante (Figura 2). Esta camada consiste primeiramente em pilhas lisas vasculares do músculo como a coloração imunohistological para SM22 (um marcador seletivo para pilhas suaves maduras do músculo) revelada. Como dito antes, estas pilhas lisas vasculares do músculo são pathognomonic para as lesões consideradas na vasculopatia crônica do allograft. Para análises posteriores, os segmentos da aorta devem ser seccionados e manchados por Elastica van Gieson-coloração. Aqui, a camada neoinsinual pode ser facilmente diferenciada às fibras elásticas da membrana elástica interna, dividindo a tunica intima da mídia Tunica.
Para avaliar um potencial efeito terapêutico neste modelo, a razão neointima-media, bem como o estreitamento da área transversal luminal, podem ser medidas nessas amostras seccionadas13,15. Em nosso modelo modificado descrito de transplante aórtico não sutura, uma taxa de sucesso técnico de >91% poderia ser alcançada em mais de 300 transplantes de aorta realizados. Esta alta taxa de sucesso poderia ser realizada usando um manguito feito de tubos de poliide com um diâmetro externo de 0,610 mm e uma espessura da parede de 0,0254 mm.
Figura 1: Fotos intraoperatórias. Cortea artéria carótida ligada. (B) Fim carótida apertado após a remoção da ligadura e rubor do fim com soro soro heparinizado. (C)Procedimento de algemas. (D)Preparação completa do destinatário (ambos carótidas terminam algemado). (E)Segmento de aorta transplantado antes e(F)após a refusão. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Espécime histológico de segmentos aórticos transplantados 4 semanas após o transplante. (A)Coloração imunohistológica representativa com SM22 (fluorescência verde) e DAPI (fluorescência azul) mostrando a espessa camada neoinsinual composta por células musculares lisas vasculares. As fibras elásticas são mostradas na fluorescência vermelha (ampliação 20x). (B) Elastica-van-Gieson coloração (ampliação 10x). (C)Segmento aórtico transplantado singênico 4 semanas após o transplante (ampliação 10x). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A vasculopatia aloenxerto crônica é a principal causa de perda tardia do enxerto após o transplante de órgãos sólidos do coração e provável renal e pulmão aloenxertos8. Até agora, nenhum regime terapêutico causal poderia ser desenvolvido a fim impedir a formação de CAV.
A fisiopatologia da CAV é multifatorial e envolve aspectos imunológicos e não imunológicos16. O uso de modelos de roedores no transplante tem sido essencial para entender a fisiopatologia subjacente dos processos de rejeição de aloenxertos no transplante de órgãos sólidos e ajudou a identificar novas abordagens terapêuticas que previnem a rejeição17 . Cav é caracterizada pela formação de uma camada neoinsinual consistindo de células musculares vasculares lisas levando a estreitamento consecutivo do vaso e maltranspiração do órgão transplantado com posterior deterioração da função do órgão7.
No modelo de transplante aórtico murine descrito, a formação neoinsinual concêntrica pode ser observada em enxertos de aorta totalmente MHC (H-2d a H-2b)incompatíveis com enxertos aórticos torácicos 4 semanas após o transplante. Essas lesões consistem principalmente em células musculares lisas vasculares (Figura 2). Shi et al. descreveu o primeiro modelo de rato de arteriosclerose transplante em 199418. Eles enxertaram um segmento de artéria carótida para a artéria carótida por sutura lateral. Em 1996, Koulack et al. estabeleceram o primeiro modelo de transplante aórtico do camundongo abdominal, enxertia ndo um segmento da aorta para a aorta infra-renal por anastomose de ponta a ponta19. Dietrich et al. descreveu pela primeira vez o uso de uma técnica de manguito não-sutura para o transplante de um segmento de aorta torácica para a artéria carótida em 200011.
Em comparação com modelos de camundongos usando anastomose microvascular para transplantar segmentos da aorta, a técnica de manguito oferece vários benefícios. Primeiro, o procedimento é mais simples e mais fácil de aprender. Em segundo lugar, o tempo isquêmico do segmento aórtico enxertado é constante, uma vez que o animal receptor é preparado primeiro para a anastomose antes da realização da aquisição do segmento aorta do doador, minimizando o tempo de isquemia frio e quente. Em terceiro lugar, o diâmetro da anastomose é mantido constante devido ao caráter rígido do punho do poliimide. Assim, restrições da região anastomótica podem ser negligenciadas.
Além disso, o procedimento cirúrgico é menos traumático para o animal receptor em comparação com a técnica com a incisão abdominal. Além disso, a implementação da técnica de manguito oferece a possibilidade de vários tipos diferentes de transplante de órgãos sólidos ao usar a mesma técnica no animal receptor11,20,21.
Mesmo que nós estejamos convencidos que esta técnica microsurgical é mais fácil de aprender do que outros modelos da transplantação aortic descritos na literatura há algumas armadilhas possíveis durante o procedimento. Durante a operação do receptor, certifique-se cauterizar corretamente o músculo sternocleidomastoid antes de cortá-lo. O músculo é bem vascularizado e sangramento grave pode ocorrer se os vasos que acompanham não são completamente coagulado. Estes sangramentos são difíceis de controlar como o músculo vai se retrair uma vez totalmente dissecado. Além disso, ao mobilizar a artéria carótida comum, certifique-se de não pegar diretamente a artéria em si.
O procedimento do punho próprio é a parte a mais desafiante da operação por muito e a mais suscetível à falha. É, portanto, vital trabalhar com o comprimento certo da artéria carótida. No início, os cirurgiões tendem a preparar muito pouco comprimento da artéria carótida, o que torna o procedimento muito mais difícil de concluir. Além disso, no início, os cirurgiões tendem a definir a ligadura divisória em torno da artéria carótida comum bem no meio do campo operacional. Isso pode levar a dificuldades durante a realização do manguito localizado mais craniano como este segmento final carótida é bastante rígida e difícil de mobilizar. Enquanto isso, uma parcela significativa da artéria carótida comum pode ser mobilizada por ligeira tensão da área abaixo da clavícula. Portanto, sugerimos que a proligação da artéria carótida seja ligeiramente mais proximally para deixar mais comprimento para a parte craniana da artéria carótida comum. Uma vez que a artéria carótida comum é dissecada e as extremidades são passadas através dos punhos e fixadas com as grampos vasculares, a dilatação da artéria carótida deve ser executada. Nesta parte da operação, é muito importante não sobrecarregar o vaso, pois isso pode danificar a parede do vaso, levando à falha durante o procedimento de algemas. Girar todo o campo operacional para que a tração esteja de acordo com o alinhamento da braçadeira arterial no manguito facilita o procedimento.
Ao adquirir o segmento da aorta, não seja certo rasgar para fora todas as artérias intercostais ou outras filiais do aorta torácico. Por outro lado, tome cuidado para não cauterizar muito perto da aorta torácica, a fim de evitar danos do enxerto com aumento do risco de trombose do enxerto após o transplante.
Ao implantar o segmento da aorta, certifique-se de que ambas as extremidades estão devidamente alinhadas, a fim de evitar a torção do enxerto. Além disso, o segmento da aorta deve ser encurtado ao comprimento correto para evitar o kinking durante a reperfusão. Ao reperfusing a corrupção, seja certo abrir sempre a braçadeira mais craniana primeiramente para observar a hemostasis. Pequenas hemorragias de artérias intercostais não completamente coaguladas podem ser controladas aplicando pressão suave com um pequeno cotonete.
Todo o transplante deve levar menos de uma hora com máximo de 30 minutos para a preparação do destinatário e no máximo 15 minutos cada para a operação e implantação do doador.
A desvantagem mais discutida deste método é que o punho persistirá na anastomose durante a duração do experimento. Isso poderia levar a uma certa reação do corpo estranho e um possível maior risco de trombose. Entretanto, as análises histopatológicas dos espécimes transplantados com a técnica do punho revelaram somente a reação extrangeira suave do corpo da corrupção e da tubulação22. Outra limitação discutida do procedimento é a colocação heterotópica da aorta torácica na artéria carótida comum. Devido aos diferentes diâmetros dos vasos entre a aorta torácica e a artéria carótida comum, pode-se esperar um fluxo mais turbulento no segmento da aorta transplantada em comparação com um interposicionamento ortopépico aórtico. Isso pode levar a mudanças insinuais metódicas baseadas. No entanto, segmentos transplantados singênicos revelaram apenas pouca formação de neointima descartando um viés metódico (ver Figura 2).
Este artigo tem como objetivo facilitar a implementação deste modelo por outros pesquisadores em seus laboratórios. Com as modificações acima mencionadas, este modelo do rato da transplantação aórtica pode ser realizado com habilidades microsurgical básicas, ao conseguir uma taxa de sucesso elevada.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb-c Mice (H2-d) | Charles River | Strain# 028 | Donor animal |
| Bipolar cautery system | ERBE | ICC 50 / 20195-023 | Bipolar cautery |
| C57BL/6J (H-2b) | Charles River | Strain# 027 | Recipient animal |
| Halsey Needle Holders | FST | 12501-12 | Needle Holder |
| Halsted-Mosquito Forceps | AESCULAP | BH111R | Curved Clamp |
| Medical Polyimide Tubing | Nordson MEDICAL | 141-0031 | Cuff-Material |
| Micro Serrefines | FST | 18055-04 | Micro Vessel Clip |
| Micro-Adson Forceps (serrated) | FST | 11018-12 | Standard Forceps |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | FST | 18057-14 | Clipapplicator |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°) | S&T | 00649-11 | Fine Forceps |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm) | S&T | 00125-11 | Vesseldilatator |
| Schott VisiLED Set | Schott | MC 1500 / S80-55 | Light |
| Stereoscopic microscope | ZEISS | SteREO Discovery.V8 | Microscope |
| Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | 91460-11 / 14001-12 | Standard Sissors |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm) | FST | 15004-08 | Microsissors (curved) |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm) | FST | 15003-08 | Microsissors (straight) |
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