Vi beskriver en metode for karakterisering av Proton-drevet membran transportører i membran vesicle preparater produsert av heterologous uttrykk i E. coli og lyse av celler ved hjelp av en fransk trykk.
Flere metoder har blitt utviklet for å funksjonelt karakterisere romanen membran transportører. Polyaminer er allestedsnærværende i alle organismer, men polyamin vekslere i planter har ikke blitt identifisert. Her skisserer vi en metode for å karakterisere polyamin antiporters ved hjelp av membran blemmer generert fra lyse av Escherichia coli celler heterologously uttrykker en plante antiporter. Først, vi heterologously uttrykt AtBAT1 i en E. coli stamme mangelfull i polyamin og arginin utveksling transportører. Blemmer ble produsert ved hjelp av en fransk trykk, renset ved ultracentrifugation og benyttes i en membran filtrering analysen av merket underlag for å demonstrere underlaget spesifisitet av transportøren. Disse analysene viste at AtBAT1 er et proton-mediert transportør av arginine, γ-aminobutyric acid (GABA), putresin og spermidin. Den muterte belastningen som ble utviklet for analysen av AtBAT1 kan være nyttig for funksjonell analyse av andre familier av planter og dyr polyamin vekslere. Vi hypothesize også at denne tilnærmingen kan brukes til å karakterisere mange andre typer antiporters, så lenge disse proteinene kan uttrykkes i bakterie cellemembranen. E. coli er et godt system for karakterisering av romanen transportører, siden det er flere metoder som kan anvendes for å mutagenize innfødte transportører.
Proteiner som er involvert i smugling av metabolitter utgjør et viktig nivå av fysiologisk regulering, men det store flertallet av plante membran transportører har ennå ikke vært funksjonelt karakterisert. Flere strategier har blitt iverksatt for å karakterisere romanen transport proteiner. Heterologous uttrykk i modell organismer som E. coli og eukaryote celler som gjær, Xenopus oocytter, pattedyrceller, insekt celler og planteceller har alle blitt brukt til å bestemme deres transport aktivitet1. Eukaryote celler er foretrukket for uttrykk for eukaryote proteiner, fordi den grunnleggende cellulære sammensetning, signal transducing trasé, transkripsjon og oversettelse machineries er kompatible med de innfødte forhold.
Gjær har vært en viktig modell organisme for karakterisering av romanen transport proteiner i planter. Den første planten transport protein som var vellykket uttrykt i gjær (Saccharomyces pombe) var HEXOSE transporter HUP1 fra chlorella2. Siden da har mange plante transport proteiner vært funksjonelt karakterisert ved hjelp av en gjær uttrykks system. Disse inkluderer, plante sukker transportører (SUC1 og SUC23, VfSUT1 og VfSTP14) og auxin TRANSPORTØRER (AUX1 og PIN5). Ulemper ved å utnytte gjær å uttrykke planteproteiner kan inkludere nedsatt aktivitet av plastid-lokaliserte proteiner fordi gjær mangler denne organelle, mistargeting6, og dannelse av misfolded aggregater og aktivering av stressresponser i gjær på grunn av overuttrykte av membran proteiner7,8,9.
Heterologous uttrykk for transport proteiner i Xenopus oocytter har vært mye brukt for elektrofysiologisk karakterisering av transportører10. Den første planten transport proteiner karakterisert ved hjelp heterologous uttrykk i Xenopus oocytter var Arabidopsis KALIUM kanalen KAT110 og Arabidopsis hexose transporter STP111. Siden da har Xenopus oocytter vært ansatt for å karakterisere mange plante transport proteiner som plasma membran transportører12, vacuolar sukrose transporter SUT413 og vacuolar Malate transporter ALMT914. En viktig begrensning av Xenopus oocytter for transport analyser er at konsentrasjonen av intracellulære metabolitter ikke kan manipuleres1. Videre er faglig kunnskap som kreves for å forberede Xenopus oocytter og variasjonen av oocyte partier er vanskelig å kontrollere.
Heterologous uttrykk i modellen organisme E. coli er et ideelt system i form av karakterisering av romanen plante transport proteiner. Med en fullt sekvensert Genova15, de molekylære og fysiologiske egenskapene til E. coli er godt kjent. Molekylær verktøy og teknikker er godt etablert16. I tillegg er ulike uttrykk vektorer, ikke-patogene stammer og mutanter tilgjengelig17,18,19. Videre har E. coli en høy vekst og kan lett dyrkes under laboratorieforhold. Mange proteiner kan lett uttrykkes og renses ved høye beløp i E. coli9. Når proteiner ikke kan analyseres direkte i cellulære systemer, har rekonstituering av proteiner til liposomer også vært en suksess, om enn utfordrende innovasjon for karakterisering av renset membran proteiner. Funksjonell karakterisering av anlegget mitokondrie transport proteiner inkludert stoff transportører som fosfat transportører i soyabønner, mais, ris og Arabidopsis, dicarboxylate-tricarboxylate carrier in Arabidopsis har blitt gjort ved hjelp av denne modellen systemet20,21. Men rekombinant proteiner av tomat protein SICAT9 ble funnet å være fungerende i rekonstituering eksperimenter, og andre medlemmer av CAT transporter familien ble funnet å være fungerende i Xenopus oocyte analyser22. Dermed er flere molekylære verktøy er nødvendig for karakterisering av membran transportører.
Fem polyamin transportsystemer finnes i E. coli23. De omfatter to ABC transportører formidling opptaket av spermidin og putresin, en putresin/Ornithine veksler, en kadaverin/lysin veksler, en spermidin eksportør og en putresin importør. Den putresin veksler PotE ble opprinnelig karakterisert ved hjelp av en vesicle analysen, der innsiden ut blemmer ble utarbeidet av lysering celler med en fransk Trykk og måle opptaket av radiolabeled putresin inn i blemmer i bytte for Ornithine24. Vesicle analyser ble også brukt til å karakterisere en kalsium transportør, som mediert transport av kalsium som svar på et proton gradient25. Disse eksperimentene bedt oss om å utvikle en strategi for karakterisering av andre polyamin vekslere. Vi først opprettet en stamme av E. coli mangelfull i PotE og CadB vekslere. Her viser vi funksjonell karakterisering av en plante polyamin antiporter ved heterlogous uttrykk i den modifiserte E. coli stamme, generering av membran blemmer ved hjelp av en fransk trykk, og radiolabeled analyser.
I denne studien skisserer vi en metode for karakterisering av en antiporter ved først å uttrykke proteinet i E. coli og deretter generere membran blemmer, slik at heterologously-uttrykt protein kan analyseres i en celle-fri system. I tillegg til utstyr som finnes i de fleste molekylære biologi laboratorier, krever denne strategien bruk av en fransk presse, en ultracentrifuge, og tilgang til et anlegg for å gjennomføre radioisotop analyser.
En grunnleggende forutsetning for denne …
The authors have nothing to disclose.
Støtte for dette prosjektet kom fra BGSU Graduate College, og BGSU Office of sponsede programmer og forskning.
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
EDTA | Sigma-Aldrich | ||
Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
Glycerol | |||
GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
Hydrogen peroxide | KROGER | ||
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
Nanodrop | ThermoFisher | ||
Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
putrescine | fluka | 32810 | |
Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |