Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler
Summary
Vi beskriver en metode til karakterisering af Proton-drevne membran transportører i membran vesikle præparater fremstillet ved heterologe udtryk i E. coli og lysis af celler ved hjælp af en fransk presse.
Abstract
Flere metoder er udviklet til funktionelt at karakterisere nye membran transportører. Polyaminer er allestedsnærværende i alle organismer, men polyamin vekslere i planter er ikke blevet identificeret. Her skitserer vi en metode til at karakterisere polyamin antibærere ved hjælp af membran vesikler genereret fra lysis af Escherichia coli celler heterologously udtrykker en plante antiporter. For det første, vi heterologously udtrykte AtBAT1 i en E. coli stamme mangelfuld i polyamin og arginin udveksling transportører. Vesikler blev fremstillet ved hjælp af en fransk presse, renset af ultracentrifugering og anvendes i en membranfiltrering assay af mærkede substrater til at demonstrere substratspecificitet af transportøren. Disse assays viste, at AtBAT1 er en proton-medieret transportør af arginin, γ-aminosmørsyre (GABA), putrescine og spermidine. Den mutante stamme, der blev udviklet til assay af AtBAT1 , kan være nyttig til den funktionelle analyse af andre familier af plante-og dyre polyamin vekslere. Vi også hypotese, at denne fremgangsmåde kan bruges til at karakterisere mange andre typer af antibærere, så længe disse proteiner kan udtrykkes i bakteriecelle membranen. E. coli er et godt system til karakterisering af nye transportører, da der er flere metoder, der kan anvendes til mutagenize indfødte transportører.
Introduction
Proteiner, der er involveret i handel med metabolitter, udgør et væsentligt niveau for fysiologisk regulering, men langt størstedelen af plantens membran transportører er endnu ikke funktionelt karakteriseret. Flere strategier er blevet gennemført for at karakterisere nye transportproteiner. Heterologe udtryk i modelorganismer såsom E. coli og eukaryotiske celler såsom gær, xenopus oocytter, pattedyrsceller, insekt celler og planteceller er alle blevet brugt til at bestemme deres transportaktivitet1. Eukaryote celler er begunstiget for ekspression af eukaryote proteiner, fordi den grundlæggende cellulære sammensætning, signal transducere veje, transskription og oversættelse machineries er forenelige med de indfødte forhold.
Gær har været en vigtig model organisme til karakterisering af nye transport proteiner i planter. Den første vegetabilske transport protein, der blev udtrykt med succes i gær (Saccharomyces pombe) var hexoseenheder transporter HUP1 fra chlorella2. Siden da er mange vegetabilske transportproteiner blevet funktionelt karakteriseret ved hjælp af et gærudtryks system. Disse omfatter vegetabilske sukker transportører (SUC1 og SUC23, VfSUT1 og VfSTP14) og auxin-transportører (AUX1 og PIN5). Ulemper ved at udnytte gær til at udtrykke vegetabilske proteiner kan omfatte nedsat aktivitet af plastid-lokaliserede proteiner, fordi gær mangler denne organelle, mistargeting6, og dannelse af misfoldede aggregater og aktivering af stress respons i gær på grund af over ekspression af membran proteiner7,8,9.
Heterologe udtryk af transportproteiner i Xenopus oocytter har været meget anvendt til elektrofysiologisk karakterisering af transportører10. De første vegetabilske transport proteiner karakteriseret ved hjælp af heterologe udtryk i Xenopus oocytter var Arabidopsis kalium kanalen KAT110 og Arabidopsis hexoseenheder transporter STP111. Siden da har Xenopus oocytter været ansat til at karakterisere mange vegetabilske transport proteiner såsom plasma membran transportører12, VAKUOLAR saccharose transporter SUT413 og vakuolar Malate transportør ALMT914. En vigtig begrænsning af Xenopus oocytter til transport assays er, at koncentrationen af intracellulære metabolitter ikke kan manipuleres1. Desuden er det nødvendigt med faglig viden for at forberede Xenopus oocytter, og variabiliteten af oocyt-batcher er svær at kontrollere.
Heterologt udtryk i den model organisme E. coli er et ideelt system med hensyn til karakterisering af nye vegetabilske transport proteiner. Med et fuldt sekvenserede genom15er de molekylære og fysiologiske karakteristika ved E. coli velkendte. Molekylære værktøjer og teknikker er veletablerede16. Desuden er forskellige udtryks vektorer, ikke-sygdomsfremkaldende stammer og mutanter tilgængelige17,18,19. Desuden, E. coli har en høj vækstrate og kan let dyrkes under laboratorieforhold. Mange proteiner kan let udtrykkes og renses ved høje mængder i E. coli9. Når proteiner ikke kan blive analyseret direkte i cellulære systemer, har rekonstitution af proteiner i Liposomer også været en vellykket, omend udfordrende nyskabelse for karakterisering af rensede membran proteiner. Funktionel karakterisering af planten mitokondrie transport proteiner, herunder opløst stof transportører såsom fosfat transportører i sojabønner, majs, ris og Arabidopsis, dicarboxylat-tricarboxylat bærer i Arabidopsis er opnået ved hjælp af denne model system20,21. Imidlertid fandtes rekombinante proteiner af tomat protein SICAT9 at være nonfunktionelle i rekonstitutionseksperimenter, og andre medlemmer af Cat transporter familien fandtes at være nonfunktionelle i xenopus oocyt assays22. Således er der behov for yderligere molekylære værktøjer til karakterisering af membran transportører.
Fem polyamin transportsystemer findes i E. coli23. De omfatter to ABC-transportører, der formidler optagelsen af spermidin og putrescine, en putrescine/ornithine-veksler, en cadaverin/lysin-veksler, en spermidineksportør og en putrescine-importør. Den putrescine veksler pote var oprindeligt karakteriseret ved hjælp af en vesikelprotein assay, hvor indersiden ud vesikler blev fremstillet ved at lyserende celler med en fransk presse og måling optagelsen af radioaktivt mærket putrescine i vesikler i bytte for ornithin24. Vesicle assays blev også brugt til at karakterisere en calcium transportør, som medierede transport af calcium som reaktion på en protongradient25. Disse eksperimenter fik os til at udvikle en strategi for karakterisering af andre polyamin vekslere. Vi har først skabt en stamme af E. coli mangelfuld i pote og cadb vekslere. Her viser vi den funktionelle karakterisering af en plante polyamin antiporter ved heterlogt udtryk i den modificerede E. coli stamme, generation af membran vesikler ved hjælp af en fransk presse, og radioaktivt mærkede assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
I nærværende undersøgelse skitserer vi en metode til karakterisering af en antiporter ved først at udtrykke proteinet i E. coli og derefter generere membran vesikler, således at det heterologously udtrykte protein kan blive analyseret i et celle frit system. Ud over udstyr, der findes i de fleste molekylære biologi laboratorier, denne strategi kræver brug af en fransk presse, en ultracentrifuge, og adgang til en facilitet til at udføre radioisotop assays.
Et grundlæggende kra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtte til dette projekt kom fra BGSU Graduate College, og BGSU Office af sponsorerede programmer og forskning.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
References
- Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
- Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
- Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker’s yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
- Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
- Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
- Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
- Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
- Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
- Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
- Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
- Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
- Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
- Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
- Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
- Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
- Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
- Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
- . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
- . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
- . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
- Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
- Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
- Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
- Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
- Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
- Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
- LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
- Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
- Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
