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Biochemistry

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

フランスのプレスを用いた大腸菌の異種発現と細胞の分解によって産生される膜小胞製剤におけるプロトン駆動膜トランスポーターの特性評価方法について説明する。

Abstract

新規膜トランスポーターを機能的に特徴付けるいくつかの方法が開発されている。ポリアミンはすべての生物において普遍的であるが、植物中のポリアミン交換器は同定されていない。ここでは、異種植物抗ポーターを発現する大腸菌細胞の分解から発生する膜小胞を用いてポリアミン抗ポーターを特徴付ける方法を概説する。まず、ポリアミンおよびアルギニン交換トランスポーターにおいて欠損した大腸菌株中のAtBAT1を異種発現した。小胞は、フランスのプレスを使用して製造され、超遠心分離によって精製され、トランスポーターの基質特異性を実証するために標識基板の膜濾過アッセイに利用された。これらのアッセイは、AtBAT1がアルギニン、γ-アミノ酪酸(GABA)、プトレシンおよびスペルミジンのプロトン媒介トランスポーターであることを実証した。AtBAT1のアッセイのために開発された変異株は、植物および動物ポリアミン交換器の他のファミリーの機能解析に有用であり得る。我々はまた、これらのタンパク質が細菌細胞膜で発現できる限り、このアプローチは他の多くのタイプの抗ポーターを特徴付けるために使用できると仮定する。大腸菌は、ネイティブトランスポーターを変異化するために使用することができる複数の方法があるので、新規トランスポーターの特性評価のための良いシステムです。

Introduction

代謝産物の密売に関与するタンパク質は、生理学的調節の本質的なレベルを構成するが、植物膜トランスポーターの大半はまだ機能的に特徴付けされていない。新規輸送タンパク質を特徴付けるために、いくつかの戦略が実施されている。酵母、ゼノプス卵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞などの大腸菌および真核細胞などのモデル生物における異種発現は、いずれもその輸送活性を決定するために使用されている1。真核細胞は真核生物タンパク質の発現に好まれ、基本的な細胞組成、シグナル伝達経路、転写および翻訳機械は、天然の条件と互換性があるからである。

酵母は、植物における新規輸送タンパク質の特性評価のための重要なモデル生物となっています。酵母(サッカロミセスポンベ)で正常に発現した最初の植物輸送タンパク質は、クロレラ2からヘキ酸トランスポーターHUP1であった。それ以来、多くの植物輸送タンパク質は、酵母発現系を用いて機能的に特徴付けられてきた。これらには、植物糖トランスポーター(SUC1およびSUC23、VfSUT1およびVfSTP14)およびオーキシントランスポーター(AUX1およびPIN5)が含まれる。植物タンパク質を発現するために酵母を利用する欠点は、酵母がこのオルガネラを欠いているため、プラスチド局在タンパク質の活性障害、6を誤って標的化し、膜タンパク質の過剰発現による酵母における誤折凝集体およびストレス応答の活性化を含むことができる。

ゼノプス卵母細胞における輸送タンパク質の異種発現は、トランスポーター10の電気生理学的特性評価のために広く使用されている。ゼノプス卵母細胞における異種発現を用いて特徴づけられた最初の植物輸送タンパク質は、アラビドプシスカリウムチャネルKAT111およびアラビドプシスヘキソプシストランスポーターSTP111であった。それ以来、ゼノプス卵母細胞は、血漿膜トランスポーター12、空胞スクローストランスポーターSUT413および空胞軟質泌トランスポーターALMT914などの多くの植物輸送タンパク質を特徴付けるために採用されている。輸送アッセイのためのゼノプス卵母細胞の重要な制限は、細胞内代謝産物の濃度が操作できないということです 1.さらに、ゼノプス卵母細胞を調製するために専門的な知識が必要であり、卵母細胞バッチの変動性を制御することは困難である。

モデル生物大腸菌における異種発現は、新規植物輸送タンパク質の特性評価の点で理想的なシステムである。完全に配列されたゲノム15では、大腸菌の分子的および生理学的特徴がよく知られている。分子ツールと技術は十分に確立されています16.加えて、異なる発現ベクター、非病原性株および変異体は、17、18、19で利用可能である。さらに、大腸菌は高い成長率を有し、実験室条件下で容易に成長することができる。多くのタンパク質は、大腸菌9において高量で容易に発現および精製することができる。タンパク質を細胞系で直接アッセイできない場合、タンパク質をリポソームに再構成することも成功していますが、精製膜タンパク質の特性評価に関する革新は困難です。植物ミトコンドリア輸送タンパク質の機能特性評価は、大豆中のリン酸トランスポーターなどの溶質トランスポーターを含む、トウモロコシ、米およびアラビドプシス、ジカルボン酸トリカルボン酸キャリアをアラビドプシス中で、このモデルシステム20、21を用いて達成されている。しかしながら、トマトタンパク質SICAT9の組換えタンパク質は再構成実験において機能的でないことが判明し、CATトランスポーターファミリーの他のメンバーはゼノプス卵母細胞アッセイ22において機能的でないことが判明した。したがって、膜トランスポーターの特性評価には追加の分子ツールが必要です。

5つのポリアミン輸送システムが大腸菌23に見られる。彼らは、スペルミジンとプトレシンの取り込みを仲介する2つのABCトランスポーター、プトレシン/オルニチン交換器、カダベリン/リジン交換器、スペルピジン輸出業者とプトレシン輸入業者が含まれます。プトレシン交換器PotEはもともと小胞アッセイを使用して特徴付けられていたが、そこではフランスのプレスで細胞をライジングし、オルニチン24と引き換えに放射性標識プトレシンの取り込みを測定することによって小胞を調製した。小胞アッセイはまた、プロトン勾配25に応答してカルシウムの輸送を媒介するカルシウムトランスポーターを特徴付けるために使用された。これらの実験は、他のポリアミン交換器の特性評価のための戦略を開発することを促しました。私たちはまず、PotEとCadB交換器で大腸菌欠乏株を作成しました。ここでは、修飾大腸菌株における異種発現による植物ポリアミン抗ポーターの機能的特徴、フランス語プレスを用いた膜小胞の生成、放射線標識アッセイを示す。

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Protocol

1. P1転起を伴う大腸菌ダブルノックアウト変異体の生成

  1. 大腸菌遺伝ストックセンター(http://cgsc.biology.yale.edu)から大腸菌単一ノックアウト変異株ΔPotEおよびΔCadBを取得する。
    注:ΔPotE株はカナマイシン耐性26であり、ΔCadB株はテトラサイクリン耐性27である。
  2. P1伝達プロトコル28を使用してPotE/CadBダブルノックアウト(DKO)株を構築します。
    1. リサート製剤
      1. 10-25 mM MgCl2、5mM CaCl2、および0.1-0.2%グルコースを補充した新鮮なLB(1:100)でΔPotEの一晩培養を希釈する。
      2. 1-2時間37°Cで成長する。
      3. 培養物に40μLのP1ファージリジン酸塩を加え、37°Cで成長を続ける。培養がライズされるまで1-3時間監視
        注:培養物がリンパ節に入ると、細胞の破片がチューブに見え、培養物は濁度の著しい損失を持つことになります。
      4. 溶解物と渦にクロロホルム(50~100°L)を数滴加えます。12,000 x gで2分間遠心分離機を行い、細胞の破片を除去し、上清を新鮮なチューブに移します。
    2. 伝達
      1. LB培地で一晩ΔCadB株を成長させる。
      2. 4,000 x gで2分間遠心分離して細胞を収穫し、100 mM MgSO4および5 mM CaCl2を補充した新鮮なLBで収穫された培養量を1/5-1/3で再中断する。
      3. ΔCadB細胞懸濁液をステップ1.2.1.4のファージでチューブに加え、急速に混合します。
      4. 200 μLの1 M Na-クエン酸(pH5.5)を加え、37°Cで1mLのLBを1mL加えて抗生物質耐性マーカーの発現を可能にします。
      5. 4000 x gで 5 分間スピンセル。
      6. 100 mMのナクエン酸Na-クエン酸(pH 5.5)とボルテックスをよく用いて100μL LBで再サスペンドし、細胞を分散させます。
      7. 50μg/mLカナマイシンおよび10μg/mLテトラサイクリンを有するLB寒天プレート上の組換え株を選択し、適切なプライマー26、27でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認する。
      8. シーケンスを使用して PCR フラグメントを確認します。

2.大腸菌変異体における標的遺伝子(AtBAT1)の発現

  1. PCRによって標的遺伝子の全長配列を増幅し、ゲートウェイ入力ベクターpENTR/D-TOPO29に挿入する。
    注:この場合、ATBAT1.1はフォワードプライマー5'CGGCGATGTTTGtTとリバースプライマー5'GCTAGAATGTGtGTGGを使用して増幅されました。 最初の変性は98°Cで2分間、次に98°Cで30サイクルの変性を0.1分、0.3分で59°Cでアニーリング、72°Cで0.40分、最終延長が72°Cで10分間延長される。PCR製品をPCRクリーンアップキットを用いて精製し、分光計を用いて定量した。ゲートウェイベクトルへのPCR産物の挿入は、マニュファクサーの指示に従って行った。
    1. 入り口ベクトルをヒートショックによって有能なTop10大腸菌細胞に変換し、標準的な分子クローニングプロトコル30に続く50μg/mLカナマイシンを有するLB媒体上で正常な組み換えを選択する。
    2. プラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを抽出し、メーカーの指示に従い、正しい挿入を確認する配列を示す。
  2. 標的遺伝子を大腸菌宛先ベクターに移し、ゲートウェイLRクローニングによりpBAD-DEST49を発現ベクター29を作成する。
    1. 発現ベクターを30sのヒートショックによって有能なTop10大腸菌細胞に変換し、100μg/mLアンピシリン30でLB媒体上で成功した組換え剤を選択する。
    2. プラスミドDNA30と配列を抽出し、正しい挿入を確認する。
  3. 発現ベクターを大腸菌ΔpotE740(デル):::kan、ΔcadB2231::Tn10に変換し、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン30を用いてLBプレート上で選択する。
  4. 誘導のためのアラビノースの最適な濃度を決定するために、29記載のアラビノースの勾配濃度を有するLB媒体中のaraBADプロモーターの制御下で標的遺伝子を発現する。
  5. 細胞ペレットを収集し、製品マニュアル29に記載されているようにSDS-PAGEおよびタンパク質バンドの可視化によってタンパク質発現を評価する。
    注:大腸菌ΔpotE740(デル)::kan,ΔcadB2231::Tn10 を BAT1 発現のない対照サンプルとして使用しました。大腸菌は、空のpBAD-DEST49ベクターを有する変異細胞をノックアウトし、ベクター中にccdB遺伝子が存在するため対照として使用されなかった。

3. 内面膜小胞の生成

  1. 標的タンパク質を発現する大腸菌変異細胞を5mLのポリアミンフリーメディア(2%グリセロール、K2HPO4の6g、KH2PO4の3g、NaClの0.5g、 NH4Cl, チアミンの 50 mg, 0.79 g 酵母完全合成媒体アデニンヘミ硫酸塩 (10 mg/L), L-アルギニン (50 mg/L), L-アスパラギン酸 (80 mg/L), L-ヒスチ 塩酸塩酸一水和物 (20 mg/L), L-ロイシン (100 mg/L), L-リジン塩酸塩 (50 mg/L), L-メチオニン (20 mg/L),L-フェニルアラニン (50 mg/L), L-スレオニン (100 mg/L), L-トリプトファン (50 mg/L), L-チロシン (50 mg/L), L-バリン (140 mg/L), ウラシル (20 mg/L)。この培養物を0.0002%アラビノースを補充したポリアミンフリーメディアの500mLに移し、細胞培養が0.6〜0.8のOD600(通常〜〜5時間)に達するまで増殖させる。
  2. 4°Cで15分間、2,000 x gで遠心分離して細胞ペレットを採取します。ペレットを再サスペンドし、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液、pH 6.6、10 mM EDTA(バッファ1)を含む3回洗浄します。3 番目のスピン後のバッファー 1 のセルの最終体積は 10 mL である必要があります。
  3. 35 mLフランスの圧力セルを使用して、無傷の細胞のフレンチプレス処理(10,000 p.s.i.)によって内側の膜小胞を生成します。
  4. 標準的なフランスの圧力セルにサンプルをロードする前に、ピストンとOリングを潤滑して、セルに挿入しやすくします。
    メモ：これらの手順は、標準圧力セルの使用に固有です。31.
    1. クロージャプラグをセルの下端に慎重にねじ込みます。セルの横にあるレタリングに基づいて、セルが右上にあることを確認します。ピストンをセルに挿入し、ピストンの最大充填ラインがピストンの上部に到達するまで、セルに移動します。ユニットを裏返し、3つのポストの間に提供されたスタンドに置きます。
    2. 細胞懸濁液を細胞の体内に注ぎます。
      注:私たちは10 mLしか使用していないので、35 mLの容量を持つフランスの圧力セルチャンバーに十分なスペースが残ります。
    3. 標準圧力セルをフランスの圧力セルユニットに取り付けます。
      1. まず、電源がオフになっていることを確認します。パネルの左側には、比率セレクタスイッチがあります。ランの終わりにダウン、より小さい圧力セルを使用する場合は低、標準のフランスの圧力セルで使用する高の 3 つの位置があります。フランスのプレスが以前に小さいセルで使用されていた場合、ピストンは完全に引き込まれていない可能性があります。このスイッチを[下]に設定します。
    4. ユニットの背面にあるRHSのスイッチでマシンの電源を入れ、一時停止実行スイッチを実行位置に切り替えます。これにより、ピストンが完全に引き込まれる。スイッチを[一時停止] に戻し、コンピュータをシャットダウンします。
    5. つまみねじを緩め、2つのステンレス鋼柱にまたがる安全クランプを側面に動かします。右にスイングします。片手で閉鎖プラグのベースを所定の位置に保持し、フランスの圧力セルを両手で上に持ち、180°回転させるので、ピストンは直立した位置にあります。プラットフォームにセットし、安全クランプを所定の位置に戻し、フランスの圧力セルを所定の位置に保持します。
    6. クロージャプラグのフローバルブアセンブリは、操作者がアクセス可能で、バルブを自由に回すことができるように配置する必要があります。フローバルブ アセンブリを反時計回りに開きます。ピストンの腕を2時と8時の位置に配置します。標準圧力セルが所定の位置に保持されるように、親指ねじを締めます。
    7. サンプル出口管を閉鎖プラグに挿入し、壊れた細胞の破片をハヤブサ管に集めることができるように、短いフレキシブルチューブを接続します。通常、300 mL の氷で満たされたビーカーを使用して、ハヤブサチューブを直立に保持し、細胞の破片を冷やしておきます。
    8. [一時停止-実行]スイッチが [一時停止] に設定され、バルブ アセンブリが開いた位置にあることを確認します。マシンの電源を入れ直し、レシオセレクタスイッチを[高]に切り替え、フロントパネルの圧力上昇バルブを約半回転で右に回します。
    9. ピストンは、チャンバー内の空気を置き換えるためにベースから上昇し始めます。サンプル出口管に取り付けられたタイゴンチューブから出る空気をビーカーのチューブに向ける。
    10. 液体の最初の滴が出てきたら、フローバルブアセンブリを時計回りに回して閉じます。これは圧力セルで金属シールに金属を作成しますので、過度に締め付けないでください。
    11. フランスのプレスの前面には、圧力セル内の生体細胞に適切な圧力を生成するためのチャートがフロントパネルに表示されています。この場合、ゲージが640 psiに達するまで、圧力上昇バルブを時計回りに回して圧力を上げます。これにより、10,000 psi の内部圧力が作成されます。
    12. セルが目標圧力に達したら、反時計回りに回してフローバルブアセンブリをわずかに開きます。バルブの開口部を調整して、1分あたり約10滴の流量を許可します。
    13. ピストン本体の停止ラインがフローセルの上部に到達したとき。[一時停止実行スイッチ] を[一時停止] に切り替えます。ピストンをセルに差し込むとユニットが損傷するので、これは重要です。フローバルブ アセンブリを開き、残りのドロップを収集します。
    14. [比率セレクタ]スイッチを[下]に切り替え、[実行の一時停止] スイッチを[実行] に設定します。下部のプレートが完全に取り消されたら、[実行]スイッチを[一時停止]に設定し、マシンの電源を切ります。
    15. フランスのプレスからフランスの圧力セルを取り外し、クリーニングのために分解します。グリセロールの光カバーで乾燥したすべての部分を保管してください。ガスケットやシールを取り外し、摩耗の兆候と交換します。
  5. フランスのプレス溶出剤の壊れていない細胞と細胞破片を、4°Cで15分間10,000 x gで遠心分離して除去します。ペレットを捨て、超遠心管に上清を移す。
  6. 得られた上清から得られたペレット膜小胞は、4°Cで1時間150,000gの超遠心分離によって得られる上清である。
  7. 膜小胞を1回、懸濁することなく、1mMトリスマレイン酸塩で、0.14 M KClを含むpH5.2、2mM 2-メルカプトエタノールおよび10%グリセロールを含み、同じ緩衝液(バッファ2)23にダウンス組織グラインダーを用いて再懸濁する。典型的には、500mLの培養物からの膜分率は、5mLの緩衝液中に懸濁され、そしてバイオキニン酸アッセイ32を用いて膜蛋白質/mLの5〜10mgの濃度である。
  8. 膜製剤の100μLアリコートを1.5 mLマイクロ遠心管に-80°Cで保管してください。

4. ウェスタンブロットとトランスポーターアッセイのオリエンテーション

  1. ステップ 3.7 から小胞を洗浄し、30 mM トリス pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. 100 μLサンプルに、0.1 M NaCl、30 mMトリス、0.2 mM CoCl2 pH 7.8に2 mg/mLカルボキシペプチダーゼAの1 μLを加えます。
  3. 20°Cで20分間接種する。消化を停止するには、0.5 M NaEDTAの5 μL、0.5 M 2-メルカプトエタノールpH 7.5を加えて。
  4. 酵素を完全に不活性化するには、溶液を室温で1時間インキュベートする。
    注:カトボキシペプチダーゼA治療を伴わない小胞を対照として用いた。
  5. 硫酸ドデシルリチウムの存在下で電気泳動によりサンプルを分析します。150 mg/mL のドデシル硫酸リチウム、450 mg/mL グリセロール、0.1 mg/mL ブロモフェノールブルー、0.4 M Tris pH 7.5 ~ 100 μL のサンプルを追加します。
  6. ポリアクリルアミドゲル上に25mMリン酸ナトリウム-リン酸水素pH7.5で湿らせたニトロセルロースフィルターを敷設して免疫ブロッティングを行う。これらを2つの湿ったセルロースフィルターの間に置き、最後に2つの湿ったプラスチック製のスカーリングパッドの間に置きます。この集合体は、25mMリン酸ナトリウム-リン酸水素pH7.5を含むチャンバーの電極間に2〜4°Cに置きます。
  7. タンパク質の電気伝達を20Vおよび2-3Aで3時間進行させる。
  8. ニトロセルロース膜を0.15 M NaCl、10 mMトリス、pH 7.5および0.5 mg/mL Tween 2033のブロッキングバッファーで2°Cで一晩ブロックする。
  9. ブロッキングバッファー(20mL)中の1:5000希釈(C末端)-HRP抗体で2時間のニトロセルロースフィルターをインキュベートし、合計60分間50mLの緩衝液で2回洗浄します。
  10. 免疫ブロットを可視化するには、変性アルコールの20mLに4-クロロ-1ナフトールの6mgを溶解し、30%H2O2の15 mMトリスpH7.5および50 μLの80mLを加える。基板溶液にフィルターペーパーを20分間入ろします。試薬は、ニトロセルロース膜上に青色の沈殿物を形成するために抗体と反応する。十分な色が発達したら、膜を水ですすいで乾燥させます。

5. 輸送アッセイ

  1. 膜小胞の100μLアリコートを12°Cで5分間インキュベートする。
  2. 50μMの最終濃度で膜小胞に放射性標識ポリアミンを添加して輸送を開始する(特に明記されていない限り)。10mM Tris-HCl、10 mM リン酸カリウム、pH 8.0 および 0.14 M KCl23 (バッファー 3) からなるアッセイ バッファーに 3 つの H 基質 (スペルミジンまたはプトレシン) 溶液を、アッセイに応じて修飾して作成します。
  3. 1.5 mLマイクロフュージチューブで12°Cで1分間輸送アッセイを行います。
  4. 1分後、反応混合物を濾過マニホールドに移し、0.45μmニトロセルロース膜フィルターを通して濾過する。
    1. 10倍の高濃度の無ラベルポリアミンを含む3mLの氷冷アッセイバッファーを追加し、続いてポリアミンを含まない3mLのアッセイバッファーを加え、非特異的結合を低減します。
    2. 洗浄したフィルターを10mLのシンチレーション液体を含む20 mLの使い捨てシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射能を決定します。シンチレーションカウンタは、サンプル中の放射能を測定し、分単位の崩壊(dpm)として報告します。
  5. 正味ポリアミン取り込みは、12°Cでインキュベートした小胞による1分間の取り込みと、氷上でインキュベートされた小胞による0分間の取り込みとの差として計算する。
    注:小胞にインポートされた基板の質量は、以下のように計算される。マイクロファジチューブ内のサンプル体積が0.2μLで、基板の開始濃度が100μMの場合、マイクロファジチューブ内の基板の総質量は20 x10-12Mです。商業的に標識された基板(多くの場合2.22 x 109 dpm/mM)の特異的活性が非常に高いため、添加された同位体の質量は計算において無視することができる。したがって、マイクロファジチューブに添加された同位体の総量が100 x 106 dpmで、小胞が1,000 dpmの正味取り込みがあった場合、小胞によって取り込まれた基質の総質量は、基質のモル数の1%または2x10-13 Mであった。
    1. 10、25、50、250、500および500μMの放射性標識基板の取り込み対象タンパク質を発現する小胞に測定して、基板のKmを決定する。統計ソフトウェアパッケージ34のマイケリス・メントンモデルを用いて非線形回帰法を用いてマイケリス・メンテン動態を計算する。
  6. 競技実験では、100μM、500μM、1 mM、1.5 mMMまたは2 mMの非標識競争力のある基板を、12°Cの小胞100μLを含む1.5 mLマイクロ遠心管に加えます。
    1. 放射性標識ポリアミン(50μM)をマイクロ遠心管に同時に加えます。
    2. 手順 5 ~ 5.4.2 を繰り返して、上記のように小胞の内部に閉じ込められた放射能を測定します。
    3. 100μM以上の非標識基板の存在下で10、25、50、250、500および500μMの放射標識ポリアミンの取り込み量を測定し、非線形回帰法を使用して曲線をプロットすることにより、競合基板の明らかなKm(K m,app)を決定します。

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Representative Results

このプロトコルの主な手順は、図 1にまとめて説明します。簡単に説明すると、大腸菌細胞は、すべてのポリアミン交換器で欠損し、AtBAT1を発現し、培養、遠心分離、緩衝液で洗浄し、フランスのプレスを使用して細胞分解を行う。Lysisは、主に裏返しの小胞を産生し、細胞外の緩衝液をトラップする傾向がある。細胞破片は遠心分離によって除去され、第2の超遠近分離ステップを使用して膜ペレットを採取する。膜ペレットはトリスマレイン酸緩衝液pH5.2に再懸濁し、-80°Cで保存する。輸送アッセイは12°Cで行われ、膜の安定性を維持するのに最適であることがわかりました。アッセイは、放射性標識基板の添加およびpH8.0への小胞の緩衝懸濁液のpHのシフトによって開始される。1分後、標識されていない基板を有する氷冷アッセイバッファーが添加され、小胞への無線標識の取り込みが停止する。放射性標識小胞はニトロセルロース膜を通して濾過によって捕らえられる。膜は、膜上のシンチレーションバイアルおよび放射性標識に移され、液体シンチレーション計数によって決定される。

ウェスタンブロットを使用して、AtBAT1 が小胞に転移していることを確認します (図 2)。抗ヒスC末端抗体でブロットを探査すると、約72.3kDaの融合構築タンパク質が明らかになった(図2、レーン2)。SDS-PAGEの前の小胞の消化は、減衰をもたらしたが、プローブ信号の完全な損失ではなかった(図2、レーン3)。カルボキシペプチダーゼAの結果としてのプローブ信号の減少は、C末端残基のほとんどが小胞の外側にあることを示唆している。

このアッセイシステムでは、小胞内のpHが緩衝液と平衡するように、小胞がpH5.2の緩衝液に懸濁される。pH 5.2の小胞への放射性標識基板の輸送は、pH 8.0緩衝液中の小胞を中断することによって開始され、したがって膜全体にpH2.8のpH勾配を作成する。12°Cでは、小胞による放射性標識スペルミジンの取り込みは1分で最も高く、3分以上直鎖状にとどまった(図3A)。そこで、輸送アッセイのインキュベーション時間は1分に固定した。放射性標識の非特異的結合を考慮するために、小胞を放射性標識基板の存在下で0°Cで1分間インキュベートし、これらのカウントを高温でのラジオールの取り込みから差し引いた。

図3Bは、1分後に放射線標識スペルミジンを小胞に取り込む方法を示す。小胞膜全体にプロトン勾配がなかったため、pH 8.0で調製および貯蔵された膜小胞による同位体の正味取り込みはなかった。人工陽子勾配の散逸の効果を実証するために、膜小胞を標識基板25を添加する前に10分間pH8.0緩衝液中でインキュベートした。これらの条件下で、放射性標識基板の最小取り込みが示された。放射性標識スペルミジンの取り込みはまた、ポリアミン交換器CadBおよびPotEに欠損する大腸菌細胞を用いて調製した小胞においても最小限であった。これらの結果をまとめると、プロトン駆動のスペルミジンの取り込みがBAT1タンパク質によるものであることを示す(図3A,B)。

タンパク質の基質特異性を決定するために、Km値は、10、25、50、100、250および500μM濃度で放射性標識基質の取り込みを測定することによって算出した。スペルミジンに対するKm、プトレシンおよびアルギニンは、それぞれ55±12μM、85±20μMおよび1.4±0.5mMであり、このタンパク質が高親和性ポリアミンおよびアルギニン交換器であることを示す(図4)。

特定の基板に対するトランスポーターの親和性は、競合アッセイを用いて間接的に決定することもできる。ここでは、2つの基板間の競合を評価する2つの方法を利用した。第1の方法では、50μMの放射性標識スペルミジンの取り込みは、非標識競合基板の濃度の増加の存在下で測定された(図5A)。第2の方法では、スペルミジンに対する明らかなKmを、100μMの非標識競合基板の存在下で放射性標識スペルミジンの濃度の増加の取り込み量を測定することによって算出した(図5B)。競争アッセイは、GABAがKm、164 ±15 μMのアプリを有するスペルミジンの競合阻害剤であることを明らかにした(図5A,B)。さらに、異なるアミノ酸の様々な濃度の存在下で50μM放射性標識スペルミジンの取り込みを測定した結果、AtBAT1はmM濃度でグルタミン酸とアラニンを輸送することも可能であることが明らかになった(図6)。

Figure 1
図 1: メソッドの概略表現(A)大腸菌からの膜小胞の調製および精製における主要なステップの概略的な概略表現(B)放射性標識基質を用いた膜小胞製剤の輸送アッセイにおける主要なステップを概説する模式表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:精製小胞におけるAtBAt1の発現を示すウェスタンブロット。バンドは、抗ヒス(C-term)-HRP抗体を共役したわさびペルオキシダーゼを用いて可視化した。レーン1、プレステインタンパク質はしご。レーン2は、AtBAT1.1を発現する精製小胞が、融合タンパク質の予想サイズのバンドを示す。レーン3は、AtBAT1.1を発現する精製小胞を、SDS電気泳動およびウェスタンブロッティングの前にカルボキシペプチダーゼAで前処理した。各レーンに同等量の小胞(タンパク質)を添加した。染色の減少は、ほとんどの小胞におけるタンパク質のC末端がプロテアーゼ消化によって分解されることを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:BAT1タンパク質発現の効果およびpH勾配の重要性を示す小胞の輸送活性。(A)BAT1を発現する小胞中の3H標識スペルミジンの時間依存的な取り込みは、5.2の内部pHを有し、pH 8.0で緩衝液に導入した。対照アッセイでは、小胞をpH8.0でアッセイバッファーに添加し、プロトン勾配の散逸を可能にするために3H標識スペルミジンを添加する10分前に添加した。次いで小胞への放射性標識の取り込みを1分間隔で評価した。(B)プロトン勾配の存在下で3H標識スペルミジン(内部pHは5.2)、プロトン勾配の存在下(内部pH8)、放射性標識スペルミジンを添加する前にアッセイ溶液に添加された小胞で、およびBAT1を発現しないE.大腸変異細胞から作られた小胞に3H標識スペルミジンを取り込む。小胞への取り込みは1分間監視した。すべての値は、5つの反復の平均±SEとして提示されます。データ分析は学生のt検定を使用して行い、* はコントロールとの有意差を示します(p値 < 0.05)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:BAT1のポリアミンおよびアルギニン輸送活性のインビトロアッセイ(A)スペルミジンおよびプトレシン取り込みのためのKm値は、それぞれ55±12μMおよび85±32μMである。(B)アルギニン取り込み用のKmは1.4 ±0.5 mMです。すべての値は、5つの反復の平均±SEとして提示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:GABAはBAT1によるスペルミジン輸送の競合阻害剤である。(A)AtBAT1.1を発現する小胞による3H標識スペルミジンの取り込みは、100μMまたは500μM GABAの存在下で有意に減少した。(B)BAT1.1によるスペルミジン取り込みのための見かけKmは、100μM GABAの存在下で164±20μMに増加した。すべての値は、5つの反復の平均±SEとして提示されます。データ分析は学生のt検定を使用して行い、* はコントロールとの有意差を示します(p値 < 0.05)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:グルタミン酸およびアラニンは、BAT1によるスペルミジン輸送の競合阻害剤である。スペルミジンの取り込みは、1 mM の非標識グルタミン酸および 1.5 mM 非標識アラニンの存在下で有意に減少した。すべての値は、5つの反復の平均±SEとして提示されます。データ分析は学生のt検定を使用して行い、* はコントロールとの有意差を示します(p値 < 0.05)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本研究では、まず大腸菌でタンパク質を発現し、次に膜小胞を生成し、異種発現タンパク質を無細胞系でアッセイできるようにすることにより、抗ポーターの特性評価方法を概説する。ほとんどの分子生物学ラボで見られる機器に加えて、この戦略は、フランスのプレス、超遠心分離機、および放射性同位元素アッセイを行うための施設へのアクセスを使用する必要があります。

この技術の基本的な要件は、異種タンパク質が大腸菌の形質膜を正しく標的にすることである。この戦略はまた、プラスチドADPグルコーストランスポーターが大腸菌細胞膜に正常に局在し、機能的に特徴付けられた35であるため、オルガラートランスポーターの機能解析に有用であり得る。これらの実験で用いたベクター(pBAD-DEST49)には、翻訳された生成物の溶解度を高めるためにN末端チオレドキシンタンパク質が含まれています。小さなB.サチラスタンパク質ミスティックのN末端融合は、細胞質膜36への膜トランスポーターのより効率的なターゲティングを可能にすることが分かった。しかしながら、ミスフォールディング事象、および細胞質膜に適切に統合されるタンパク質の障害は、多くのタイプのトランスポーター1に対する細菌発現系の使用を妨げる潜在的な問題である。

膜小胞はまた、植物トランスポーター37、38を特徴付けるために使用されている。小胞はATPや酵素などの必須エネルギー源を欠いているため、活性トランスポーターやその他の代謝活性からの干渉は最小限です。従って、このシステムは代謝物交換器のような受動的転座の分析にとって理想的である。エバーテッド膜小胞は、特に、内部溶液の組成が緩衝液1の組成を変更することによって操作することができるので、輸出業者およびアンチポーターの特性評価に適用することができる。さらに、フランスのプレスまたは超音波超音波処理を使用すると、無傷の大腸菌細胞から内側の膜小胞を生成する際にかなり効率的です。超音波超音波処理またはフランスのプレスによって生成された小胞の95%は、膜39、40を今までに食べています。PotEは、プトレシンおよびオルニチンの大腸菌抗ポーターを、内側の膜小胞23を用いて特徴づけられた最初のポリアミン抗ポーターであった。P1トランスダクションを用いてポリアミン抗ポーターの特性評価に特異的な変異株を作り出し、この菌株は他の動物、真菌または植物ポリアミン交換器の特性評価に有用であり得る。我々はまた、2つ以上の遺伝子欠失を有する他の大腸菌株が膜小胞を用いた他の植物および動物交換トランスポーターの特性評価に有用である可能性があると考える。

このプロトコルの最も重要なステップは、大腸菌変異体系におけるタンパク質の発現である。誘導性プロモーターを有する大腸菌発現ベクターは、異種遺伝子発現の緊密で用量依存的な調節を促進するために利用される。ベクター中のヒスパッチチオレドキシン、V5エピトープまたは6xHisなどのN末端およびC末端タグの存在は、タンパク質の検出および精製に有用である。加えて、pBAD49ベクターの成分であるチオレドキシン融合タンパク質の存在は、翻訳効率を高めることができ、そして場合によっては、大腸菌41で発現される真核生物タンパク質の溶解度を高めることができる。アラビドプシスと大腸菌における異なるコドンの選択は、大腸菌におけるタンパク質発現に挑戦する可能性がある。コドン最適化は大腸菌42におけるヘテロ接タンパク質発現を印象的に増加させることができることが知られている。小胞アッセイにおいて、コドン最適化AtBAT1.2は、大腸菌細胞において非コドン最適化AtBAT1.1よりも高い交換活性を示し(データは示さず)、コドン最適化が細菌細胞における異種発現タンパク質の発現および機能を増強するのに役立つことを実証した。分解された細胞のゆっくりとした滴下を維持するためにバルブの慎重な調整による膜小胞の産生も、手順の重要なステップである。超遠心分離後、Dounceホモジナイザー中の膜小胞の再懸濁液は、調製され、その後-80°Cで保存される膜小胞のアリコート間のサンプル変動にサンプルへのサンプル変動を最小限に抑えることを発見しました。

大腸菌発現系の制限は、N-グリコシル化やアセチル化などの翻訳後修飾ができないことです。これらのタンパク質修飾の欠如は、タンパク質活性1に影響を与える可能性がある。しかしながら、これらの改変を行うことができる変異体は同定されており、そのような改変を必要とするタンパク質を発現するツールとして用いることができる43。発現したタンパク質の十分な量の生成は、包含体としての展開および凝集、細胞質膜に適切に統合されるタンパク質の障害、翻訳後修飾の欠如による誤標的および誤った規制による課題となり得る。

この技術の小さな制限は、トランスポーターの自然な向きの証拠を提供しないことである。これは、NまたはC末端タグおよび免疫学的方法を利用することによって達成することができる。小胞中のタンパク質の特定の末端のアクセシビリティは、アクセス可能なすべての消化によって達成され得る、従って、おそらくキャリアの外的終端、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのタンパク質の電気泳動、ニトロセルロースフィルターへの転写および残りの抗体を有する内部末端の検出は40である。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

このプロジェクトへの支援は、BGSU大学院、およびスポンサープログラムと研究のBGSUオフィスから来ました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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<em>大腸菌</em>における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生
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Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

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