Denne artikel beskriver en metode til at generere funktionelle tumor antigen-specifikke induceret pluripotente stamcelle-afledte CD8αβ+ enkelt positive T-celler ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system.
Generering og udvidelse af funktionelle T-celler in vitro kan føre til en bred vifte af kliniske anvendelser. En sådan anvendelse er til behandling af patienter med fremskreden kræft. Adoptiv T celle overførsel (ACT) af højt berigede tumor antigen-specifikke T-celler har vist sig at forårsage varige regression af metastatisk kræft hos nogle patienter. Men under ekspansion, disse celler kan blive udmattet eller senescent, begrænse deres Effector funktion og persistens in vivo. Induceret pluripotente stamcelle (iPSC) teknologi kan overvinde disse forhindringer ved at føre til in vitro-generation af et stort antal mindre differentierede tumor antigen-specifikke T-celler. Human iPSC (hiPSC) har kapacitet til at differentiere sig til enhver form for somatisk celle, herunder lymfocytter, som bevarer den oprindelige T-celle receptor (TCR) genomisk omorganisering, når en T-celle anvendes som en startcelle. Derfor omprogrammering af humane tumor antigen-specifikke T-celler til hiPSC efterfulgt af omdifferentiering til T Cell Lineage har potentiale til at producere forynget tumor antigen-specifikke T-celler. Beskrevet her er en metode til generering af tumor antigen-specifikke CD8αβ+ enkelt positive (SP) T celler fra hipsc ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til in vitro-celle Lineage generation og vil lette udviklingen af in vitro-afledte T-celler til brug i regenerativ medicin og celle-baserede terapier.
Ud over fysiologiske fordele, T-celler har mange potentielle terapeutiske anvendelser. Generering og udvidelse af T-celler in vitro kan anvendes til sygdoms modellering og terapeutisk validering samt en kilde til behandling af arvelige og erhvervede immundefekt tilstande (dvs. virale immundefekter og lymfodepletering sekundært til kemoterapi eller transplantation) og til udryddelse af kræft. Sidstnævnte kvalitet har ført til udvikling af adoptivt Cell overførsel (ACT) til behandling af patienter med fremskreden kræft1.
ACT består af at resse en patients tumor, udtrække tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), udvide TILs ex vivo, derefter reinfusing de udvidede celler i patienten2. Det har vist sig at være en effektiv behandlingsmodalitet for nogle patienter med Metastatisk Cancer. Desværre, ikke alle patienter reagerer på denne behandling. Tidligere rapporter har vist, at differentierings tilstanden for overførte celler3,4,5,6,7,8,9, brug af store tal af stærkt berigede kræft antigen-specifikke t-celler10, og persistens af t-celler efter overførsel11,12 er alle korreleret med mere holdbare svar13,14. Derfor, når ACT undlader at fremkalde en anti-tumorrespons, det kan delvis skyldes et lavt udbytte af kræft antigen-specifikke T-celler, ineffektiv ex vivo ekspansion fører til konsumption og tab af reaktive kloner, eller manglende vedholdenhed efter overførsel4 . Det er blevet postuleret, at disse forhindringer kan overvindes ved generering af et stort antal mindre differentierede kræft antigen-specifikke T-celler in vitro15,16.
Hæmatopoietiske Stem/stamceller (Hspc’er) er en konventionel kilde til in vitro T celle generering, selv om denne metode er begrænset af det lille antal celler, der kan inddrives fra en enkelt donor1. Embryonale stamceller (ESCs) har også vist sig at producere T-celler, men med lavt udbytte17, hvilket gør det ineffektivt for kliniske anvendelser. Da T-stamceller Desuden oplever stokastiske genetiske rekombination af deres T-celle receptorer (TCRs) i tidlige udviklingsstadier, er det ikke muligt at anvende Hspc’er eller Esc’erne til at generere en ren population af antigen specifikke T-celler uden yderligere genomisk ændringer som TCR-gentransduktion.
En tilgang til at overvinde disse forbehold er at omprogrammere TILs til menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs), som kan give en grænseløs kilde til in vitro T celle generation. Det har vist sig, at kræft antigen-specifikke tils kan omprogrammeres til hipscs og re-differentieret til T Cell afstamning, som bevarer den samme t celle receptor (TCR) gen omlægning som den oprindelige t celle18,19. Denne detalje er vigtig for Act, fordi individuelle patient tumorer har unikke Mutations profiler, og meget få kræft antigener har vist sig at være delt blandt patienter20. Derfor kan brug af Cancer antigen-specifikke TILs som en kilde til in vitro-produktion af hiPSC-afledte T-celler give en ny strategi for personlig behandling af patienter med metastatisk kræft.
Præsenteret her i detaljer er en protokol til differentiering af hiPSC-afledte T Lineage celler i funktionelle antigen-specifikke CD8αβ+ enkelt positive (SP) t-celler ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til in vitro T Celledifferentiering af hiPSCs, hæmatopoietiske stamceller, og embryonale stammer, samt deres yderligere anvendelser i regenerativ medicin og celle-baserede terapier.
Co-kulturen af OP9 murine stromale celler er et veletableret system til in vitro-generation af lymfocytter (dvs., NK, B, og T-celler) fra Hspc’er og pluripotente stamceller. Notch signalering er nødvendig for at inducere t Lineage engagement og kan opnås ved ektopisk ekspression af notch ligand filen dll1 eller DLL4, som har sammenlignelig effekt for t Cell generation1. Derfor er OP9/filen DLL1-samkultursystemet blevet en meget anvendt metode til fremstilling af T-celler in vitro. Desuden er denne metode anvendes til brug sammen med flere typer og kilder af humane celler, herunder navlestrengsblod, knoglemarvs Hspc’er og ESCs. Imidlertid er genereringen af T-celler fra disse kilder begrænset enten ved utilstrækkelig hentning af kilde celler eller ved ineffektiv differentiering til T-cellerne1. Desuden kan et T-celle produkt med en enkelt TCR rekombination ikke genereres fra disse åbne repertoire kilder. Ved hjælp af regenerativ medicin teknikker, nemlig induceret pluripotente stamcelle (IPSC) teknologi, kan det være muligt at producere massive antal antigen-specifikke T-celler til brug i celle-baserede Therapeutics15.
hiPSCs svarer til pluripotente Esc’er i deres kapacitet til selvfornyelse, grænseløs ekspansion og potentiale til at differentiere til enhver form for somatisk celle i kroppen; de mangler imidlertid de etiske betænkeligheder ved brugen af produkter af embryonal oprindelse til kliniske anvendelser. Desuden kan hiPSCs produceres fra enhver somatisk celle, der giver mulighed for udvikling af celleprodukter til personlig medicin. I tidligere rapporter er hipscs fremstillet af humane T-celler ved hjælp af hele perifere mononukleære celler, CD3 + celler eller isolerede cytotoksiske T– lymfocytter (CTL’er) som kilde18,19,22, 26. Når hiPSCs genereres fra en t-celle kilde (t-iPSCs), nedarves den oprindelige TCR-genordning. Derfor kan patient T-iPSC afledte T-celler give en model for personlig ACT-behandling ved at målrette mod en patients særskilte kræft antigener.
Differentieringen af humane pluripotente stamceller i T Lineage celler er opdelt i to trin: dannelsen af hæmatopoietiske stamceller (HPCs)27 og deres yderligere differentiering i t Lineage celler21. Begge trin kan udføres ved hjælp af OP9/filen DLL1 Co-Culture system. Vigtigere, kvaliteten af OP9/filen DLL1 feeder celler er afgørende for succesen af T Celledifferentiering. Da OP9/filen DLL1 celler ikke er en udødelig homogen cellelinje, er kvaliteten af FBS og kulturforhold afgørende for at opretholde deres ekspansion uden at miste evnen til at støtte hiPSC differentiering. Derfor anbefales det at pre-evaluere partiet af FBS og passage konsekvent, når celle-til-celle cytoplasmisk kontakt begynder at forekomme, for at forhindre Celledifferentiering og senescens. Et punkt at tage i betragtning er, at celle-til-celle kontakt kan vises skelnes fra baggrunden afhængigt af fasekontrast og forstørrelse af mikroskopet. I vores erfaring, de fleste OP9/filen DLL1 retter vil synes at være 80% flydende, når klar til passage.
Det har vist sig, at de redifferentierede t-Lineage celler genereret fra t-ipscs af OP9/filen dll1 Co-Culture kan producere CD8+ SP T-celler ved stimulering18,19. Men regenereret CD8+ SP T celler erhverve den iboende-lignende CD8αα homodimer22,28, som er en ineffektiv Co-receptor for TCR signalering29. Derudover har disse regenererede CD8+ SP T-celler vist stærk TCR-uafhængig cytotoksicitet, hvilket gør disse celler ugunstige til klinisk brug30. Denne protokol beskriver en nylig metode, der involverer stimulering af rensede CD4+CD8+ DP-celler til at generere CD8αβ + SP T– celler med en mere konventionel fænotype og forbedret antigen-specifik cytotoksicitet22. Selv om tabet af antigen specificitet på grund af sekundær tcrα alleliske omlægning forekommer i DP fase efter langvarig kultur, dette kan overvindes ved genomredigering i T-ipscs31. Det er vores erfaring, at hiPSC-afledte DP celler begynder at dukke op på dag 30-35 i kulturen, og disse nyligt genererede DP-celler har endnu ikke gennemgået sekundær TCRα-omlægning. Derfor bevarer de fleste DP-celler på dag 35 antigen specificitet og kan bruges til at generere antigen specifikke CD8αβ + SP T– celler.
Før Human anti-CD3 og anti-CD28 stimulation på dag 35 skal CD4–CD8-DN- cellerne fjernes fra kulturen, da disse er blevet påvist at forårsage direkte drab af CD4+CD8+ DP-celler efter stimulation22. Brug af CD4 magnetisk perle berigelse (trin 3,10) vil berige for både DP og CD4+CD8– INTERMEDIATE enkelt positive (ISP) celler1, som vi har vist sig at have nogen negative virkninger22. Alternativt kan fluorescens-aktiverede celle sortering ved flow cytometri udføres for at isolere DP-celler. Men magnetisk perle adskillelse foretrækkes, da det undgår mekanisk stress induceret af strømnings cytometri.
Generationen af CD8αβ+ SP T celler fra humane pluripotente stamceller uden aktivering-medieret agonist udvælgelse er efterfølgende blevet påvist ved brug af 3D murine stromale cellekultur32. Men, fysiologiske positive udvælgelse er afhængig af samspillet mellem TCR med Self-peptid-MHC komplekser, som er unikt behandlet og præsenteret af thymisk kortikale epitelceller33. Desuden har TCR affinitet for udvælgelse peptider vist sig at bestemme de efterfølgende funktionelle kapaciteter af modne CD8αβ+ SP T celler34. I øjeblikket er der ingen beviser for, at en notch stromale celle-baserede Co-kultur system kan give den definerede udvælgelse peptid og MHC kompleks kræves for fysiologiske positive udvælgelse.
Det er tidligere blevet rapporteret i en murine model, at T Lineage celler genereret fra tumor antigen-specifikke T celle-afledte hiPSCs ved hjælp af OP9/filen DLL1 alene undlader at opleve konventionel modning. Men IPSC-afledte umodne t-celler genereret af OP9/filen dll1 system kan modnes i naive-lignende t-celler ved yderligere fysiologiske thyminsyre uddannelse i et 3D-kultur system 28,35. Derfor er den protokol, der præsenteres her for at producere iPSC-afledte umodne T-celler genereret af OP9/filen DLL1 system afgørende for yderligere forsøg på at generere reelle humane tumor antigen-specifikke post-thymic T-celler i stand til langvarig vedholdenhed in vivo med effektivitet til behandling af etablerede vaskulariserede tumorer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alan B. Hoofring og Erina H. Han for grafisk assistance. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af National Cancer Institute (ZIA BC010763) og Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for celle-baserede kræft immunterapi.
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
Anti-CD3, human | BD Biosciences | Cat# 561812, RRID:AB_1089628 | |
Anti-CD34, human | BD Biosciences | Cat# 348791, RRID:AB_400381 | |
Anti-CD4, human | Biolegend | Cat# 344612, RRID:AB_2028479 | |
Anti-CD43, human | BD Biosciences | Cat# 560198, RRID:AB_1645460 | |
Anti-CD7, human | BD Biosciences | Cat# 555361, RRID:AB_395764 | |
Anti-CD8a, human | BD Biosciences | Cat# 555369, RRID:AB_398595 | |
Anti-CD8b, human | BD Biosciences | Cat# 641057, RRID:AB_1645747 | |
Anti-TCRb, human | BD Biosciences | Cat# 555548, RRID:AB_395932 | |
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-375 | |
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-387 | |
CD4 Microbeads, human | Miltenyl Biotec | 130-045-101 | |
Cell strainer 100 um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
Gelatin Solution 2% | SIGMA-Aldritch | G1393-100ML | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine supplement |
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free | Gibco | 14025-092 | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV | MBL | Cat#TB-0009-2 | |
Mart1-hiPSC | Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 | RIKEN-IMS | |
Melan-A, MART 1 (26-35) | InnoPep | 3146-0100 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
αMEM powder | Gibco | 61100061 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Thermo Fisher Scientific | C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | OP9/DLL1 |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | Human ESC Culture Media |
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
StemPro | EZPassage | 23181-010 | |
T2-tumor | ATCC | T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
U Bottom 96 well plate | Corning, Inc. | 3799 |