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Cancer Research

ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करना

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/59997
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy, National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

यह आलेख एक विधि का वर्णन करता है कार्यात्मक ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न CD8 ]+ एक सकारात्मक टी कोशिकाओं OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए.

Abstract

इन विट्रो में कार्यात्मक टी कोशिकाओं की पीढ़ी और विस्तार नैदानिक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। ऐसा ही एक प्रयोग उन्नत कैंसर वाले रोगियों के उपचार के लिए है। अत्यधिक समृद्ध ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के दत्तक टी सेल स्थानांतरण (ACT) कुछ रोगियों में मेटास्टैटिक कैंसर के टिकाऊ प्रतिगमन के कारण दिखाया गया है. हालांकि, विस्तार के दौरान, इन कोशिकाओं को समाप्त हो सकता है या sencentcent, उनके effector समारोह और vivo में दृढ़ता सीमित. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी कम विभेदित ट्यूमर प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या के इन विट्रो पीढ़ी में अग्रणी द्वारा इन बाधाओं को दूर कर सकते हैं. मानव iPSC (hiPSC) एक टी सेल एक प्रारंभिक सेल के रूप में प्रयोग किया जाता है जब मूल टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) जीनोमिक पुनर्व्यवस्था बनाए रखने, जो लिम्फोसाइटों सहित दैहिक सेल के किसी भी प्रकार में अंतर करने की क्षमता है। इसलिए, मानव ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के hiPSC करने के लिए reprogramming टी सेल वंश के लिए redifferentiation के बाद कायाकल्प ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता है. यहाँ वर्णित OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर HIPSC से ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट CD8 ]+ एकल सकारात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं पैदा करने के लिए एक विधि है। इस विधि इन विट्रो टी सेल वंश पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और इन विट्रो व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के विकास की सुविधा के लिए पुनर्योजी चिकित्सा और सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग के लिए होगा.

Introduction

शारीरिक लाभ के अलावा, टी कोशिकाओं कई संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों है. इन विट्रो में टी कोशिकाओं की पीढ़ी और विस्तार रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय सत्यापन के साथ-साथ वंशानुगत और प्राप्त इम्यूनोडेफिशियेंसी राज्यों के लिए उपचार का एक स्रोत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, वायरल इम्यूनोडिब्लियोब्लियोब्लियोब्लियोब्लियोफिकेशन और लिम्फोडेफिकेशन माध्यमिक करने के लिए रसायन चिकित्सा या प्रत्यारोपण) और कैंसर के उन्मूलन के लिए. यह बाद की गुणवत्ता उन्नत कैंसर1के साथ रोगियों के उपचार के लिए दत्तक टी सेल हस्तांतरण (ACT) के विकास के लिए प्रेरित किया है.

अधिनियम एक रोगी के ट्यूमर resecting के होते हैं, ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) निकालने, TILs पूर्व vivo का विस्तार, तो रोगी2में विस्तारित कोशिकाओं reinfusing. यह मेटास्टैटिक कैंसर के साथ कुछ रोगियों के लिए एक प्रभावी उपचार मोडलिटी होना दिखाया गया है.  दुर्भाग्य से, नहीं सभी रोगियों को इस चिकित्सा का जवाब. पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि स्थानांतरित कोशिकाओं3,4,5,6,7,8,9, बड़ी संख्या के उपयोग की विभेदक स्थिति अत्यधिक समृद्ध कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओंकी 10, और हस्तांतरण के बाद टी कोशिकाओं के हठ11,12 सभी अधिक टिकाऊ प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबद्ध हैं13,14. इसलिए, जब अधिनियम एक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रिया प्राप्त करने में विफल रहता है, यह भाग में कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की कम उपज के कारण हो सकता है, अक्षम ex vivo विस्तार थकावट और प्रतिक्रियाशील क्लोन की हानि के लिए अग्रणी, या हस्तांतरण के बाद हठ की कमी4 . यह माना गया है कि इन बाधाओं को इन बाधाओं को इन विट्रो15,16में कम विभेदित कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या से दूर किया जा सकता है .

Hematopoietic स्टेम / जनक कोशिकाओं (HSPCs) इन विट्रो टी सेल पीढ़ी के लिए एक पारंपरिक स्रोत हैं, हालांकि इस विधि एक एकल दाता1से बरामद करने में सक्षम कोशिकाओं की छोटी संख्या द्वारा सीमित है. भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) भी टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन कम उपज के साथ17, यह नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अक्षम बना रही है. इसके अलावा, के बाद से टी वंश कोशिकाओं प्रारंभिक विकासात्मक चरणों में अपने टी सेल रिसेप्टर्स (टीआरसी) के stochastic आनुवंशिक पुनर्संयोजन का अनुभव, यह आगे जीनोमिक बिना प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए HSPCs या ESCs का उपयोग करने के लिए संभव नहीं है टीसीआर जीन ट्रांसडक्शन जैसे संशोधन।

इन गुफाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के लिए TILs reprogram है, जो इन विट्रो टी सेल पीढ़ी के लिए एक असीम स्रोत प्रदान कर सकते हैं. यह दिखाया गया है कि कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट TILs hiPSCs में reprogrammed किया जा सकता है और टी सेल वंश है, जो मूल टी सेल18,19के रूप में एक ही टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन पुनर्व्यवस्थित बरकरार रखता है के लिए फिर से अलग .  इस विस्तार अधिनियम के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि व्यक्तिगत रोगी ट्यूमर अद्वितीय उत्परिवर्तन प्रोफाइल है, और बहुत कुछ कैंसर प्रतिजनों के रोगियों के बीच साझा करने के लिए दिखाया गया है20. इसलिए, HIPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक स्रोत के रूप में कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट TILs का उपयोग मेटास्टैटिक कैंसर के साथ रोगियों के व्यक्तिगत उपचार के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकते हैं.

यहाँ विस्तार से प्रस्तुत OP9/DLL1 सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके कार्यांकित प्रतिजन-विशिष्टCD8] + एकल धनात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं में hiPSC व्युत्पन्न टी वंश कोशिकाओं को विभेदित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस विधि hiPSCs के इन विट्रो टी सेल भेदभाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, hematopoietic संतान, और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, साथ ही पुनर्योजी चिकित्सा और सेल आधारित चिकित्सा में उनके आगे अनुप्रयोगों.

Protocol

1. माउस भ्रूण Fibroblasts (एमईएफ) पर मानव iPSCs (hiPSCs) Culturing

नोट: hiPSCs culturing के लिए वैकल्पिक तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, सहित, लेकिन सीमित नहीं: एक 6 अच्छी तरह से प्लेट पर seeding पूर्व जिलेटिन के साथ लेपित, एक जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण, पुनः संयोजक lamin 511, या किसी भी अन्य extracellular मैट्रिक्स hiPSC विस्तार में इस्तेमाल किया, और परिभाषित मीडिया का उपयोग कर सुसंस्कृत विशेष रूप से मानव pluripotent स्टेम सेल संस्कृति के लिए तैयार की.

  1. CULturing एमईएफ
    1. कोट एक 10 सेमी सेल संस्कृति पेट्री डिश 0.1% जिलेटिन के 4 एमएल के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. 4 x 106 विकिरणित एमईएफ की एक शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस एमईएफ मीडिया के 10 एमएल में जल्दी से (डीएमईएम + 10% एफबीएस + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1x L-ग्लूटामाइन पूरक)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को प्रेरित करें और एमईएफ मीडिया के 9 एमएल में सेल गोली को फिर से शुरू करें।
    3. इनक्यूबेटर से जिलेटिन लेपित पकवान निकालें। Aspirate जिलेटिन और एमईएफ मीडिया के 7 एमएल जोड़ें. प्लेट 3 एमईएफ निलंबन की एमएल (चरण 1.1.2 से) जिलेटिन लेपित पकवान पर. डिश साइड-टू-साइड और फ्रंट-टू-बैक को रॉक करें ताकि डिश पर एमईएफ का भी वितरण सुनिश्चित किया जा सके। 8-36 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. एमईएफ पर HIPSC की भर्ती
    नोट:     डेटा MART-1 iPSC लंबी अवधि के सुसंस्कृत मेलेनोमा TIL, जो विशेष रूप से HLA-A * 02:01 के संदर्भ में MART-1 पेप्टाइड पहचान से व्युत्पन्न का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित 18.
    1. जब कालोनियों के बीच हैं मार्ग hiPSCs 0.8 - 1.2 मिमी व्यास में. पासिंग से पहले, एक स्टीरियो-माइक्रोस्कोप में HIPSC कालोनियों की जांच करें और 200 डिग्री एल टिप के प्लास्टिक किनारे का उपयोग करसंस्कृति से भेदभाव के किसी भी क्षेत्र को हटा दें।
    2. Aspirate खर्च मीडिया और जोड़ें 10 एमएल HIPSC मीडिया (मानव ES संस्कृति मीडिया [सामग्री की तालिका] + 10 ng/mL मानव बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक [hbFGF]) के साथ पूरक 10 $M रॉक अवरोध करनेवाला.
    3. एक हाथ में सेल संस्कृति पकवान पकड़ो और एक दिशा में पूरे पकवान भर में एक डिस्पोजेबल सेल passaging उपकरण रोल. पर्याप्त दबाव लागू करें ताकि पूरे रोलर ब्लेड संस्कृति पकवान छू और रोलिंग कार्रवाई के दौरान एक समान दबाव बनाए रखने के.
    4. संस्कृति पकवान 90 डिग्री घुमाएँ और कदम 1.2.3 दोहराएँ. कालोनियों, जो चेकर दिखाई देना चाहिए की उचित काटने की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप में प्लेट देखें। एक 200 डिग्री एल पिपेट का उपयोग कर कोमल यांत्रिक फ्लशिंग द्वारा detach कटौती कालोनियों।
      नोट: यांत्रिक फ्लशिंग द्वारा कटौती कालोनियों को रोलर के साथ कालोनियों को काटने के तुरंत बाद किया जाना चाहिए, क्योंकि 3 मिनट के बाद कटौती कालोनियों को पकवान से फिर से जोड़ना शुरू कर दिया जाएगा, और फ्लशिंग द्वारा सजातीय आकार की कालोनियों को अलग करना मुश्किल हो जाएगा।
    5. एमईएफ के एक नए 10 सेमी डिश पर कट कालोनियों के 350 - 600 clumps स्थानांतरण (प्लेटेड 8 - 36 एच hiPSC पासिंग से पहले) ताजा HIPSC मीडिया के 10 एमएल के साथ 10 $M रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: 600 clumps लगभग 1.0 x 106 MART-1 iPSC का प्रतिनिधित्व करता है और दिन 35 पर 0.5-1.0 x 106 डीपी सेल उपज होगी। हालांकि, अपेक्षित संख्या प्रारंभिक सेल लाइन और संस्कृति की स्थिति की शक्ति के आधार पर अलग अलग होंगे.
    6. अगले दिन, aspirate मीडिया खर्च और ताजा HIPSC मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. HIPSC मीडिया हर 1-2 दिन में बदलें HIPSC वृद्धि दर के आधार पर.

2. HIPSCs के साथ सह-संस्कृति के लिए OP9/DLL1 प्रकोष्ठों की तैयारी

  1. OP9 मीडिया में संस्कृति OP9/DLL1 कोशिकाओं [न्यूनतम आवश्यक माध्यम (जेड-एमईएम) + 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन पर 37 डिग्री सेल्सियस. जब OP9/DLL1 कोशिकाओं संगम तक पहुँचने, aspirate मीडिया और 1x मैग्नीशियम, कैल्शियम, और फिनोल लाल मुक्त फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 5 एमएल के साथ एक बार धोने.
  2. Aspirate पीबीएस और 0.05% Trypsin-EDTA के 2 एमएल जोड़ें.  37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। फिर, OP9 मीडिया के 4 एमएल जोड़ें और एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए पाइपिंग द्वारा सेल परत को यंत्रवत् अलग करें।
  3. सेल क्लंप से बचने के लिए सेल सस्पेंशन को 100 डिग्री सेल्सियस सेल छलनी के माध्यम से 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। अतिनिष्ट और OP9 मीडिया के 12 एमएल में फिर से लागू करें।
  4. छह नए 10 सेमी सेल संस्कृति पेट्री व्यंजनों में से प्रत्येक के लिए OP9 मीडिया के 8 एमएल जोड़ें। प्रत्येक नए 10 सेमी डिश पर चरण 2.3 से ओपी 9/ डिश साइड-टू-साइड को रॉक करें तो सामने से पीछे की ओर यह सुनिश्चित करें कि डिश के ऊपर OP9/DLL1 का वितरण भी सुनिश्चित करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। कोशिकाओं संगम तक पहुँचने जब हर 2 - 3 दिन मार्ग दोहराएँ.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि OP9/DLL1 कोशिकाओं के लिए पर्याप्त जमे हुए स्टॉक बनाने के लिए और एक नया स्टॉक हर 4-6 सप्ताह thaw.

3. सीडी8 में HIPSCs के विट्रो भेदभाव में[ ] + एकल सकारात्मक (एसपी) टी सेल

  1. hiPSCs के साथ सह-संस्कृति के लिए एक सप्ताह पहले जिलेटिनीकृत OP9/DLL1 व्यंजन तैयार करें। 0.1% जिलेटिन समाधान तैयार करने के लिए, पीबीएस के 500 एमएल के लिए कमरे के तापमान (आरटी) ऊतक ग्रेड स्टॉक जिलेटिन समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
    1. कोट 3 नए 10 सेमी सेल संस्कृति पेट्री व्यंजन 0.1% जिलेटिन के पकवान प्रति 4 एमएल जोड़कर.  37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट।
    2. Aspirate जिलेटिन और प्रत्येक पकवान के लिए OP9 मीडिया के 8 एमएल जोड़ें. OP9/DLL1 के एक confluent पकवान पारित (जैसा कि ऊपर अनुभाग 2 में किया जाता है) तीन जिलेटिन पूर्व लेपित व्यंजन के लिए.
  2. 4 दिनों के बाद, प्रति डिश मीडिया के कुल 20 एमएल के लिए जिलेटिन पर OP9/DLL1 के प्रत्येक 10 सेमी डिश में OP9 मीडिया के 10 एमएल जोड़ें।
  3. 7 - 8 दिनों के बाद, OP9/DLL1 confluent व्यंजन (अंतर दिन 0) पर HIPSC सह संस्कृति शुरू करते हैं।
    1. Aspirate MEF पर hiPSCs के 10 सेमी पकवान confluent से मीडिया खर्च किया. OP9 मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. 1.2.3 और 1.2.4 चरणों में किए गए डिस्पोजेबल सेल पासिंग टूल का उपयोग करके hiPSC कालोनियों को काटें और अलग करें।
    2. एक 10 सेमी पूर्व gelatinized OP9/DLL1 पकवान (कदम 3.1) ताजा OP9 मीडिया के 10 एमएल के साथ एक 200 $L पिपेट का उपयोग कर पर कट कालोनियों के 350 - 600 clumps स्थानांतरण। कालोनियों के वितरण को भी सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति डिश को साइड-टू-साइड को रॉक करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, पूर्व गठित hiPSC भ्रूण निकायों (ईबी) या छोटे झुरमुट निलंबन इस्तेमाल किया जा सकता है.  हालांकि, एक डिस्पोजेबल सेल पासिंग उपकरण या ईबी गठन प्रणाली का उपयोग एक समान आकार के HIPSC clumps का उत्पादन करने के लिए पसंद किया जाता है।
  4. पहले दिन, aspirate मीडिया खर्च और ताजा OP9 मीडिया के 20 एमएल के साथ की जगह. 1 दिन के लिए OP9/DLL1 पर सह-संस्कृत hiPSC clumps छोटे दौर मोनोलेयर कालोनियों के रूप में दिखाई देगा (चित्र 1) .
  5. 5 दिन, खर्च मीडिया के 10 एमएल aspirate और ताजा OP9 मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. HIPSC कालोनियों आदिम mesoder, जो एक बहुस्तरीय अंधेरे केंद्र की विशेषता है में अंतर करने के लिए शुरू हो जाएगा.
  6. 9 दिन, खर्च मीडिया के 10 एमएल aspirate और ताजा OP9 मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. इस बिंदु पर, बहुस्तरीय केंद्र संरचनाओं गुंबद की तरह आकार में विकसित होगा, और एक परिधीय नेटवर्क की तरह क्षेत्र स्पष्ट हो शुरू कर देंगे.
  7. 13 दिन, फसल hematopoietic जनक कोशिकाओं (HPCs) (चित्र 1). 13 दिन पर HIPSC व्युत्पन्न संरचनाओं गुंबद की तरह क्षेत्रों के एक नेटवर्क से घिरा हुआ एक अंधेरे केंद्रीय organoid द्वारा विशेषता है, hematopoietic क्षेत्रों के प्रतिनिधि (H$s) पहले मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न hematopoietic संतति को संलग्न करने के लिए सूचना दी 21|
    नोट:     गुंबद की तरह संरचनाओं की उपस्थिति भी अंधेरे केन्द्रों के अभाव में एक सफल प्रक्रिया को इंगित करता है. एचपीसी का उत्पादन करने में असमर्थता ओपी 9/डीएलएल 1 की खराब गुणवत्ता, एफबीएस लॉट की गुणवत्ता, आई पी पी सी क्लंप्स का संगम, ओपी 9/डीएलएल1 (350-600 क्लंप्स इष्टतम है) और/या आईपीएससी लाइनों की शक्ति में भिन्नता के कारण हेमेटोपोटिक अग्रदूतों का उत्पादन हो सकता है।
    1. Aspirate खर्च मीडिया और 1x फिनोल लाल मुक्त हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान कैल्शियम और मैग्नीशियम (HBSS) के साथ संशोधित के 5 एमएल के साथ 1x धोने.
    2. एचबीएसएस के 10 एमएल में एचबीएसएस और 5000 यूनिट/एमएल कोलैजानेस IV का 250 एमएल जोड़ें। 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट एस्पायर एचबीएस कोलेजाइनस IV के साथ और पीबीएस के 5 एमएल के साथ एक बार धोएं।
    3. Aspirate पीबीएस और 0.25% Trypsin-EDTA के 5 एमएल जोड़ें. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर, OP9 मीडिया के 4 एमएल जोड़ें और एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए पाइपिंग द्वारा सेल परत को अलग करें।
    4. 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।  4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को प्रेरित करें और ओपी 9 मीडिया के 10 एमएल में फिर से शुरू करें।
    5. प्लेट सेल निलंबन एक नया जिलेटिन 10 सेमी सेल संस्कृति पेट्री पकवान पर (देखें कदम 3.1.1 और 3.1.2). 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर, कोमल पाइपिंग द्वारा गैर-आकर्षक कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    6. एक 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में एकत्र सेल निलंबन स्थानांतरण.  4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। अति-निश्चित और विभेदकारी मीडिया के 10 एमएल में पुन: स्फूर्ति [OP9 मीडिया के साथ 5 ng/mL मानव स्टेम सेल कारक (hSCF), 5 ng/mL मानव Flt3 Ligand (hFLT3L), और 5 ng/mL मानव interleukin 7 (HIL-7)].
    7. एक नया 10 सेमी OP9/DLL1 confluent पकवान पर सेल निलंबन प्लेट.
  8. 16 दिन, कोशिकाओं को पारित.
    1. यांत्रिक रूप से कोमल पाइपिंग द्वारा गैर-आकर्षक कोशिकाओं को अलग करें और 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को प्रेरित करें और 10 एमएल भेदभाव मीडिया में फिर से शुरू करें।
    2. एक नया 10 सेमी OP9/DLL1 confluent पकवान पर सेल निलंबन प्लेट.
  9. कदम 3.8 दोहराकर हर 5-7 दिनों में गैर-आकर्षक कोशिकाओं को पारित करना जारी रखें।
  10. दिन 35, CD4+CD8+ डबल सकारात्मक (डीपी) जनसंख्या को समृद्ध और CD8 का उत्पादन करने के लिए प्रोत्साहित] + एसपी टी कोशिकाओं (चित्र 2).
    1. यांत्रिक रूप से सेल क्लंप को हटाने के लिए 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से कोमल पाइपिंग द्वारा गैर-आकर्षक कोशिकाओं को अलग करें और फ़िल्टर करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार CD4+ सेल आबादी CD4 चुंबकीय मनका अलगाव द्वारा समृद्ध.
      नोट: CD4 चुंबकीय मोती का उपयोग करने के लिए तर्क सीडी 4-CD8- डीएन कोशिकाओं को संस्कृति से हटाने के लिए है, के रूप में इन सीडी 4+CD8+ डीपी कोशिकाओं उत्तेजना22के बाद प्रत्यक्ष हत्या का कारण प्रदर्शन किया गया है.
    2. एक Neubuer hemocytometer और Trypan नीले रंग का उपयोग कर लाइव CD4 समृद्ध कोशिकाओं की गणना.  कुल एकाग्रता पर OP9 मीडिया में निलंबित 0.5 x 106 कोशिकाओं / एक ऊतक संस्कृति फ्लैट नीचे 24 अच्छी तरह से confluent OP9/DLL1 की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल निलंबन (0.5 x 106 कोशिकाओं) के Alicot 1 एमएल.
    3. जोड़ें 100 IU मानव interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/mL HIL-7, 500 ng/mL विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी, और 2 g/mL विरोधी मानव CD28 एंटीबॉडी, तो संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर.
    4. उत्तेजना के बाद दिन 4 - 7 पर, आणविक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा (चित्र 3) या पेप्टाइड-पल्स्ड प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) के साथ सह-संस्कृति।

4. HIPSC व्युत्पन्न CD8 की एंटीजन विशिष्टता को मापने] + एसपी टी सेल

नोट: इस अनुभव के लिए उपयोग किए जाने वाले एपीसी का प्रकार HIPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के MHC प्रतिबंध पर निर्भर करता है। यहाँ, T2 सेल लाइन का उपयोग किया जाता है, जो टी और बी लिम्फोब्लास्टोबाइड सेल लाइनों का एक संकर है। T2 कोशिकाओं HLA-A * 02:0123,जो JKF6 कोशिकाओं से MART1-iPSC18प्राप्त किया गया था द्वारा मान्यता प्राप्त है व्यक्त करते हैं. इस T2 सेल लाइन RPMI 1640 + 20% FBS + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन में विस्तार किया जा सकता है और जब कोशिकाओं 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व तक पहुँचने /

  1. गिनती लाइव HLA-A *02:01+ टी-बी संकर लिम्फोब्लास्टोइड T2 कोशिकाओं एक Neubuer hemocytometer और Trypan नीले रंग का उपयोग कर. 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में इनक्यूबेट एपीसी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए 1 g/mL MART-1 पेप्टाइड।
    नोट: इष्टतम पेप्टाइड एकाग्रता चर है, सेल लाइन और प्रतिजन विशिष्टता के आधार पर.
  2. APCs लीजिए और किसी भी अतिरिक्त पेप्टाइड को दूर करने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ 2x धोने.
  3. एपीसी की गणना करें और ओपी 9 मीडिया में 100 आईयू आईएल-2 और 5 एनजी/एमएल आईएल-7 के साथ 2 - 5 x 105 सेल/ एक अल्ट्रा कम लगाव यू नीचे 96 अच्छी तरह से थाली या सीधे एक पूर्व लेपित ELISpot प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल निलंबन (2-5 x 104 कोशिकाओं) के 100 $L.
  4. सॉर्ट hiPSC व्युत्पन्न CD8] + एसपी टी कोशिकाओं (1 सप्ताह विरोधी मानव CD3/CD28 एंटीबॉडी उत्तेजना के बाद) एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर और 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर 100 IU आईएल -2 और 5 ng/mL आईएल-7 के साथ OP9 मीडिया में निलंबित। 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 - 20 एच के लिए APCs और संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल निलंबन (1 x 105 कोशिकाओं) के Alicot 100 $L।
  5. 16 - 20 ज के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ELISpot परख द्वारा साइटोकीन स्राव प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करें (चित्र 4)।

Representative Results

13 दिनों के बाद HIPSCs OP9/DLL1, CD34+CD43+ hematopoietic जनक कोशिकाओं के साथ सह-रचना दिखाई दिया (चित्र 1) . एचएससीएफ, एचएएलटी3एल, और आईएल-7 की उपस्थिति में गैर-जेलेटिनाइज्ड OP9/DLL1 पर संस्कृति के एक अतिरिक्त 22 दिनों के बाद, हीमाटोपोइटिक संतति सीडी 3 + सीडी7+सीडी 4+सीडी 4+सीडी 8+ डबल सकारात्मक (डीपी) टी वंश कोशिकाओं, जिनमें से अधिकांश ने एम.टी.आर. को एम.टी.-1 एपिटोप (टेट्रामर) के लिए विशिष्ट व्यक्त किया (चित्र 2)।

यह पहले से पता चला है कि CD8+ एसपी टी कोशिकाओं CD4 से प्रेरित किया जा सकताहै +CD8+ डीपी टी कोशिकाओं टीसीआर एगोनिस्ट पेप्टाइड या एंटीबॉडी चालित TCR उत्तेजना के माध्यम से संकेत द्वारा24,25. इसलिए, संस्कृति के 35 दिन, hiPSC व्युत्पन्न CD4+CD8+ डी पी टी कोशिकाओं विरोधी मानव CD3 और विरोधी मानव CD28 एंटीबॉडी के साथ हिसिल-7 और आईएल-2 की उपस्थिति में प्रेरित किया गया.  उत्तेजना के चार दिनों के बाद, CD3 की संख्या+CD8] + सपा कोशिकाओं नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है और MART-1 epitope के लिए विशिष्ट बने रहे, उनके विरासत में मिला प्रतिजन विशिष्टता के संरक्षण की पुष्टि ( चित्र3).

HIPSC व्युत्पन्न CD8 के कार्यात्मक गुणों का निर्धारण करने के लिए+ SP T कोशिकाओं, प्रतिजन पर निर्भर सक्रियण और इंटरफेरॉन गामा के स्राव (IFN-जेड) का विश्लेषण किया गया था। 1 सप्ताह के लिए विरोधी मानव CD3 और विरोधी मानव CD28 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना के बाद, hiPSC व्युत्पन्न CD8]+ एसपी टी कोशिकाओं एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर अलग कर रहे थे और सह T2 सेल लाइन के साथ खेती HLA-A * 02:01 के साथ या बिना cognate MART1 पेप्टाइड के लिए 16 - 20 एच. ELISpot परख से पता चला है कि HIPSC व्युत्पन्न CD8] + एसपी टी कोशिकाओं की तुलना में IFN-जेड की उच्च मात्रा स्रावित, जब MART-1 पेप्टाइड की उपस्थिति में सुसंस्कृत. IFN-जेड अभिव्यक्ति केवल टी कोशिकाओं और APCs के लिए शून्य था, यह दर्शाता है कि मानव टी-iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं प्रतिजन-विशिष्ट और कार्यात्मक हैं (चित्र 4)।

Figure 1
चित्र 1: HIPSC व्युत्पन्न हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाओं का उत्पादन। (ए) ओपी 9/DLL1 सह-संस्कृति का उपयोग करते हुए हेमेटोपोइटिक वंश के लिए HIPSCs के भेदभाव का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी)दिन 1 (ऊपर बाएं), 3 (ऊपर दाएं), 7 (नीचे बाएं), और 13 (नीचे दाएं) पर HIPSC व्युत्पन्न संरचनाओं की उपस्थिति। स्केल बार्स ] 100 डिग्री मी. (सी) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण hiPSC व्युत्पन्न CD34+CD43+ hematopoietic जनक कोशिकाओं पर दिन 13. डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (द $ 1 से 2)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: HIPSC भेद में Mart1+ CD4+CD8 ]+ डी पी टी टी कोशिकाओं| (ए) ओपी 9/DLL1 सह-संस्कृति का उपयोग करके अपरिपक्व टी कोशिकाओं के लिए HIPSC व्युत्पन्न हेमेटोपोइटिक वंश के भेदभाव का योजनाबद्ध अवलोकन। (B)सीडी 4 बनाम सीडी8 जेड, सीडी 3 बनाम सीडी 8 जेड, और HIPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में MART-1 टेट्रामर अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण 35 दिन। लिम्फोसाइटों, एकल कोशिकाओं, पीआई नकारात्मक पर gated. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (द $ 3 - 8)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सीडी8 का प्रेरण़ ़ ़ ़ SP T सेल फीनोटाइप| CD4 के प्रवाह cytometric विश्लेषण- hiPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं 4 दिन मानव विरोधी CD3 और मानव विरोधी CD28 एंटीबॉडी संचालित उत्तेजना के बाद. लिम्फोसाइटों, एकल कोशिकाओं, पीआई ऋणात्मक (द ] 4) पर गेट किया गया।   कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: HIPSC व्युत्पन्न CD8की एंटीजन विशिष्टता ]+ SP T कोशिकाओं| आईएफएन-जेड स्राव HIPSC व्युत्पन्न CD8 की परखद्वारा + SP, CD8] + SP, और थोक टी कोशिकाओं के बाद 20 h सह-संस्कृति के साथ या बिना T2 कोशिकाओं स्पंदित (या नहीं) MART-1 पेप्टाइड के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

OP9 murine stromal कोशिकाओं की सह संस्कृति HSPCs और pluripotent स्टेम कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों (यानी, एनके, बी, और टी कोशिकाओं) के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली है। पायदान संकेतन टी वंश प्रतिबद्धता प्रेरित करने के लिए आवश्यक है और पायदान ligand DLL1 या DLL4, जो टी सेल पीढ़ी1के लिए तुलनीय प्रभावकारिता है की अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा पूरा किया जा सकता है. इसलिए, OP9/DLL1 सह-संस्कृति प्रणाली इन विट्रो में टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बन गया है।  इसके अलावा, इस विधि कई प्रकार और मानव कोशिकाओं के स्रोतों के साथ उपयोग के लिए लागू है, गर्भनाल रक्त सहित, अस्थि मज्जा HSPCs और ESCs.  तथापि, इन स्त्रोतों से टी कोशिकाओं का उत्पादन या तो स्रोत कोशिकाओं की अपर्याप्त पुनर्प्राप्ति द्वारा अथवा टी कोशिकाओं1में अक्षम विभेद द्वारा सीमित है। साथ ही, एक एकल TCR पुनर्संयोजन के साथ एक T सेल उत्पाद इन खुले प्रदर्शनों संग्रह स्रोत से उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। पुनर्योजी चिकित्सा तकनीकों, अर्थात् प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, यह सेल आधारित चिकित्सा15में उपयोग के लिए प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की भारी संख्या का उत्पादन करने के लिए संभव हो सकता है।

hiPSCs आत्म-नवीनीकरण, असीम विस्तार, और शरीर में किसी भी प्रकार के दैहिक सेल में अंतर करने की क्षमता के लिए अपनी क्षमता में pluripotent ESCs के समान हैं; हालांकि, वे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए भ्रूण मूल के उत्पादों के उपयोग के आसपास नैतिक चिंताओं की कमी है. इसके अलावा, hiPSCs व्यक्तिगत दवा के लिए सेल उत्पादों के विकास की अनुमति, किसी भी दैहिक सेल से उत्पादन किया जा सकता है। पिछली रिपोर्टों में, hiPSCs मानव टी कोशिकाओं से पूरे परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग कर उत्पादन किया गया है, CD3+ कोशिकाओं, या अलग साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) एक स्रोत के रूप में18,19,22, 26जब hiPSCs एक टी सेल स्रोत (T-iPSCs) से उत्पन्न कर रहे हैं, मूल TCR जीन पुनर्व्यवस्थित विरासत में मिला है. इसलिए, रोगी टी-iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं एक मरीज के अलग कैंसर प्रतिजनों को लक्षित करके व्यक्तिगत अधिनियम उपचार के लिए एक मॉडल प्रदान कर सकते हैं।

मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के टी वंश कोशिकाओं में भेदभाव दो चरणों में विभाजित है: hematopoietic जनक कोशिकाओं की पीढ़ी (HPCs)27 और टी वंश कोशिकाओं में उनके आगे भेदभाव21. दोनों चरणों OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ओपी 9/डीएलएल1 फीडर सेल की गुणवत्ता टी सेल भेदभाव की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि OP9/DLL1 कोशिकाओं एक अमर समरूप सेल लाइन नहीं हैं, FBS और संस्कृति की स्थिति की गुणवत्ता HIPSC भेदभाव का समर्थन करने की क्षमता खोने के बिना अपने विस्तार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, यह FBS और मार्ग के बहुत से पूर्व मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है लगातार जब सेल से सेल कोशिका द्रव्यीय संपर्क होने के लिए शुरू होता है, ताकि सेल भेदभाव और जीर्णता को रोकने के लिए. ध्यान में रखने के लिए एक बिंदु यह है कि सेल से सेल संपर्क चरण कंट्रास्ट और माइक्रोस्कोप के आवर्धन के आधार पर पृष्ठभूमि से अविवेच्य प्रकट कर सकते हैं. हमारे अनुभव में, सबसे OP9/DLL1 व्यंजन 80% confluent जब पारित करने के लिए तैयार दिखाई देगा.

यह दिखाया गया है कि OP9/DLL1 सह-संस्कृति द्वारा टी-आई पी एस सी से उत्पन्न अलग-अलग टी वंश कोशिकाओं उत्तेजना18,19पर CD8+ एसपी टी कोशिकाओं का उत्पादन कर सकते हैं। तथापि, पुनरुज्जीवित CD8+ SP T कोशिकाएं सहज-जैसे CD8 की प्राप्ति करती हैं - होमोडीमर22,28, जो TCR संकेत29के लिए एक अप्रभावी सह-ग्राही है।  इसके अतिरिक्त, इन पुनर्जीवित CD8+ एसपी टी कोशिकाओं मजबूत TCR स्वतंत्र cytotoxicity दिखाया है, इन कोशिकाओं नैदानिक उपयोग के लिए प्रतिकूल बना30. यह प्रोटोकॉल हाल ही की एक विधि का वर्णन करता है जिसमें शुद्ध CD4+CD8+ डीपी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक अधिक पारंपरिक फीनोटाइप और बेहतर प्रतिजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी22के साथ CD8 ]+ एसपी टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक हाल ही की विधि का वर्णन करता है। हालांकि माध्यमिक टीआरआर के कारण प्रतिजन विशिष्टता की हानि - एलीलिक पुनर्व्यवस्थित लंबे समय तक लंबी अवधि की संस्कृति के बाद डीपी चरण में होती है, यह टी-आईपीएससी31में जीनोम संपादन द्वारा दूर किया जा सकता है।  हमारे अनुभव में, HIPSC व्युत्पन्न डीपी सेल संस्कृति के 30 - 35 दिन पर प्रदर्शित करने के लिए शुरू, और इन नव उत्पन्न डीपी कोशिकाओं अभी तक माध्यमिक TCR] पुनर्व्यवस्था नहीं आया है. इसलिए, दिन पर सबसे अधिक डीपी कोशिकाओं 35 प्रतिजन विशिष्टता बनाए रखने और प्रतिजन-विशिष्ट CD8]+ एसपी टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

मानव विरोधी CD3 और विरोधी CD28 उत्तेजना से पहले दिन 35, CD4-CD8- डीएन कोशिकाओं को संस्कृति से हटा दिया जाना चाहिए, के रूप में इन CD4 + CD8+डीपी कोशिकाओं उत्तेजना22के बाद प्रत्यक्ष हत्या का कारण प्रदर्शन किया गया है . CD4 चुंबकीय मनका संवर्धन का उपयोग करना (चरण 3.10) डीपी और CD4+CD8- मध्यवर्ती एकल सकारात्मक (आईएसपी) कोशिकाओं1,जो हम कोई नकारात्मक प्रभाव22है दिखाया गया है के लिए समृद्ध होगा. वैकल्पिक रूप से, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई डीपी कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय मनका जुदाई पसंद किया जाता है क्योंकि यह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रेरित यांत्रिक तनाव से बचा जाता है।

सीडी8 की पीढ़ी+ एसपी टी कोशिकाओं मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सक्रियण के बिना मध्यस्थता एगोनिस्ट चयन बाद में 3 डी murine stromal सेल संस्कृति32के उपयोग से प्रदर्शन किया गया है. तथापि, शारीरिक सकारात्मक चयन स्व-पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों के साथ टीसीआर की अन्योन्यक्रिया पर निर्भर करता है, जो विशिष्ट रूप से संसाधित होते हैं और थाइमिक कॉर्टिकल उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत किए जातेहैं। इसके अलावा, चयन पेप्टाइड्स के लिए टीसीआर आत्मीयता परिपक्व CD8 के बाद कार्यात्मक क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए दिखाया गया है] + एसपी टी कोशिकाओं34.  वर्तमान में, वहाँ कोई सबूत नहीं है सुझाव है कि एक पायदान stromal सेल आधारित सह संस्कृति प्रणाली परिभाषित चयन पेप्टाइड और MHC जटिल शारीरिक सकारात्मक चयन के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं.

यह पहले एक murine मॉडल में सूचित किया गया है कि टी वंश कोशिकाओं ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल व्युत्पन्न hiPSCs से उत्पन्न OP9/DLL1 अकेले पारंपरिक परिपक्वता का अनुभव करने में विफल. तथापि, ओपी 9/DLL1 प्रणाली द्वारा उत्पन्न iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति प्रणाली 28,35में आगे शारीरिक थाइमिक शिक्षा द्वारा भोली-जैसे टी कोशिकाओं में परिपक्व हो सकता है। इसलिए, IPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं OP9/DLL1 प्रणाली द्वारा उत्पन्न उत्पादन करने के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ vivo में लंबी अवधि के हठ में सक्षम वास्तविक मानव ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट पोस्ट-थाइमिक टी कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए आगे के प्रयासों के लिए महत्वपूर्ण है स्थापित संवहनी ट्यूमर का इलाज करने के लिए दक्षता।

Disclosures

लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

Acknowledgments

हम एलन बी Hoofring और Erina एच धन्यवाद वह आलेखी सहायता के लिए। इस शोध राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (जियाई BC010763) और सेल आधारित कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए Intramural NCI कैंसर Moonshot पहल.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm dish Corning, Inc.  353003
Anti-CD3, human BD Biosciences Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human BD Biosciences Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human Biolegend Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human BD Biosciences Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human BD Biosciences Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human BD Biosciences Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human BD Biosciences Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human BD Biosciences Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-387
CD4 Microbeads, human Miltenyl Biotec 130-045-101
Cell strainer 100 um Fisher Scientific 22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-500
Flt-3 ligand R&D Systems 427-FL
Gelatin Solution 2%  SIGMA-Aldritch G1393-100ML
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free Gibco 14025-092
Interleukin-2 R&D Systems 202-IL
Interleukin-7 R&D Systems 407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35) InnoPep 3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
αMEM powder Gibco 61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Thermo Fisher Scientific C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1 Riken Bioresource center Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) Tocris 1254
RPMI 1640 Gibco 11875093
Stem Cell Factor (SCF) R&D Systems 455-MC
StemPro EZPassage 23181-010
T2-tumor ATCC T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) 
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25200-072
U Bottom 96 well plate Corning, Inc.  3799

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 152 pluripotent स्टेम सेल प्रेरित pluripotent स्टेम सेल इम्यूनोलॉजी दत्तक कोशिका हस्तांतरण टी सेल भेदभाव ट्यूमर प्रतिजन विशिष्टता
ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करना
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Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda, T., Tamaoki, N., Malekzadeh, P., Kawamoto, H., Restifo, N. P. Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (152), e59997, doi:10.3791/59997 (2019).

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