Summary
这里介绍的是一个协议，使用CRISPR-Cas9系统减少成人蜜蜂大脑中蛋白质的产生，以测试抗体特异性。
Abstract
集群定期间隔短蛋白重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）是一种基因编辑技术，广泛用于基因功能研究。本研究中我们使用这种方法来检查针对昆虫GABAA受体亚单位对二鹿类药物（RDL）和代谢性谷氨酸受体mGlutR1（mGluRA）开发的抗体的特异性。这些抗体是在兔子体内产生的，针对果蝇（果蝇）和蜜蜂（阿皮斯·梅利韦拉）特有的偶联肽。我们在蜜蜂大脑部分使用这些抗体来研究蜜蜂大脑中受体的分布。抗体对肽进行亲和纯化，并采用免疫印迹和与肽结合的经典抗吸法进行试验，表明抗体与产生抗体的相应肽结合物是特定的。在这里，我们开发了CRISPR-Cas9技术，以测试CRISPR-Cas9注射后48小时大脑中蛋白质靶点的减少，并结合为相应受体设计的导引RNA。CRISPR-Cas9 方法也可用于成年蜜蜂的行为分析，当一个或多个基因需要修改时。
Introduction
最近发现的CRISPR/Cas9系统是一个强大的工具，已被用来改变基因组DNA的各种模型系统和生物体。它通过使基因组修饰比以前更有效率和鲁棒性的方法，加速了生物医学研究和重大技术突破。该系统原生于S.pyogenes细菌，它依赖于Cas9内糖酶，其活性导致DNA中的双链断裂（DSBs），以及引导RNA（gRNA），将Cas9蛋白引导到特定的，序列依赖性的位置2。CRISPR/Cas9 产生的双链中断可通过非同源端连接 （NHEJ） 进行修复，这是一个容易出错的过程，可导致帧移位，或在存在供体模板时进行同源直接修复。gRNA本身由靶类特异性CRISPRRNA（crRNA）和一种通用的转活crRNA（楚尔RNA）组成，可进行化学合成，并随纯化的Cas9核酸酶一起作为核糖核蛋白复合物（RNP）2、3。gRNA或Cas9核酸酶的荧光标记可以通过荧光显微镜4检测和细胞内分子成分的可视化。
在目前的工作中，我们利用CRISPR-Cas9系统来降低成年蜜蜂大脑中的蛋白质水平。我们研究了代谢性谷氨酸受体（mGluR）和抗mGgR1受体抗体以及GABAA受体亚单位RDL和抗RDL抗体。我们开发了一种减少成年蜜蜂大脑中蛋白质含量的简单方法，并用它来驱动针对相应蛋白质开发的抗体的额外测试。监测CRISPR-Cas9的荧光使我们能够估计减少蛋白质所涉及的区域和细胞。
利用这种方法，我们还对兔子体内针对偶联肽的抗mGgR1抗体进行了定性。蜜蜂基因组编码高度保守的AmGluRA（根据NCBI命名法命名为mGGR1）代谢性谷氨酸受体5。根据NCBI数据库，蜜蜂mGlutR1基因有4个预测的拼接变异。据报道，它表现在中枢神经系统（CNS）的普宝和成年蜜蜂阶段，它参与长期记忆形成5。针对mGlutR1开发的抗体是研究蜜蜂学习和记忆过程中谷氨酸系统的重要工具。
在我们的研究中，我们还对兔子中产生的抗RDL抗体进行了定性，这些抗体与来自Apis mellifera RDL受体亚单位的结合肽免疫。蜜蜂Rdl基因，AmRdl（XM_006565102.3，NCBI数据库），有14个预测的拼接变异。 NCBI 数据库 AF094822.1 中报告了部分克隆片段。RDL受体功能及其生理学在昆虫6，7，8，包括蜜蜂9，10，11中得到了很好的研究。抗RDL开发的抗体是研究蜜蜂学习和记忆过程中GABAergic系统的重要工具。
早先对八角胺和酪胺受体的作用的研究使用RNAi注射到大脑中，随后通过西体斑点12、13对蛋白质的含量进行了测试。然而，RNAi有一些显著的局限性。在RNAi注射后只有很短的时间窗口，其中蛋白质的减少发生13。CRISPR-Cas9最近被用于蜜蜂胚胎，删除或修改整个动物14、15、16的基因。我们报道了使用CRISPR-Cas9来减少成年蜜蜂中蛋白质的含量。我们为蜜蜂开发了这种方法，因为它能够将其与受控实验室条件下学习和记忆的行为研究结合使用17。
在目前的工作中，我们针对两个受体开发了抗体，并在CRISPR-Cas9注射减少蛋白质后，在成年蜜蜂大脑部分对其进行了测试。同时，我们建立了一个实验设计，允许使用该方法进行行为实验。
Protocol
此处描述的协议遵循亚利桑那州立大学的动物护理指南。
1. 从阿皮斯梅利韦拉大脑完全蛋白质分离
注：使用阿皮斯·梅利韦拉新世界卡尼奥兰觅食者未知年龄的这个实验。
- 在蜂巢入口放置一个铝网屏，以捕捉前兆蜜蜂17。将每一蜜蜂捕获到小瓶中，每个瓶盖上有一个小孔。将装有蜜蜂的小瓶放入冰中，以降低其体温并固定它们。将蜜蜂留在冰上不超过3分钟。
- 将固定的蜜蜂固定到先前准备好的金属支架中。确保金属支架的构造，以便蜜蜂可以使用小块胶带固定，但仍有其后胸、翅膀和头部暴露。
注意：在尝试将蜜蜂置于支架中之前，请确保蜜蜂完全固定。 - 使用 5 mL 注射器用 1 M 蔗糖溶液喂蜜蜂，直到它们不再饥饿。将固定的蜜蜂放在装有湿纸巾的盒子里，以确保环境潮湿。
- 用巴拉克尔虹膜剪刀（见材料表）快速切除蜜蜂的大脑，用剪刀从前面打开头部。
- 切断大脑从头部胶囊，采取#5钳子的大脑，并将其放置在100μL的冷（4-8°C）的开瓶缓冲液。莱沙缓冲液由 120 mM Tris-HCl 组成， 2% 硫酸二钠 （SDS）， 5% 甘油， 0.2 mM 二硫磷醇， 1% Triton X-100， 和 1-5 μg/mL 的蛋白酶抑制剂 PMSF （苯基甲基硫磷脂）， 丙氨酸， 苯甲酰胺 （pH 6.8） 在 4 °C.通过在一个虫子中转动大约2分钟，使大脑在解液溶液中均匀化。
- 在12，000 x g下离心样品20分钟。将上清液的吸气90μL吸气，并丢弃颗粒。
- 取1μL的上清液，使用荧光计定量总蛋白质。总蛋白质的大约浓度为每只蜜蜂2-3毫克/毫克。取上清液10μL，加入10μL的莱沙缓冲液和10μL的6x莱姆利缓冲液18。短暂旋转并煮3分钟，然后在冰上冷却。在 10，000 x g下旋转 1 分钟，以清除所有碎屑。十分之一的蜜蜂大脑含有大约25纳克的总蛋白质。
2. 西印19
- 使含有 12.15 mL 的超纯蒸馏水的 10% 跑步凝胶达到 30 mL， 7.5 m M Tris-HCl （pH 8.8），0.3 mL 10% SDS，10 mL 30% 丙烯酰胺溶液，0.15 mL 10% 过硫酸铵 （APS），以及 20 μL 的四甲基二胺 （TEMED).
- 在两个由垫片隔开的玻璃板之间铸造凝胶。
- 制作含有12.1 mL超纯蒸馏水、5.0 m L 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、0.2 mL 10% SDS、2.6 mL丙烯酸乙酰丙烯酰胺、0.1 mL 10% APS和 20 μL的 TEMED 的 20 mL 堆叠凝胶。
- 当运行的凝胶凝固时，倒入堆叠凝胶。小心地添加塑料分离器以铸造装载通道，避免气泡。等待 15-30 分钟，直到凝胶凝固。
- 使用 5 μL 的蛋白质标准开始加载凝胶。每车道步骤1.8加载20μL的酸莉酸混合物，对应于蜜蜂大脑的±1/15或每条通道总蛋白质的±16 ng。在堆叠凝胶中运行样本总值为 3.5-4 h，在堆叠凝胶中运行 32 mA。当染料离开凝胶时停止。
- 将蛋白质转移到转移缓冲液中的硝化纤维素膜（25 mM Tris-HCl，192 mM 甘氨酸，15% 甲醇），在 0.45 mA 下在 4°C 下传输 1 小时 30 分钟。
- 为了在免疫镀金前评估SDS-PAGE后蛋白质转移的效率，添加Ponceau S染色溶液（向水中加入0.1克Ponceau S和5 mL醋酸，最终体积为100 mL）。储存在4°C下1分钟，用蒸馏水快速冲洗。
- 用圆珠笔标记每个车道，切割包含两条带脑均质的通道和一条带有蛋白质标记的通道的膜，并将每个通道放入一个西体斑点孵育盒中。在含有0.1%补间20（PBS-Tw）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，每洗3次5分钟。
- 用10%NGS（1mL的普通山羊血清至10mL的PBS-Tw）在西斑孵育盒中块膜1小时。使抗mGlutR1稀释（5μL抗体在10 mL中，10%NGS）。使抗RDL1和抗RDL2稀释（5μL抗体在10mL10%NGS每个）。用稀释的抗体替换每个包装盒中的阻滞溶液，并在4°C下过夜（16-24小时）。
- 在PBS-Tw中，将膜每洗3次5分钟，在室温（RT）下，用1：10，000在10%NGS PBS-Tw中孵育膜，用抗兔子IgG HRP-结合二级抗体孵育膜2小时。在 PBS-Tw 中清洗膜 3 倍，在 PBS 中洗 1 倍。
- 使用西方化学发光HRP基板检测带。在RT处混合两个基板1：1（v/v），将所有膜放在同一个盒子里，并用基板混合物覆盖2分钟（在暗室中，有红灯）。通常一个抗体在一个膜上测试，在两个或三个通道和一条带有重量标记的通道上含有相同的大脑均质稀释。
3. 免疫细胞化学程序
- 解剖蜜蜂的大脑进行免疫细胞化学，将蜜蜂固定在冰中30s。蜜蜂被固定后，用剪刀将蜜蜂斩首，并将头部放入PBS中4%的甲醛溶液中。在烟罩下工作。
注意：身体必须小心处理，因为被斩首后腹部仍可能刺痛。 - 小心但迅速删除天线，复合眼睛，并削减所有的顶部外骨骼与Barraquer虹膜剪刀。让头部在固定溶液中坐10分钟。取出头部外骨骼的其余部分，并切下所有剩余的气管。
- 将每个大脑放入含有至少1 mL 4%甲醛溶液的1.5 mL微离心管中，并在4-8°C下过夜。
- 将 3.8 克的甘蔗和 50 mL 的蒸馏水混合在 Erlenmeyer 烧瓶中，制作 7.6% 的甘草溶液。微波溶液，直到甘蔗液化。
注：可在烧瓶开口放置一小片纸巾，以防止在加热过程中使格贺花溶液溢出。 - 将固定的蜜蜂大脑（3-4个大脑）放入35毫米培养皿中，用纸巾去除多余的固定剂。将液体甘蔗溶液倒在大脑上。将大脑定向到绞叶中，使天线叶朝上。让糖冷却和凝固。
- 在阿加罗斯凝固后，切出含有大脑的甘蔗块。
- 对于振动孔切片，准备一个24孔板，每口井都装有一个篮子，底部有一个疏水网。用 600 μL 的 PBS 填充每个井。
- 使用振动器将每个截块切成 70 μm 横截面，并将截面放入包含 PBS 的篮中。
注：确保同一大脑的部分放在同一个篮子中。 - 用PBS-TX清洗大脑部分6次，每次10分钟，以确保各部分没有固定性残留。将多孔板放在轨道摇床上，以 210 rpm 转速洗净大脑。每次清洗前，请务必使用新鲜的 PBS-TX 解决方案替换 PBS-TX 解决方案。在最后一次洗涤时用1%正常驴血清块。
- 要测试抗mGGR1原抗体，通过在15 mL离心管中加入9 mL的PBS-TX抗mGR1抗体，制备1：112稀释抗mGGR1抗体。旋管短暂混合彻底。初步实验确定了抗体的工作稀释。
- 要测试抗RDL原抗体，在15 mL离心管中加入30μL的抗RDL肽1、30μL抗RDL肽2和6 mL的PBS-TX，制备1：100稀释抗RDL抗体。旋管短暂混合彻底。初步实验确定了抗体的工作稀释。
- 在板中的每口孔中加入800μL的抗体溶液。盖上多孔板并将其包裹在铝箔中，以防止光线照射导致降解。将包裹在铝箔上的板放在轨道摇床上，在 210 rpm 转速下摇动 2 小时。然后在RT过夜，不摇晃。
- 大脑部分过夜后，用PBS-TX清洗10分钟。重复洗涤步骤6倍。
- 通过在PBS-TX的9 mL中加入40μL的二级抗体，对二级抗体进行1：225稀释，制备二级抗体（来自驴的抗兔子）。
- 在每个井中加入800 μL的二次抗体稀释剂。盖上盘子，用铝箔包住。将包裹在铝箔上的板放在轨道摇床上，在 210 rpm 转速下摇动 2 小时。然后在RT过夜。
- 用PBS-TX清洗大脑部分3次，每次10分钟，用常规PBS溶液清洗3次。
- 要嵌入幻灯片中的部分，请准备从罗德里格斯等人20 中修改的安装介质/甘油嵌入溶液。在 20 mL PBS 中加入 5 g 的安装介质，用磁性搅拌器搅拌 16 小时。加入10 mL的甘油，用磁性搅拌器搅拌16小时。在4000 x g下离心15分钟，取液体均质上清液，在1mL管中等分。保持在-20°C
- 将部分嵌入到幻灯片上，并滴下步骤 3.17 中准备的安装介质，确保每张幻灯片包含来自一个大脑的部分。
- 结合肽免疫染色的增减控制
- 对于抗RDL和结合肽，通过谷醛在RT上孵化与相应的肽结合的抗RDL抗体的工作稀释：条件1）500μg肽与键孔林普血亚宁（KLH）通过谷醛结合;条件 2） 没有任何偶联。
- 在10，000 x g下将每种混合物离心10分钟，并从这两个条件下收集上清液（步骤3.19.1）。
- 用每个上清液孵育蜜蜂大脑的序列部分，并处理上述二级抗体。串行部分是在振动分块过程中相互遵循的部分，因此大脑的同一部分将暴露在正负对照下。
- 对于抗mGlutR1和偶联肽，在RT与含有10-4M肽（条件1）的KLH结合肽（条件1）和没有任何偶联（条件2））的抗mGGR1抗体的工作稀释。
- 在 10，000 x g下将每种混合物离心 10 分钟，并从两个对照组收集上清液。
- 用二级抗体（步骤3.14-3.15）从条件和过程中用上清液孵育蜜蜂大脑的序列部分。
- 使用嵌入介质将两个条件的节嵌入到幻灯片上（步骤 3.17）。
4. 在相应的CRISPR-Cas9系统注射后，在蜜蜂大脑中通过免疫细胞化学（第3节）对RDL和mGlutR1蛋白表达的测试
- 使用在线CRISPR-Cas9设计工具21使用AmRdl（XM_006565102.3）的基因组DNA序列和mGlutR1（XM_006566244.3）序列设计指南（表1）。在 5' 末端使用荧光染料 ATTO550 订购为 Cas9 crRNA 和 Cas-9 tracRNA。订购 Cas9 核酸酶 V3（参见材料表）。
- 使用无核酸酶水制作每个导引crRNA和tracRRNA的100 μM库存，为CRISPR-Cas 9系统制备组件。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。通过在47.5 μl无核苷酸缓冲液中加入2.5 μL Cas-9溶液，制备Cas-9溶液的工作浓度，以获得0.5μg/μL的最终浓度。使gRNA和RNP用于注射。
- 分别为每个导引RNA制备gRNA复合型（指南RNA：tracRNATO550）
- 用gRNA名称标记试管，加入92μL的无核苷酸缓冲液，4μL的100μM CRISPR-Cas9 tracrRNA-5'ATTO550，4μL的导引crRNA溶液。轻轻混合并旋转。
注：RDL的gRNA管标记示例：GRDL1、GRDL2、GRDL3（与表1中的RDL指南RNA相对应）。mGlutR1 的 gRNA 管标签示例：GMGL1、GMGL2、GMGL3（表1）。 - 将溶液加热至95°C5分钟，形成gRNA。在 RT 处冷却混合物 10 分钟。
- 用gRNA名称标记试管，加入92μL的无核苷酸缓冲液，4μL的100μM CRISPR-Cas9 tracrRNA-5'ATTO550，4μL的导引crRNA溶液。轻轻混合并旋转。
- 准备RNP复杂形成（gRNA：S.p Cas9核酸酶），输送混合物和控制。
- 用RNP名称标记试管，加入6μL的gRNA溶液和6μL的0.5μg/μL S.p Cas9核酸酶V3。在注射前，在37°C下轻轻混合并孵育溶液10分钟。
注：RNP管标签示例：RRDL1、RRDL2、RRDL3。 - 制作 RNPRDLmix。要制备用于注射的最终混合物，请从 RDL 中加入每个 RNP 的 4 μL。RNP/RDL 组合 = 4 μL RRDL1 = 4 μL RRDL = 4 μL RRDL3。
- 制作 RNPmGlutR1 混合。将 mGlutR1 中每个 RNP 的 4 μL 混合在一起，制备用于注射的最终混合物 （RNPmGlutR1mix） = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3。
注：RNP管标签示例：RMG1、RMG2、RMG3。 - 通过混合4μL的沙子RNA、92μL的缓冲液和4μL的水代替导引RNA（参见第4.3节），使控制无导RNA溶液。混合6μL的这种无导RNA溶液和6μL的0.5微克/μL Cas9核酸酶V3（步骤4.4.1）以产生对照注射溶液。
- 用RNP名称标记试管，加入6μL的gRNA溶液和6μL的0.5μg/μL S.p Cas9核酸酶V3。在注射前，在37°C下轻轻混合并孵育溶液10分钟。
5. 注射程序
- 如步骤 1.3 所述，固定每个蜜蜂，并像步骤 1.4 中那样喂它们。接下来，准备两套两个木箱，在注射后将蜜蜂释放到其中：一个白色盒子（实验条件）和一个黑匣子（控制）。每个盒子应包含一个小梳子和一个喂食培养皿。每个盒子的一侧由玻璃制成，以便进行观察。
- 制作喂培养皿。取35毫米培养皿的盖子，将蜡放在表面内，并将培养皿的底部放在蜡上。将板固定到包装箱中。
- 使用 5 mL 注射器，在盖和盘底之间注射 1M 蔗糖溶液。蜜蜂可以迅速在两个板块之间放上前体，并持续干燥48小时。在每个盒子里放一道菜。
- 要准备显微注射系统，请用矿物油填充毛细血管，没有任何气泡。将毛细管放在显微喷射系统的喷油器支架中。要将毛细管装上所需的注射溶液，在平坦的表面上放置疏水膜，并将溶液移液到其上。从毛细血管中注入油，用相应的 RNP 混合物替换混合物。
- 使用显微注射系统，将345 nL的RNP混合物溶液直接注射到每一蜂的中间奥切利中。
- 对于 RDL-CRISPR-Cas9 注射，使用步骤 4.4.2 中所述制备的 RNPRDLmix 注射 8 只蜜蜂。注射后喂他们1M蔗糖。用小梳子在白色（实验）盒中释放它们，喂食培养皿48小时。使用另外八只蜜蜂作为对照，无需任何注射，喂食它们，并在黑色（对照）盒中释放它们。
- 对于 mGlutR1 CRISPR-Cas9，使用步骤 4.4.3 中所述制备的 RNPmGGR1mix 注射 9 只蜜蜂。对于对照注射8只蜜蜂的RNA混合物，无需按照步骤4.4.4所述制备导引（RNAmix_noguide）。注射后喂他们1M蔗糖。将蜜蜂从支架中释放到白盒（实验条件）或第 5.1 节中所述准备的黑匣子（控制）。
- 将箱子放入聚苯乙烯容器内，内装有湿纸，以便进行湿度处理。让蜜蜂离开48小时，每天观察2次，以确保它们有足够的食物和良好的湿度。
- 在48小时（步骤3.1）后解剖每只蜜蜂的大脑，并进行免疫细胞化学，如第3节所述。对于抗 mGlutR1 免疫染色使用步骤 3.11 和抗 RDL 免疫染色使用步骤 3.12。
- 执行共聚焦成像以评估免疫染色大脑部分的荧光水平。
- 为了评估免疫标记大脑中蛋白质的减少，在相同增益水平上使用共聚焦图像集合来控制和注射大脑。
6. 基于qPCR的落体测定，用于在CRISPR Cas9 RNPRDLmix注射后评估经过修饰的基因组RDL DNA 48 H
- 设计引材、控制探针和落水探头，以评估CRISPR-Cas9注射修饰的DNA量。每个引物的设计，使其侧翼至少一个CRISPR-Cas 9导板和放大剂大小为132 bp。使用的引注和探针如下：
RDL1_For：CTCGGGACCATAT
RDL1_Rev：中国民航总局
RDL1_control_probe： /5HEX/CGA_C_G_TTT_A_C_CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe： /56-FAM/CCTA_C_G_T_CA_A+GT/3IABkFQ/- 确保引种对应于特定于区域的唯一序列。确保落客探头是为与 RDL-CRISPR-Cas9 导引体重叠的区域设计的。
- 要测试引导区域中的 gDNA 是否进行了修改，请使用步骤 5.3.1 中描述的RNP_RDL混合在 ocelli 中注入 12 个蜜蜂，并使用 8 个未注入的蜜蜂作为对照。
- 注射后，在没有视叶48小时后取出没有视叶的蜜蜂大脑，并按照制造商的协议（见材料表）使用试剂盒提取每个注射的蜂脑的gDNA（不含视叶）。
- 使用分光光度计评估提取的gDNA的数量、质量和纯度。
- 使用基于qPCR的落客协议和实时PCR循环器量化AmRDL改性gDNA的相对表达。
- 将寡聚物重新悬浮到100μM，将底漆稀释至10μM，将探针稀释至5μM。
- 设置96孔板中的PCR反应，如此处所示为gDNA的一个样本（3个重复）：10 μL的主混合物（见材料表），1 μL的正向底漆，1μL的反向引物，1μL的控制探针，1μL的下降探针，2μL的gDNA（50 ng），4μL的无核酸酶水，使最终反应体积达到20μL。
注： 控件是解决方案，而不是样品和水，而不是探头。 - 设置循环程序如下，用于实时 PCR 循环器：95 °C 3 分钟，然后是 40 个循环 95 °C 15 秒，60°C 1 分钟。
- 使用 2-+Ct方法评估相对基因修饰，其中
和
和
7. RNPRDLmix注射后RDL RNA 48 H的相对定量
- 要测试 RDL mRNA 是否减少，在 ocelli 中注入 20 个蜜蜂，RNP_RDL混合，如步骤 5.3.1 所述，并使用 12 个未注入的蜜蜂作为对照。注射后48小时，从每只注射的蜜蜂中提取总mRNA，并使用制造商的协议分离（见材料表）。
- 使用无DNA试剂盒清除样品中残留的任何DNA残留物（见材料表）。
- 使用分光光度计评估提取的RNA的质量和纯度。
- 使用市售的荧光绿色RT-PCR试剂盒（材料表）在实时PCR循环器上使用制造商对384孔板的协议量化AmRDL的表达。
注：在本实验中，使用了以前发布的引信。对于AmRDL （AmRDL_F GGTCGATGGGCTATATATATATATTG;AmRDL_RTCGATATATATTCGCGTAGGA22和作为参考基因的引物[AmActin_FTGCCAACACTCTTTTTTG;AmActin_R大会23日。使用2-+Ct方法（步骤6.6）计算了相对基因表达。
8. 基于qPCR的落体测定，用于在RNPmGlutR1mix注射后评估修饰的基因组DNA48 H
- 设计引材、控制和落水探头，以评估CRISPR-Cas9注射修饰的DNA量。设计引物，使其侧翼至少一个CRISPR-Cas 9导板，放大子尺寸为96 bp。
mGlutR1_For： GGTGAAACGAACGAGGAGGA
AmGlurR1_Rev：加加加加加加加加加加加
AmGlurR1_control_probe： /5HEX/CGAGG_G_AAA_CGA_GT/3IABkFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe： /56-FAM/CGA_C_A_C_CG_TC/3IABkFQ/
注： 确保引信对应于特定于应修改的区域的唯一序列。跌落探头设计用于与 CRISPR-Cas9 导轨重叠的区域。 - 要测试引导区域中的 gDNA 是否进行了修改，请使用步骤 5.3.1 中所述的 RNP_ GlutR1 混合物在 ocelli 中注入 12 个蜜蜂，并使用 8 个未注入的蜜蜂作为对照。
- 注射后48小时，从每个注射的蜜蜂大脑（无视叶）取出gDNA，并使用制造商的协议控制蜂脑（无视叶）（见材料表）。
- 使用分光光度计评估提取的gDNA的数量、质量和纯度。
- 使用 qPCR 下降协议和实时 PCR 循环器，量化 gDNA AmGlutR1 的相对修改，如步骤 6.5 中所述。
- 使用 2-+Ct方法评估相对基因修饰，其中
和
和
9. RNPmGlutR1混合注射后mGlutR1 RNA 48 h的定量
- 要测试 mGlutR1 RNA mRNA 是否减少，请使用步骤 5.3.2 中所述的RNP_RDL混合物在 ocelli 中注入 6 只蜜蜂，并使用 6 只未注射的蜜蜂作为对照。注射后48小时，从每只注射的蜜蜂中提取总mRNA，并使用制造商的RNA分离协议分离蜜蜂大脑（无视叶）48小时（见材料表）。
- 使用无DNA试剂盒清除样品中残留的任何DNA残留物（见材料表）。
- 使用分光光度计评估提取的RNA的质量和纯度。
- 使用 SYBR 绿色 RT-PCR 套件（参见材料表）在实时 PCR 循环器上使用为 384 井套件提供的协议量化mGlutR1的表达。使用以下引物为mglutR1（mGlut_FCCCCCACGTCTCTCTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTA;mGlut_RTGCCGTGTGTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttttttttttt和actin引物经物作为参考基因[AmActin_FTGCCAACACTGTCTTCTG; AmActin_RGAATGACCACACACACA]。使用 2-+Ct方法（步骤 8.6）计算相对基因表达。
Representative Results
抗RDL抗体测试
抗体针对RDL肽结合物产生，如图1A所示。描述抗RDL抗体的第一步是检查从蜜蜂大脑中提取的蛋白质的同质性，使用带有抗RDL抗体的西方斑点和HRP标记的山羊抗兔子IgG二级抗体（图1A，插入）。两种抗RDL抗体都识别了位于+50-60 kD（箭头）的带，对应于RDL亚基异形蛋白的估计重量。为了证明抗RDL抗体识别了脑切片中的肽，我们使用了一种阅读吸附控制（图1B，C）。当抗体与偶联肽一起孵化时，该部分的染色不存在。这表明抗RDL抗体识别了它们被升高的偶联肽。为了证明抗RDL抗体能识别固定脑组织中的蛋白质，我们使用CRISPR-Cas9敲除在细胞中产生RDL蛋白的RDL基因。图1D1-3显示了与抗RDL抗体标记的控制前蜂脑部分。这种蜜蜂没有注射RDL-CRISPR-Cas9 RNP。在图1D1中，抗RDL标记蜜蜂大脑前部的神经毛。图 1D2中的同一正面部分显示 ATTO550 没有荧光，因为 RDL-CRISPR-Cas9 复合物未注入。
图1E1-E3显示了注射RDL-CRISPR-Cas 9的蜜蜂的大脑部分，然后用与图1D1-D3中对照脑相同的抗体进行处理。注射后48小时，整个大脑的抗RDL染色明显减少，ATTO550染色在大脑中的分布（图1E2）显示了RDL-CRISPR-Cas 9注射在蜜蜂中位数中的成功。大脑的多个分散细胞表现出ATTO550。与对照控制相比，RDL-CRISPR-Cas 9的成功注射降低了蛋白质表达（图1E1-3）。从8个免疫染色的蜜蜂大脑中，只有一个大脑在蘑菇体、原脑细胞和天线叶的细胞中具有RDL-CRISPR-Cas9的高分布水平，而其他大脑在蘑菇体内有ATTO550的细胞染色，中央复合物，但不是天线叶。值得注意的是，在这些蜜蜂中，减少抗RDL免疫染色没有图1E1所示的大脑那么剧烈。
接下来，为了估计RDL-CRISPR-Cas9注射后48小时蜜蜂中经过修饰的RDL gDNA的含量，我们进行了qPCR落水测试，其中落水探头的设计与RDL gRNA的面积相匹配。在这些实验中，在注射RDL-CRISPR-Cas 9的蜜蜂大脑中，荧光的相对减少与样品中修饰的gDNA数量相对相对相对相对。在我们的测试中，注射RDL-CRISPR-Cas9的12个蜜蜂中与gDNA对应的区域为64%+（均值=30%SD），而无注射蜜蜂中的gDNA（图3A）。
接下来，为了估计注射后48小时蜜蜂中RDL RNA的水平，我们在一个单独的蜜蜂组中进行了qRT-PCR（图3B）。我们比较了RDL-CRISPR-Cas9注射蜜蜂的RDLRNA水平（n = 19）与未注射的蜜蜂中的RNA水平（n = 12）。在这些实验中，mRNA RDL与非注射蜜蜂RNA水平相比，相对减少59%+（平均=15%SE）。当我们单独检查每只蜜蜂的RDLRNA水平时，19只蜜蜂中只有13只蜜蜂的RNA显著减少。这些数据表明，通过ocelli注射RDL-CRISPR-Cas9可能并不总是到达大量的脑细胞，这证实了与RDL免疫染色RDL-CRISPR-Cas9注射蜜蜂的数据。在这些制剂中，与其他蜜蜂大脑相比，8只蜜蜂中只有一只在脑细胞（蘑菇体、原脑和天线叶）中具有RDL CRISP-Cas9，其中RDL-CRISPR-Cas9的分布集中在原脑细胞（蘑菇体calyx和中央复合物）的细胞中，而不是天线叶（图4A-D）。
抗mGlutR1抗体测试
我们使用兔子产生的抗mGlutR1抗体对抗果蝇黑色素的偶联肽（图2A）。此肽的序列显示了 94% 与蜜蜂肽 （CLSDKTRFDYFARTVPPD）图 2A的标识。首先，我们用免疫印迹检查了对蜜蜂脑蛋白的抗体。蜜蜂脑均质被10%SDS-PAGE分离，电泳从硝基纤维素膜转移到硝化纤维素膜，并沾染抗mGlutR1。图 2A中的插入显示了两个带，估计权重（103 和 83 kD）对应于两个等形。当我们在蜜蜂大脑中测试这种抗体时，我们发现它们标记了蜜蜂大脑部分的神经皮皮谱和细胞，如图2B，D所示。抗mGlutR1抗体与偶联mGGlutR1肽结合后，在蜜蜂脑切片中消失特定染色（图2C）。这证实了抗mGlutR1抗体识别肽（图2C）。接下来，我们在中位奥切利中注射了mGlutR1-CRISPR-Cas9的组合，并使用了对照noguideRNA。在控制蜜蜂（n = 7）中，ATTO550的荧光不集中在细胞中。一些大脑有散射荧光ATTO550标签。因此，图2D1-3中的控制制剂显示大脑中的抗mGlutR1染色，而不是ATTO550荧光。当mGGR1-CRISPR-Cas9被注射到ocelli中并被许多细胞占用时，二级抗体的荧光水平在采用功能mGlutR1RNP的区域显著降低（图2E1-3）。蜜蜂被监测了48小时，每个实验条件下的一只蜜蜂被发现死亡。因此，在这个实验中，我们检查了七只控制蜜蜂和八只CRISPR-Cas9蜜蜂。所有注射CRISPR-Cas9的蜜蜂都有取在mgr1-CRISPR-Cas9中的细胞。这些细胞大多在蘑菇体、中央复合物和后原脑中。七分之二的蜜蜂中只有两只在蘑菇体、中央复合体和天线叶的许多细胞中贴上ATTO550标签。其中一个蜜蜂的例子如图2E所示。这些制剂中mGlutR1染色水平显著降低。其他五只蜜蜂有ATTO550标签对应mGlutR1 CRISPR-Cas9在蘑菇体内和后原脑体的成功交付，但不是在天线叶。
接下来，为了估计注射后48小时蜜蜂中经过修饰的mGlutR1 gDNA的含量，我们进行了基于qPCR的落水测试，其中落水探头被设计成在mGlutR1导引附近区域。在这些实验中，在注射mGGR1-CRISPR-Cas 9的蜜蜂大脑中，12个蜜蜂的gDNA相对修饰为59%+（平均=33 %SD），而非注射蜜蜂的gDNA（图3A）。
这些结果也通过不同一组蜜蜂的qRT-PCR测试得到证实，我们估计使用qRT-PCR在蜜蜂注射后48小时使用qRT-PCR的mGGR1RNA水平（图3B）。我们比较了mGlutR1-CRISPR-Cas9注射蜜蜂的mGlutR1RNA水平（n = 6）与未注射的蜜蜂中的RNA水平（n = 6）。在这些实验中，与未注射的蜜蜂相比，注射蜜蜂中的mRNA mGlutR1的相对减少率为53%+（平均=18%SE）（图3B）。
在蘑菇体的Kenyon细胞中表达RNP RDL-CRISPR-Cas9的四个不同蜜蜂的部分如图4A-D所示。蘑菇体内具有ATTO550荧光的蜜蜂示例和天线叶如图4E，F所示。
| 指南 | 序列 | 格纳 | RNP |
| [指南RNA：tracrRNA] | [gRNA：Cas9 核酸酶] | ||
| RDL_Guide1 | ACCGGACGCCCCC | GRDL1 | RRDL1 |
| RDL_Guide2 | AACGTATATATATTTT | GRDL2 | RRDL2 |
| RDL_Guide3 | CCATGACGAAACACGGCCC | GRDL3 | RRDL3 |
| mGlu_Guide 1 | CGAAATATATATGGTGT | GMGL1 | RMGL1 |
| mGlu_Guide 2 | 特卡加加加格加特卡特 | GMGL2 | RMGL2 |
| mGlu_Guide 3 | 格亚塔格格格格格格格格格格格GA | GMGL3 | RMGL3 |
表1：为RDL和mGlutR1设计的导板的核苷酸序列。
图1：抗RDL抗体的表征。（A） RDL 子单元的原理图，其中粉红色圆圈表示肽 2（细胞外 CVNEQSYSSNFIRI-amide） 在 N 端和肽 1（细胞内 CVRFHDPKKGGTL-酰胺）在 C 端的定位。A 中的插入显示用相应的抗 RDL 抗体处理的蜜蜂脑提取物的西方斑点中的带状物（一种带有抗 RDL pep1 和抗 RDL pep2）。每个免疫块显示蛋白质的表观大小 #50-60 kD，对应于 RDL 亚单位的各种等形的估计重量。（B，C）抗RDL抗体与结合肽1的抗RDL抗体的吸附。C中的图像显示，当抗体与结合肽 1 预育时，该部分的染色减少。扇形体 （Fb） 和椭圆形体 （eb） 是大脑中的核心复杂结构。M = 蘑菇体的中叶。（D1-3）对照组抗RDL染色，48小时后未注射的蜜蜂大脑部分。绿色表示大脑中的抗RDL阳性轮廓。（D2）此蜜蜂未注射，且不含 ATTO550 荧光。（D3）来自D1和D3的合并图像。（E1-3）RDL-CRISPR-Cas9的注射在细胞核中48小时（E2）ATTO550荧光后减少了抗RDL染色，表明RDL-CRISPR-Cas9的传递成功。（E3）反 RDL（绿色）和 ATTO550（红色）的合并图像。刻度条 = 100 μm （B-E）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：抗mGlutR1抗体的表征。（A） GCPR mGluR 的原理图，显示用于免疫的果蝇黑色素肽。为了进行比较，阿皮斯梅利韦拉肽如下所示。圆表示肽在mGlutR1受体细胞外域N终点的定位。A中的插入显示，抗 mGlutR1 抗体识别了蜜蜂大脑的西部斑点中的两个波段 =103 kD 和 #83 kD，对应于已知异形的估计重量。（B，C）在天线叶球蛋白的两个连续部分的抗mGGR1抗体的抗mGGR1抗体的抗光吸附控制。C中天线球蛋白部分的抗mGgR1图像显示，抗mGGR1肽与抗mGGR1抗体的预孵化导致染色减少。此过程导致抗体沉淀出溶液，与B相比，溶液中去除了染色（控制，预孵化中没有肽）。（D1） 显示在中位小食细胞中对照注射后，在蜜蜂脑切片中染色的抗 mGGR1。这种注射缺乏mGlutR1 gRNA，使MGGR1受体通过CRISPR-Cas9击倒，因此抗mGR1抗体的染色没有减少（绿色）。（D2）ATTO550荧光的缺失表明大脑中缺乏功能性CRISPR-Cas9。（D3）抗mGlutR1和ATTO550的合并图像。（E1-E3） 显示在脑部分的抗 mGlutR1 的染色，其中 mGlutR1 在注射后永久击倒 48 小时后，在中位 ocellus 中注射 mGlutR-CRISPR-Cas 9。因此，由于在许多细胞中成功敲除mGlutR1，这种大脑的染色大大减少。（E2）ATTO550在蜜蜂大脑中许多细胞核中的染色表明，MGlut1-CRISPR-Cas 9的注射是成功的。（E3）ATTO550（红色）和反mGlutR1（绿色）的合并图像。刻度条 = 10 μm （B，C）;100 μm （D，E）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：用345 nL的相应RPN CRISPR-Cas9注射后48小时在蜜蜂大脑中对RDL和mGGR1 mRNA的修饰gDNA和mRNA表达的评估。（A） 基于qPCR的落发测定测试，用2-μCt方法计算了评估具有修饰面积的gDNA量，并针对控制、未注入的大脑进行了归一化。数据以均值 = SD . （B） qRT-PCR 测试用于评估 CRISPR-Cas9 注射和未注射蜜蜂中的 mRNA 量。AmActin被用作参考基因。使用2-+Ct方法计算了相对基因表达，并针对对照、未注入的大脑进行归一化。数据以均值和SE表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：通过ATTO550荧光在蜜蜂大脑中RNP CRISPR-Cas9的分布示例。（A-D）来自四个不同的蜜蜂的大脑部分，在蘑菇体的Kenyon细胞中表达RNP RDL-CRISPR-Cas9。（E，F）使用RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9注射后两个大脑48小时的例子。刻度条 = 150 μm （A-F）。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
抗RDL和抗mGlutR1的特性
首先，通过免疫蛋白和固定蜜蜂脑切片的预吸附，对抗RDL和抗mGGR1抗体进行了定性。每个抗体被制造识别其所有已知的等形，西方分析表明，他们识别的带对应于其预测的分子量。接下来，两种抗体都被在蜜蜂大脑部分产生的偶联肽阻断。
我们研究的首要目的之一是确定针对特定偶联肽产生的抗体是固定脑组织中的蛋白质所特有的。为此，我们利用了CRISPR-Cas9系统。我们为蜜蜂RDL和mGlutR1设计了特定的导轨，并使用它们使 CRISPR-Cas9 贴上荧光探头 ATTO550 的标签。对于每个受体，我们注入三种不同的CRISPR-Cas9核糖核蛋白的混合物在ocelli中，以减少在成人蜜蜂大脑中的目标蛋白的量，通过消除相应的基因在细胞，采取我们设计的Cas9系统。在我们的研究中，我们完成了这一步。
这些实验取得成功的第一个关键步骤之一是设计适当的导引RNA。我们建议设计最多五个引导RNA，位于基因序列的开头、中间和结尾。在我们的初步工作中，我们用各种组合在三到五只蜜蜂身上测试了它们。我们还尝试了不同浓度的注射，以及注射后的时间，以及注射中各种RNP混合物。我们解剖了大脑，并使用抗RDL和抗mGGR1抗体对其进行处理。在这些初始测试中，我们建立了适当的组合，注射后时间，以及用于注射的CRISPR-Cas9的浓度和量。这些初始测试是设置我们在此处详细介绍的实验的基础。
其目的有两方面：1） 在蜜蜂中证明，使用CRISPR-Cas9和2）治疗后，我们的抗体染色减少，从而通过行为研究的最佳实验条件。因此，我们表明，如果许多细胞核在注射后含有CRISPR-Cas9 48h，抗RDL和抗mGlutR1染色的减少是显著的。此外，这表明测试的抗体特别识别蜜蜂大脑制剂中的mGlut1和RDL蛋白，并且它们可用于蜜蜂大脑的定位研究。
用于行为研究的实验设置 CRISPR-Cas9
接下来，我们设置实验，以便CRISPR-Cas9可用于行为研究。收集了八到九只蜜蜂进行控制和实验治疗。他们在注射前后进行了行为测试，然后他们的大脑被处理为ATTO550和/或免疫细胞化学，以确定大脑区域显示目标蛋白减少。在这里，必须注意的是，在控制和实验条件下，为一组实验所采集的蜜蜂数量限制为不超过8-9个蜜蜂。这样，两个条件都可以在同一天进行测试。此外，一旦我们准备了CRISPR-Cas9混合物注射，我们从来没有冻结他们。CRISPR-Cas9混合物连续使用3天且保持在4-8°C时效力没有变化。但是，我们在 3 天后没有测试它。
正如我们在两组实验注射和两种抗体的结果部分中所述，16只测试中只有3只蜜蜂在蘑菇体内、原脑和天线叶中显示出大分布的ATTO550。在所有其他蜜蜂中，CRISPR-Cas9的分布仅限于蘑菇体、中央复合体和/或后原脑。对于任何行为研究，必须了解，使用这种注射方法，目标蛋白的还原将仅限于大多数蜜蜂的蘑菇体。它将不会延伸到天线叶或下食管结节。因此，我们使用的注射技术适用于研究蘑菇体内受体减少和行为实验中中枢复合物减少的影响，而引入CRISPR-Cas9的不同方法更适合于研究其他大脑区域。
最后，我们的研究证明了CRISPR-Cas9作为控制大脑中抗体染色的成功应用。对于两种抗体（抗RDL和抗mGglutR1），当mGlutR1-CRISPR-Cas9或RDL-CRISPR-Cas9的吸收成功时，相应的抗体染色水平也显著降低。此外，必须注意，在ocelli注射导致CRISPR-Cas9在大脑中的分布，这是不均匀的。分布变化，从奥切利和蘑菇体的最小区域到整个大脑中的许多细胞。细胞的mGlutR1-或RDL-CRISPR-Cas9的变异性可能是由于注射的变化。我们的数据表明，CRISPR-Cas9系统在蜜蜂中有效，但注射方法需要改进，以减少CRISPR-Cas9在单个蜜蜂大脑中的可变性。在这些限制下，现在可以利用这种技术来操纵成年蜜蜂的基因进行行为实验。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了BHS的以下奖项的支持：人类前沿科学方案;NIH NIGMS （R01 GM113967）;NSF 创意实验室 （1556337）。DmGluRA的肽和抗体是在Serge Birman博士（法国卢米尼的马赛）实验室设计的，当时IS得到了医学基金会UFP20060306548的UFP20060306548方案的支持。我们感谢来自综合DNA技术（IDT）的丹妮拉·容奎拉·马罗西和亚历克斯·汉特在RDL指南和qPCR落体检测的设计方面提供帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
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