Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Discrimintion og kartlegging av primær og behandlet transkripsjoner i mais mitokondrie bruke en sirkulær RT-PCR-basert strategi

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/60019
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Summary

Vi presenterer en sirkulær RT-PCR-basert strategi ved å kombinere sirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase og Northern blot. Denne protokollen inkluderer en normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ' trifosfat, og det er egnet for diskriminerende og kartlegging den primære og bearbeidede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie.

Abstract

I anlegget mitokondrier, noen steady-state transkripsjoner har 5 ' trifosfat avledet fra transkripsjon innvielse (Primær transkripsjoner), mens de andre inneholder 5 ' monofosfat generert post-transcriptionally (bearbeidet transkripsjoner). Å diskriminere mellom de to typene av transkripsjoner, har flere strategier er utviklet, og de fleste av dem er avhengige av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat. Imidlertid er trifosfat på primær 5 ' Termini ustabil, og det hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner. For systematisk å differensiere og kartlegge de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie, har vi utviklet en sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-basert strategi ved å kombinere cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR), og Northern blot. Som en forbedring, inkluderer denne strategien en RNA normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ' trifosfat.

I denne protokollen er den beriket mitokondrie RNA pre-behandlet av RNA 5 ' polyphosphatase, som omdanner 5 ' triphsophate til monofosfat. Etter circularization og omvendt transkripsjon, de to cDNAs avledet fra 5 ' polyphosphatase-behandlet og ikke-behandlet RNAs er normalisert av mais 26S eldre rRNA, som har en bearbeidet 5 ' end og er ufølsom for 5 ' polyphosphatase. Etter normalisering blir de primære og behandlede transkripsjoner diskriminert ved å sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter som er Hentet fra de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkripsjon Termini bestemmes av kloning og sekvensering av cRT-PCR produkter, og deretter verifisert av Northern blot.

Ved å bruke denne strategien, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt bestemt. På grunn av den kompliserte transkripsjon mønster av noen mitokondrie gener, noen steady-state transkripsjoner ikke var differensiert og/eller kartlagt, selv om de ble oppdaget i en Northern blot. Vi er ikke sikker på om denne strategien er egnet til å diskriminere og kart steady-state transkripsjoner i andre plante mitokondrier eller i plastids.

Introduction

I Plant mitokondrier, er mange modne og forløper RNAs akkumulert som flere isoformene, og steady-state transkripsjoner kan deles inn i to grupper basert på forskjellen på deres 5 ' ender1,2,3, firetil. Den primære transkripsjoner har 5 ' trifosfat ender, som er avledet fra transkripsjon innvielse. Til sammenligning har de behandlede transkripsjoner 5 ' monofosfat generert av post-transcriptional prosessering. Diskriminering og kartlegging av de to typer transkripsjoner er viktig å avdekke den molekylære mekanismer underliggende transkripsjon og transkripsjon slutten modning.

For å skille mellom de primære og behandlede transkripsjoner i anlegget mitokondrie, fire store strategier er utviklet. Den første strategien er å pre-behandle mitokondrie RNAs med Tobacco acid pyrophosphatase (TAP), som konverterer 5 ' trifosfat å monofosfat og gjør primær transkripsjoner å bli circularized av RNA ligase. Transkripsjon forekomster av trykk-behandlet og ikke-behandlet RNA prøver blir deretter sammenlignet med rask forsterkning av cDNA ender (Race) eller sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andre strategien, behandles transkripsjoner først utarmet fra mitokondrie RNAs bruker Terminator 5 '-fosfat-avhengige exonuclease (Tex), og den primære transkripsjoner venstre blir deretter kartlagt ved primer forlengelse analyse5,6 . Den tredje strategien er å pre-cap den primære transkripsjoner bruker guanylyl glutamyltransferase, og deretter plasseringen av triphosphated 5 ' Termini bestemmes av primer forlengelse sammen med ribonuklease eller S1 nuklease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskjellig fra de avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat, den fjerde strategien kombinerer in vitro transkripsjon, site-regissert mutagenese, og primer forlengelsen analyse for å karakterisere antatte arrangører og bestemme transkripsjon Innvielse nettsteder8,10,11. Ved å bruke disse strategiene, mange primære og bearbeidet transkripsjoner har blitt bestemt i anlegget mitokondrier.

Imidlertid har flere studier rapportert at 5 ' trifosfat av primære transkripsjoner var ustabile, og de ble lett konverteres til monofosfat for ukjent grunn2,4,12,13. Dette problemet hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner ved hjelp av teknikker avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat, og tidligere forsøk på å systematisk diskriminere mellom de primære og bearbeidede transkripsjoner i anlegget mitokondrier mislyktes2,12.

I denne protokollen kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase behandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk å skille de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais (Zea Mays) mitokondrie (figur 1). cRT-PCR tillater samtidig kartlegging av 5 ' og 3 ' ekstremiteter av et RNA molekyl, og det er vanligvis tilpasset kart transkripsjon Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ' polyphosphatase kan fjerne to fosfater fra triphosphated 5 ' Termini, som gjør at de primære utskriftene er tilgjengelige for selv ligation av RNA-ligase. Tidligere studier viste at modne 26s rRNA i mais hadde behandlet 5 ' Terminus, og det var ufølsom for RNA 5 ' polyphosphatase1,16. For å minimere påvirkningen av ustabile trifosfat på primær 5 ' Termini, de 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs er normalisert av eldre 26s rRNA, og den primære og bearbeidede transkripsjoner er så differensiert ved å sammenligne cRT-PCR-produkter Hentet fra de to RNA-prøvene. Den cRT-PCR kartlegging og diskriminering resultater er verifisert av Northern blot og RT-qPCR, henholdsvis. Til slutt, alternative primere brukes til å forsterke de transkripsjoner påvist i Northern blot, men ikke av cRT-PCR. Ved å bruke denne cRT-PCR-basert strategi, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt differensiert og kartlagt1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. primer design

  1. Design gen-spesifikke primere for omvendt transkripsjon (RT) ved hjelp av PCR primer design software (tabell av materialer) basert på de generelle reglene for primer design17.
    Merk: RT primere er svært spesifikke for målet transkripsjoner, og de er generelt forankret på 5 ' del av koding sekvenser (eldre mRNAs og forløper RNAs), eller ~ 500-600 NT nedstrøms av den forventede 5 ' end (18S og 26S rRNAs).
  2. Design par av avvikende primere å forsterke circularized transkripsjoner av cRT-PCR.
    Merk: de sammenkoblede avvikende primere flanke 5 '-3 ' krysset av circularized transkripsjoner, og deres posisjoner varierer blant målet transkripsjoner analysert (figur S1). Noen transkripsjoner har lange UTRs; for eksempel, nad2-1 5 ' UTR og rps4-1 3 ' UTR er 1 985 og 1826/1834 NT, henholdsvis1. Hvis begge primere er forankret på koding regionen, vil det være vanskelig å forsterke målet transkripsjoner. I motsetning, noen UTRs er korte; for eksempel, de 3 ' UTRs av nad2-1 og nad4-1 er 34/35 og 29-31 NT, henholdsvis1. Hvis de sammenkoblede primere ligger langt unna koding sekvenser, vil PCR mislykkes. Vanligvis er to par avvikende primere designet for hvert mål transkripsjoner, mens flere par kan være nødvendig å kartlegge de som transkripsjon mønstre er kompliserte og/eller UTRs er svært lang.
  3. Design par konvergent primere for å forberede RNA-sonder for Northern blot.
    Merk: De sammenkoblede primere er plassert på koding regionen av målet genet, og størrelsen på PCR produktet bør være i størrelsesklasse 100 til 1 000 BP. Hver fremover primer bør inneholde en restriksjon enzym området for å minimere vektor sekvenser i de resulterende sonder.

2. utarbeidelse av Crude mitokondrie fra mais utvikle kjerner

  1. Sterilisere støtere, bombekastere, glass trakter, rør og tips ved autoklav, og tørk dem i ovnen.
  2. Utfør alle prosedyrer ved 4 ° c eller på is, og pre-Cool alle løsninger.
  3. Forbered 100 mL av utvinnings buffer (EB), sammensatt av 0,3 M sukrose, 5 mM tetrasodium geranylpyrofosfat, 10 mM KH2PO4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] storfe serum albumin, 5 mm L-cystein, og 20 mm askorbinsyre. Juster til pH 7,3 med KOH og sterilisere ved filtrering.
  4. Forbered 100 mL vaskebuffer (WB) bestående av 0,3 M sukrose, 1 mM EGTA og 10 mM MOPPER (3-(N-morpholino) propanesulfonic syre). Juster til pH 7,2 med NaOH og sterilisere ved filtrering.
    Merk: Det foreslås å forberede EB og WB bruker DEPC-behandlet deionisert H2O.
  5. Samle 20 g utvikle kjerner på 11-20 dager etter pollinering (DAP) til en 50-mL tube plassert på is, og deretter overføre kjerner til pre-avkjølt bombekastere.
    Merk: Bruk et forhold på 100 mL av EB til 20 g av mais kjerner.
  6. Tilsett 10 – 20 mL iskald EB i hver mørtel, og slip kjernene helt.
  7. Legg til flere EB, og filtrere bakken vev gjennom to lag med filter klut (tabell av materialer).
  8. Sentrifuger Filtrer ved 8 000 x g i 10 min, og kast pellet.
  9. Overfør supernatanten til et nytt rør, og sentrifuger det på 20 000 x g i 10 min.
  10. Hell av supernatanten, og resuspend pellet i 6 mL WB.
  11. Alikvot suspensjonen til fem 1,5 mL RNase-frie rør, og sentrifuger dem ved 14 000 x g i 5 min.
  12. Kast supernatanten, Frys mitokondrie pellet i flytende nitrogen, og oppbevar ved-80 ° c.

3. ekstraksjon av mitokondrie RNA

  1. Pakk ut mitokondrie RNA med en kommersiell reagens (materialfortegnelsen) i henhold til produsentens anvisninger.
    Forsiktig: Denne reagens inneholder fenol og guaniniumtiocyanat isothiocyanate. Arbeid med den i en avtrekksvifte, og bruk Laboratoriefrakk og hansker.
  2. Løs opp den isolerte mitokondrie RNA i DEPC-behandlet deionisert H2O, og Beregn RNA-konsentrasjon og renhet med en spektrofotometer (tabell av materialer).
    Merk: Vanligvis er ~ 250 μg mitokondrie RNA Hentet fra 20 g 15-DAP mais kjerner.
  3. Forbered en agarose gel sammensatt av 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre, 1 mm EDTA), 1,5% agarose (tabell over materialer), og 1x kjernefysisk farging fargestoff (tabell av materialer).
  4. Legg til et passende volum av 10x lasting buffer (0,5% bromophenol blå, 0,5% xylen cyanol FF, og 50% glyserol), og Last mitokondrie RNA/lasting buffer blandingen på 1,5% agarose gel.
  5. Kjør gelen i 1x TAE-buffer ved 5 – 6 V/cm i 20 – 25 min, og Evaluer mitokondrie RNA-integritet ved å avbilde gelen med et system med gel-dokumentasjon (tabell med materialer).
    Merk: Tilstedeværelsen av to forskjellige band (~ 3 510 og ~ 1 970 NT for mais mitokondrie 26S og 18S rRNAs, henholdsvis) er en akseptabel standard for intakt mitokondrie RNA. For å utelukke mulig degradering bør RNA-integritet undersøkes i løpet av flere trinn av circularized RNA-forberedelse (figur 2).

4. RNA 5 ' Polyphosphatase behandling

  1. Sett opp RNA 5 ' polyphosphatase (tabell og materialer) behandling (tabell 1), og ruge ved 37 ° c i 30 – 60 min.
  2. Gjenopprett den 5 ' polyphosphatase RNA-en med et RNA rensesett (tabell med materialer) i henhold til produsentens anvisninger.
  3. Gjenta trinn 3,3 til 3,5.

5. RNA-Circularization

  1. Forbered to circularization reaksjoner med samme mengde 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlede mitokondrie RNAs (tabell 2), og ruge begge reaksjonene ved 16 ° c i 12 – 16 timer.
  2. Gjenopprette de to settene med selv-ligaturer RNAs bruker samme kit som i trinn 4,2.
    Merk: Det bør bemerkes at bare en brøkdel av mitokondrie RNA vil være selv ligaturer, og den gjenopprettede RNA vil være en blanding av lineære og circularized transkripsjoner.
  3. Gjenta trinn 3,3 til 3,5.

6. omvendt transkripsjon

  1. Syntetisere to sett med cDNAs fra samme mengder av circularized 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs (200 ng).
  2. Forbered en primer blanding ved å legge til en lik ratio på 26S-CRT og opp til 7 andre RT primere.
    Merk: Den endelige konsentrasjonen av primer blandingen bør være 1 μM.
  3. Forbered to pre-blandinger ved å kombinere reagensene oppført i tabell 3, ruge ved 65 ° c i 5 min, og deretter chill på isen i 2 min.
  4. Monter to RT reaksjons systemer (Tabell 4), og ruge dem ved 42 ° c i 50 min.
  5. Heat både RT reaksjoner ved 70 ° c i 5 min, og deretter chill dem på isen.

7. normalisering

  1. Forbered to PCR reaksjoner ved å legge samme volum av malen cDNAs avledet fra 5 ' polyphosphatase eller ikke-behandlet RNAs, avvikende primere flankerer 5 '-3 ' krysset av circularized 26S rRNA (dvs. 26S-CF1 og-CR1), etc. (tabell 5).
  2. Kjør de to reaksjonene i en termisk cycler (materialfortegnelsen) under forhold beskrevet i tabell 6.
  3. Forbered en agarose gel sammensatt av 1x TAE buffer, 1,0% agarose, og 1x kjernefysisk farging fargestoff.
  4. Tilsett 2 μL 10x belastnings buffer (0,5% bromophenol blå, 0,5% xylen cyanol FF, og 50% glyserol) til hver av de to PCR-produkter, og laste dem på gel.
  5. Kjør gelen i 1x TAE buffer på 5-6 V/cm for 30-40 min, og bildet det ved hjelp av samme gel dokumentasjons system som trinn 3,5.
  6. Sammenlign overflod av de to PCR-produkter ved hjelp av dataprogramvare (tabell av materialer, figur 4a), og optimalisere normalisering ved å endre mengden av malen cDNAs om nødvendig.

8. PCR forsterkning

  1. Forbered par av PCR-reaksjoner ved å legge til passende volum av normalisert cDNAs og et par avvikende primere flankerer 5 '-3 ' krysset av målet transkripsjoner (Tabell 7).
    Merk: Mengden av malen cDNAs brukes til PCR forsterkning av målet transkripsjoner bestemmes av 26S rRNA normalisering resultater.
  2. Utfør PCR-reaksjonene i henhold til programmet som er beskrevet i tabell 8.
  3. Gjenta trinn 7,3 til 7,5.
  4. Bytt til nestede avvikende primere, og kontroller de første runde PCR-resultatene ved å gjenta trinn 8,1 og 8,2.
  5. Gjenta trinn 7,3 til 7,5.
  6. Gjenopprette de fremtredende band som kan gjentas i to runder av PCR forsterkning ved hjelp av en gel DNA Recovery Kit (tabell av materialer).

9. fastsettelse av transkripsjon Termini

  1. Klon de gel-renset PCR-produktene inn i en stump-end vektor (tabell av materialer) ved hjelp av standard teknikker.
  2. Utfør kolonien PCR for å velge positive kloner som inneholder målet inserts, og sekvens dem kommersielt.
    Merk: Positive kloner som inneholder innsatser med variabel størrelse er vanligvis oppdages fra en enkelt utvinnes band fordi mange steady-state transkripsjoner i anlegget mitokondrie har heterogen 5 ' og/eller 3 ' ender1,12.
  3. Align sekvensering data med mais mitokondrie Genova bruke grunnleggende lokale justering søkeverktøy (BLAST) av nasjonalt senter for bioteknologi informasjon (NCBI). Velg organisme "mais (taxid: 4577)", og søk database "nukleotid Collection (nr/NT)".
  4. Finn 5 '-3 ' krysset av circularized transkripsjon, og bestemme posisjonene til 5 ' og 3 ' transkripsjon Termini.
  5. Beregn størrelsen på mål transkripsjoner.

10. verifisering av cRT-PCR kartlegging resultater av RNA gel blot hybridisering

Merk: RNA gel blot hybridisering utføres ved hjelp av et kommersielt sett (tabell av materialer), som inneholder reagensene for transkripsjon-merking av RNA med DIGOXIGENIN (dig) og T7 RNA polymerase, hybridisering, og immunologiske deteksjon. Vennligst referer til protokollene i dette settet for mer informasjon. Pass på at bare RNase gratis utstyr brukes for hele prosedyren.

  1. Forsterke DNA fragment brukes til å forberede RNA sonde, og klone den til samme vektor som i trinn 9,1, som inneholder en T7 promoter 17 BP oppstrøms av innsetting området.
  2. Linearize konstruksjonen ved hjelp av riktig begrensning enzym, gjenopprette linearized plasmider av en DNA rensing Kit (tabell av materialer), og oppløse den i DEPC-behandlet deionisert H2O.
  3. Label RNA sonder med DIG-11-UTP av en kommersiell Kit (tabell av materialer) i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Forbered 500 mL på 10x MOPPER buffer (0,2 M MOPPER, 50 mM natrium acetate, og 10 mM EDTA) ved hjelp av DEPC-behandlet deionisert H2O. Juster til pH 7,0 ved NaOH, og sterilisere ved filtrering.
  5. Tilsett 2 – 3 volumer med belastnings buffer (50% formamid, 6,2% formaldehyd, 1x MOPPER, 10% glyserol og 0,1% bromophenol blå) til mitokondrie RNA forberedt i trinn 3.1 – 3.3.
  6. Denaturere den RNA sample/lasting buffer blandingen ved 65 ° c i 10 min, og deretter chill på isen i 1 min.
  7. Forbered en denaturert agarose gel (2% formaldehyd, 1,2% agarose, og 1x MOPPER), og laste RNA sample/lasting buffer blandingen til gel (1-2 μg mitokondrie RNA per brønn).
  8. Kjør gelen i 1x MOPPER på 3-4 V/cm for ~ 4 t.
  9. Forbered 2 L av 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M natrium citrate, pH 7,0). Behandle den med 0,1% DEPC over natten, og sterilisere ved autoklav.
  10. Skyll gelen to ganger i 20x SSC (15 min hver gang), og overføre gel RNA til en nylon membran (tabell av materialer) ved kapillær overføring med 20x SSC for 10 – 16 h.
  11. Fest RNA til membran ved å bake ved 120 ° c i 30 minutter.
  12. Utfør RNA-hybridisering og immunologiske deteksjon med et kommersielt sett (tabell av materialer) i henhold til produsentens instruksjoner.

11. diskriminering av primær og behandlet 5 ' ender

  1. Diskriminere den primære og bearbeidet 5 ' ender ved å sammenligne cRT-PCR produkter Hentet fra normalisert 5 ' polyphosphatase-behandlet og ikke-behandlet RNAs.
    Merk: For primære transkripsjoner, er overflod av PCR-produkter fra 5 ' polyphosphatase-behandlet RNA mye høyere enn fra ikke-behandlet motpart (figur 1, ' Gene A, og figur 4a). Til behandlede transkripsjoner vil imidlertid et tilsvarende nivå av PCR-produkter forsterkes fra de to settene med mitokondrie RNAs (figur 1, "Gene B").
  2. Design RT-qPCR primere basert på cRT-PCR kartlegging resultater.
  3. Kontroller cRT-PCR diskriminering resultater av RT-qPCR.
    Merk: De to cDNA prøvene avledet fra 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs er normalisert av RT-qPCR produkter av 26S eldre rRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Estimering av mitokondrie RNA-circularization effektivitet

I en tidligere studie, både total og mitokondrie RNAs ble brukt for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkripsjon Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), og de to typene RNAs ga lignende kartlegging resultater12. I utgangspunktet brukte vi også total RNAs for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkripsjon Termini i mais. Etter mange prøvelser, fant vi målet transkripsjoner var vanskelig å oppdage. Som en forbedring, beriket vi mitokondrie RNA fra mais utvikle kjerner, og det gjorde forsterkning av circularized mål transkripsjoner i en runde av PCR mulig.

For å forklare den enkle forsterkningen av mål transkripsjoner etter berikelse, beregnet vi RNA circularization effektivitet ved å utføre RT-PCRene på representative mitokondrie Gene nad5 (Figur 3 og figur S2). Den mais nad5 genet inneholder to trans-og to CIS-skjøting introns. Etter selv-ligation av total og mitokondrie RNAs, første strand cDNAs var uavhengig syntetisert ved hjelp av nad5-RT1 og-RT2 primere. De to primere kunne reversere transkribere både lineær og circularized nad5 MRNAs (figur S2). Fire par konvergent primere brukes for PCR forsterkning: sqF1 & sqR1 og sqF2 & sqR2 for semi-kvantitative RT-PCR (RT-sqPCR) og qF1 & qR1 og qF2 & qR2 for RT-qPCR. For cDNAs transkribere av nad5-RT1, alle fire parene av grunning oppdaget både circularized og lineær nad5 eldre mRNAs; for nad5-RT2 omvendt transkripsjon reaksjon, SqF2 & SqR2 og QF2 & qR2 kartlagt begge former for mRNA, mens SqF1 & SqR1 og QF1 & qR1 PCR-produkter ble avledet fra circularized nad5 bare. Basert på denne analysen, brukte vi sqF2 & sqR2 (for RT-sqPCR) og qF2 & qR2 (for RT-qPCR) PCR-produkter for å normalisere nad5-RT1 og-RT2 omvendt transkripsjon reaksjoner, og anslått forholdet mellom circularized nad5 ved å sammenligne sqF1 & sqR1 (for RT-sqPCR) eller qF1 & qR1 (for RT-qPCR) PCR-produkter. Før selv ligation ble RNAs pre-behandlet av RNA 5 ' polyphosphatase for å gjøre alle transkripsjoner tilgjengelige for circularization av RNA ligase. RT-sqPCR-analysen viste en svært liten brøkdel av nad5 mRNA var circularized da total RNA ble brukt, men forholdet ble dramatisk økt da den BERIKET mitokondrie RNA ble brukt (figur 3b). RT-qPCR resultater viste at forholdet mellom selv-ligaturer nad5 mRNA økte fra 3,7% til 32% etter berikelse (figur 3c). Analyse av nad1 ga lignende resultater, og circularization effektiviteten av nad1 mRNA økte fra 0,7% til 30% (figur 3D-F).

Per disse analysene, ca 30% mais mitokondrie RNAs var selv-ligaturer etter forbedring, og den økte circularization effektivitet forklarer enkel påvisning av målet transkripsjoner av cRT-PCR.

Bestemmelse av mais COX2 mRNA Termini ved hjelp av cRT-PCR-basert strategi

Vi brukte COX2 genet som et eksempel for å innføre kartlegging og diskriminering av mais mitokondrie transkripsjoner ved hjelp av CRT-PCR-basert strategi (Figur 4).

I begynnelsen av kartlegging COX2 mRNA, tre ytre-mot primere CF1, CF2 og CR1 ble utformet på gen koding region (figur 4d). CF1 og CF2 var nestede primere, og CF2 var 69 BP nedstrøms for CF1. Ved hjelp av malen cDNAs syntetisert i trinn 6.1 – 6.5 og normalisert på trinn 7.1 – 7.6, CF1 & CR1 primer paret forsterket to prominente band, og forsterkningen resultatene ble gjentatt av nestede primere CF2 & CR1 (figur 4a). Videre ble de to bandene sterkt forsterket fra den 5 ' polyphsophatase RNA ' en, mens de var vanskelige å oppdage i den ikke-behandlede motparten, noe som tyder på at de er følsomme for RNA 5 ' polyphsophatase og har primær 5 ' Termini.

De to kandidat band ble kalt COX2-1 og-2, og de ble gjenopprettet uavhengig av agarose gel og klonet i vektorer. Colony PCR resultater viste at de positive kloner inneholder innsatser med variabel størrelse, antyde heterogen 5 ' og/eller 3 ' Termini av transkripsjoner (figur 5). Den positive kloner ble sekvensielt kommersielt, og sekvensering data ble justert med mais mitokondrie Genova som beskrevet i trinn 9,3.

Den sekvensering og justering resultater viste at de to transkripsjoner var identiske på 3 ' ender, men forskjellige i lengden av 5 ' UTRs (figur 4d). De 5 ' endene av COX2-1 og-2 ble beriket ved 992-1030 og 1276-1283 NT oppstrøms av aug, henholdsvis, mens deres 3-enden var 39 NT nedstrøms av stopp Codon. Utledet fra cRT-PCR resultater, var de beregnede størrelsene av COX2-1 og-2 1804-1832 og 2088-2095 NT, henholdsvis.

For å verifisere resultatene av cRT-PCR-tilordningen, ble RNA gel blot-hybridisering utført ved hjelp av sonden avledet fra COX2 Gene Coding-regionen, og to store band med tilsvarende størrelse som COX2-1 og-2 ble oppdaget (figur 4c). I tillegg ble det påvist to større band om 2 500 og 2 800 NT i Northern blot, men de ble ikke forsterket av cRT-PCR. De to større bandene ble navngitt som COX2-3 og-4, henholdsvis. For å kartlegge dem, ytterligere to ytre-mot primere (dvs. CR2 og CF3), forankret på 5 ' og 3 ' UTRs av COX2-2, ble utformet, og deres posisjoner var nær den forventede transkripsjon endene av COX2-3 og-4. Bruke primer pair CF3 & CR2, to store bandene ble sterkt forsterket fra cDNAs avledet fra 5 ' polyphsophatase-behandlet RNA men ikke fra den ikke-behandlet motpart (figur 4a). Den sekvensering resultatene viste at de hadde identiske 5 ' Termini mens variabel 3 ' ender. Den beregnede størrelsen på de to transkripsjoner var 2512/2513 og 2833-2835 NT, henholdsvis, og de var nær i størrelse med de to større bandene oppdaget i Northern blot. Videre foreslo cRT-PCR-resultatene at cox2-3 og-4 har primær 5 ' Termini.

For å bekrefte forskjells resultatene, ble fem ytre-vendt primere utformet i henhold til cRT-PCR kartlegging resultater, i.e. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2, og qCR3, og primer parene qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 og qCF2 & qCR3 ble brukt for RT-qPCR analyse av henholdsvis COX2-1,-2,-3 og-4. Den relative overflod av alle fire RT-qPCR produkter i 5 ' polyphsophatase-behandlet prøven var mye høyere at de i ikke-behandlet motpart, som bekrefter cRT-PCR diskriminering resultater.

Oppsummert er transkripsjon mønster av mais COX2 genet komplisert, og CRT-PCR-basert strategi effektivt diskriminerer og kart flere isoformene av COX2 mRNA.

Figure 1
Figur 1: oversikt over den cRT-PCR-baserte strategien. Illustrasjon av de viktigste trinnene i cRT-PCR-basert strategi. 5 ' + og 5 '-= de to RNA-prøvene behandlet og ikke-behandlet av RNA 5 ' polyphosphatase. De to cDNA prøvene avledet fra 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs er normalisert av 26S eldre rRNA i mais, og den primære og bearbeidede transkripsjoner er diskriminert ved å sammenligne cRT-PCR produkter. For gen A har den tilsvarende RNA en primær 5-ende fordi PCR-produktet er overflod fra 5 ' polyphosphatase RNA er mye høyere enn fra den ikke-behandlede motparten; for gen B er PCR-produktene fra de to settene med mitokondrie RNAs forsterket på et tilsvarende nivå, noe som tyder på en behandlet 5 ' ende Terminal av den korresponderende RNA. Kodings området og UTRs representeres av henholdsvis grå boks og fete linjer. CRT = primer for omvendt transkripsjon; CF1, CF2, CR1 og CR2 = PCR-primere flankerer 5 '-3 ' krysset av circularized transkripsjon; qCF og qCR = avvikende primere for RT-qPCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: evaluering av MITOKONDRIE RNA-integritet ved å agarose gel-elektroforese. (A) mitokondrie RNAs forberedt fra 15-DAP mais kjerner. M = DNA molekyl markør. (B) kernel mitokondrie RNA etter behandlingen med 5 ' polyphosphatase og/eller Circularization av T4 RNA ligase. 5 ' + = mitokondrie RNA etter behandlingen med 5 ' polyphosphatase; T4 & 5 ' + = mitokondrie RNA etter behandlingen med 5 ' polyphosphatase og circularization av T4 RNA ligase; T4 & 5 '-= mitokondrie RNA etter circularization. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Circularization effektiviteten til nad5 og nad1 mRNAs estimert av RT-PCRene. (A) og (D) skjematisk diagram av nad5 og nad1 gener, henholdsvis. Ex = ekson. Exoner og introns vises henholdsvis som grå bokser og buede linjer. Plasseringen av omvendt transkripsjon primere RT1 og RT2 er indikert med piler. Svarte prikker indikerer plasseringen av PCR-primere, og den anslåtte størrelsen på PCR-produktene vises. sqF1, sqF2, sqR1 og sqR2 er primere for RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 og qR2 er primere for RT-qPCR. (B) og (E) RT-sqPCR analyse av circularization effektivitet av henholdsvis nad5 og nad1 mRNAs. M = DNA molekyl markør. (C) og (F) RT-qPCR analyse av circularization effektivitet av henholdsvis nad5 og nad1 mRNAs. De to cDNA prøvene omvendt transkribere av RT1 og RT2 primere er normalisert av sqF2 & sqR2 (for RT-sqPCR) eller qF2 & qR2 (for RT-qPCR) PCR-produkter. Circularization effektiviteten av nad5 og nad1 mRNAs er anslått ved å sammenligne PCR produkter av sqF1 & sqR1 (for RT-sqPCR) eller qF1 & qR1 (for RT-qPCR). circularized/(circularized + Linear) = qF1 & qR1 over qF2 & qR2 i RT2 reaksjon/qF1 & qR1 over qF2 & qR2 i RT1 reaksjon. Verdier er midler og SDs av tre biologiske replikerer. Å utelukke det muligheter innvirkningen av 5 ′ trifosfat, det RNAs var behandlet av 5 ′ polyphosphatase tidligere å selv-ligation. Totalt og mito = total og mitokondrie RNAs, henholdsvis. RT1 og RT2 = cDNAs Reverse transkribere av RT1 og RT2 primere, henholdsvis Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kartlegging av COX2 modne mRNA Termini ved hjelp av CRT-PCR-borehullstjenester-strategien. (A) gel separasjon av COX2 cRT-PCR produkter. + og-= cDNAs avledet fra 5 ' polyphosphatase-behandlet og ikke-behandlet mitokondrie RNAs, henholdsvis. De to cDNA prøvene ble normalisert ved forsterkning av 26S cDNA (26s). Fem primere brukes for cRT-PCR analyse av circularized COX2 MRNA: CF1, CF2, og CF3 er nestede primere, og CF2 og CF3 er 69 og 138 BP nedstrøms av CF1, henholdsvis; CR1 og CR2 er nestede primere, og CR2 er 1 288 BP oppstrøms av CR1. Bandene indikert av ' 1 ' og ' 2 ' ble forsterket av både CF1 & CR1 og CF2 & CR1, mens ' 3 ' og ' 4 ' band ble forsterket av CF3 & CR2. Alle fire bandene ble sekvensielt ved kloning. Båndene som er merket med stjerner, kunne ikke gjentas, og de ble utelatt fra resultatene. M = DNA molekyl markør. (B) RT-qPCR analyse av den relative overflod av circularized COX2 mRNA etter 5 ' polyphosphatase behandling. De to cDNA prøvene ble syntetisert av en primer blanding som inneholder 26S-CRT, COX2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT, og COX1-CRT på lik ratio, og cDNA avledet fra 26S eldre rRNA ble brukt for normalisering. +/-= COX2 over 26s i behandlet prøve/COX2 over 26s i ikke-behandlet prøve. Verdier representerer midler og SD av tre biologiske replikerer. Den primere som brukes for RT-qPCR er indikert. (C) Northern blot analyse av COX2 transkripsjoner. 2 μg mitokondrie RNA ble lastet inn. Bandene som tilsvarer ulike isoformene av COX2 eldre mRNA er merket. (D) transkripsjon Termini av COX2 mRNA UTLEDET fra cRT-PCR resultater. UTRs og åpne lese RAM mer vises som fete linjer og grå bokser. Plasseringen av 5 ' og 3 ' Termini i forhold til AUG (+ 1) og UAA (-1), og antall enkelt kloner sekvensert på disse stillingene er vist. Plasseringen av omvendt transkripsjon og PCR forsterkning primere vises som lukket og åpen pil hoder, henholdsvis. Ytre-vendte primere som brukes for RT-qPCR vises som åpne firkanter, og plasseringen av COX2 sonde er som indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: valg av positive kloner som inneholder COX2-4 innsettinger av kolonien PCR. (A) Colony PCR to Screen enkelt kloner inneholder COX2-4 inserts. Størrelsen på COX2-4 INSERT er ca 1 165 BP, og at av vektoren sekvensene er 100 BP. Den beregnede størrelsen av kolonien PCR-produkter er ca 1 265 BP, og de kloner som inneholder liten størrelse inserts var ikke sekvensielt, dvs, nummer 11, 14, 22, og 23. (B) sekvensering resultatene av de positive kloner vist i (A). 5 '/3 ' ender = 5 ' og 3 ' ender i forhold til AUG (+ 1) og UAA (-1), henholdsvis. Den sekvensering resultatene av tall 12 og 20 ble ekskludert fordi de var mye mindre enn de andre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Komponent Volum til 50 μL reaksjon (μL) Endelig konsentrasjon
10x RNA 5 ' polyphosphatase buffer 5 1x
RNase-hemmer (40 U/μL) 0,75 0,6 U/μL
Mitokondrie RNA X 0,2 μg/μL
RNA 5 ' polyphosphatase (20 U/μL) 2,5 1 U/μL
DEPC-behandlet deionisert H2O til 50 μL -

Tabell 1: reaksjons komponenter i RNA 5 ' polyphosphatase behandling.

Komponent Volum for 20 μL reaksjon (μL) Endelig konsentrasjon
10x T4 RNA ligase jeg buffer 2 1x
dATP (1 mM) 1 50 μM
PEG8000 (50%) 6 15
RNA-hemmer (40 U/μL) 0,5 1 U/μL
5 ' polyphosphatase eller ikke-behandlet mitokondrie RNA X 0.1 ~ 0.2 μg/μL
T4 RNA ligase I (30 U/μL) 0,4 0,6 U/μL
DEPC-behandlet deionisert H2O til 20 μL -

Tabell 2: reaksjons komponenter i mitokondrie RNA-circularization.

Komponent Volum for 10 μL pre-blanding (μL)
Primer blanding (1 μM totalt)a 2
dNTP-blanding (10 mM hver) 1
Circularized 5 ' polyphosphatase-behandlet eller ikke-behandlet mitokondrie RNAb X
DEPC-behandlet deionisert H2O til 10 μL

Tabell 3: pre-blanding for omvendt transkripsjon reaksjon. en egen Primer blandingen inneholder lik ratio på 26S-CRT og opp til 7 andre RT primere, og den endelige konsentrasjonen er 1 μM. bto pre-blandinger er forberedt side ved side, og de inneholder samme beløp (200 ng) av circularized 5 ' polyphosphatase-behandlet eller ikke-behandlet mitokondrie RNA.

Komponent Volum for 20 μL reaksjons system (μL) Endelig konsentrasjon
Mal RNA/primer/dNTP * 10 -
5x RTase buffer 4 1x
RNase-hemmer (40 U/μL) 0,5 1 U/μL
RTase (200 U/μL) 1 10 U/μL
DEPC-behandlet deionisert H2O til 20 μL -

Tabell 4: reaksjons komponenter i omvendt transkripsjon. * Malen RNA/primer/dNTP pre-blandinger fremstilt på trinn 6,3.

Komponent Volum for 20 μL reaksjons system (μL) Endelig konsentrasjon
Deionisert H2O 7 -
2x reaksjonsbuffer 10 1x
dNTP-blanding (10 mM hver) 0,4 0,2 mM hver
26S-CF1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
26S-CR1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
Maler cDNA avledet fra circularized 5 ' polyphosphatase-behandlet eller ikke-behandlet RNAs * 0,6 -
DNA polymerase (1 U/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabell 5: reaksjons komponenter for PCR-forsterkning av 26s cDNA. * I utgangspunktet er lik volum av malen cDNAs (0,6 μL) brukes for normalisering. Om nødvendig kan du endre mengden av mal cDNAs for å sikre samme overflod av 26S PCR-produkter mellom de to PCR-reaksjonene.

Trinn Temperatur Tid Syklus nummer
Innledende denaturering 95 ° c 3 min 1 syklus
Denaturering 95 ° c 15 sek 22 – 25 sykluser
Primer annealing 56 ° c 15 sek
Forlengelsen 72 ° c 30 sek
Siste utvidelse 72 ° c 5 min 1 syklus
Holde 4 ° c ∞ -

Tabell 6: PCR-forhold for å forsterke 26s cDNA for normalisering.

Komponent Volum til 20-μL reaksjons system (μL) Endelig konsentrasjon
Deionisert H2O til 20 μL -
2x reaksjonsbuffer 10 1x
dNTP-blanding (10 mM hver) 0,4 0,2 mM hver
Avvikende primer fremover (10 μM) 0,8 0,4 mM
Avvikende primer-revers (10 μM) 0,8 0,4 mM
Mal cDNA avledet fra den circularized 5 ' polyphosphatase-behandlede eller ikke-behandlede RNAs * X -
DNA polymerase (1 U/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabell 7: reaksjons komponenter for PCR-forsterkning av circularized mål transkripsjoner. * Volumet av malen cDNAs brukes i disse reaksjonene er bestemt av 26s rRNA normalisering resultater.

Trinn Temperatur Tid Syklus nummer
Innledende denaturering 95 ° c 3 min 1 syklus
Denaturering 95 ° c 15 sek 22-40 sykluser c
Primer annealing a 50-65 ° c 15 sek
Extenstion b 72 ° c 0,5 – 1 min
Finatl forlengelse 72 ° c 5 min 1 syklus
Holde 4 ° c ∞ -

Tabell 8: PCR-forhold for å forsterke mål utskriftene. en egen Eksakt annealing temperert avhenger av Smeltetemperaturen til PCR-primere. b Forlengelse tid avhenger av lengden på målet som skal forsterkes. Anbefalt tid er 1 min per 1 KB av PCR-fragmentet. c Generelt er 30 ~ 35 sykluser nok til å produsere en tilstrekkelig mengde PCR-produkt. For lav rikelig transkripsjoner, øke antall sykluser opp til 40 sykluser.

Figur S1: plassering av grunning for representative mais mitokondrie transkripsjoner. CRT = omvendt transkripsjon primer; CF1, CF2, CR1 og CR2 = avvikende primere for PCR forsterkning; qCF og qCR = avvikende primere for RT-qPCR. Transkripsjon Termini av mais nad2-1, rps4-1, og nad4-1 er bestemt tidligere (Zhang et al., 20191). Plassering av 5 '-og 3 '-ender i forhold til AUG (+ 1) og den siste nukleotid av stopp Codon (-1) vises. Koding regionene og UTRs er angitt som grå bokser og dristige linjer, henholdsvis. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S2: prinsipp for å anslå circularization effektivitet på nad5 mRNA i mais. I en selv-ligation reaksjon, er bare en brøkdel av mitokondrie RNAs circularized. For å beregne forholdet mellom circularized nad5 mRNA, to Gene-spesifikke primere brukes til å syntetisere den første tråden cDNAs, dvs., nad5-RT1 og-RT2. I nad5-RT2 omvendt TRANSKRIPSJON (RT)-REAKSJONEN, PCR-produkter forsterket av SqF2 & sqR2 (for RT-sqPCR) og QF2 & qR2 (for RT-qPCR) er avledet fra både lineær og circularized nad5, mens den sqF1 & sqR1 (for RT-sqPCR) og qF1 & qR1 (for RT-qPCR) PCR-produkter er avledet fra circularized nad5 bare; i nad5-RT1 reaksjon, kan alle fire par PCR-primere forsterke begge formene for nad5. For å beregne forholdet mellom circularized nad5 mRNA, de to reaksjonene er normalisert av SqF2 & SqR2 eller QF2 & qR2 PCR-produkter. Ved å sammenligne overflod av sqF1 & sqR1 eller qF1 & qR1 PCR produkter mellom de to RT reaksjonene, er circularization effektiviteten av nad5 mRNA grovt anslått. ex = ekson. Exoner og introns vises henholdsvis som grå bokser og buede linjer. Posisjonene til nad5-RT1 og-RT2-primere er indikert med piler. Svarte prikker indikerer posisjonene til PCR-primere, og den anslåtte størrelsen på PCR-produktene vises. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell S1: primer informasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I en tidligere studie, total og mitokondrie RNAs fra celle suspensjon kultur Arabidopsis ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini av CRT-PCR, og lignende resultater ble innhentet12. Men bare beriket mitokondrie RNA ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini i mange andre studier1,2,3,9. Vi fant ut at berikelse av mitokondrie RNA er et viktig skritt for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkripsjon Termini i mais. Etter denne berikelse er forholdet mellom circularized mitokondrie RNA økt dramatisk fra 0,3% – 3,7% til ~ 30% (Figur 3 og figur S2), noe som gjør forsterkningen av circularized mål transkripsjoner mulig i en runde av PCR.

Den circularization effektiviteten av mitokondrie RNA ble anslått av RT-PCR-analyse på mais nad1 og nad5, som begge er delt inn i uavhengige forløpere ved CIS-skjøting introns. Fordi den potensielle innflytelsen fra tilstedeværelsen av forløperen RNAs samt variasjon av RT effektivitet ikke kunne utelukkes, er dette bare en grov estimering av den virkelige mitokondrie RNA circularization effektivitet.

Vi endret de selv ligation forholdene ved å endre konsentrasjonen av mitokondrie RNA og PEG8000, så vel som ved å elongating inkubasjonstid, men disse forandringene syntes ikke å påvirke mitokondrie RNA-circularization effektivitet. Selv om vi ikke er sikre på om ytterligere Percoll gradient rensing kan øke circularization effektivitet, kvaliteten på råolje mitokondrie utarbeidet i § 2 er god nok for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkripsjon Termini i mais. Siden flere runder med PCRene kan føre til falske positive resultater, gjør forsterkningen av mål transkripsjoner i en rund PCR at tilordnings resultatene blir mer pålitelige.

Den 5 ' trifosfat av primære transkripsjoner er ustabil, og det kan konverteres til 5 ' monofosfat av ukjente grunner. Dette problemet hindrer en klar differensiering mellom primær og behandlet transkripsjoner ved hjelp av tilnærminger avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat1,2,4. Den modne formen av mais 26S rRNA har en monophosphated 5 ' end, og det er ufølsom for RNA 5 ' polyphosphatase. For å minimere påvirkning av ustabile 5 ' triphospahte, eldre 26S rRNA brukes til å normalisere de to RNA prøvene, behandlet og ubehandlet av 5 ' polyphosphatase, og det er vist seg å være et viktig skritt for å skille de to typer transkripsjoner i mais mitokondrie. Etter normalisering kan de primære og behandlede transkripsjoner bli diskriminert ved å sammenligne cRT-PCR og RT-qPCR resultater Hentet fra 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlede RNA-prøver. Den primære transkripsjoner er følsomme for 5 ' polyphosphatase, og de er sterkt forsterket fra 5 ' polyphosphatase-behandlet prøven, men ikke (eller på et svært lavt nivå på grunn av den ustabile 5 ' trifosfat) fra ikke-behandlet motstykke. Til sammenligning oppdages de behandlede transkripsjoner på sammenlignbare nivåer mellom de to prøvene.

I planter, transkripsjon mønstre av mange mitokondrie gener er ganske komplisert1,2. For eksempel er mais nad6 og atp6 gener uttrykt som både monocistrons og dicistrons, og nad6, Atp6, og atp6-na6 eldre mRNAs har henholdsvis to, tre og to isoformene. Videre transkripsjon befolkning på en mitokondrie genet er faktisk en blanding av forløper, modne, og fornedrelse RNAs. PCRene er tilbøyelig til å forsterke liten størrelse molekyler, og det er vanskelig å oppdage alle transkripsjon isoformene ved hjelp av ett par primere. Derfor er RNA gel blot-hybridisering nødvendig for å verifisere resultatene av cRT-PCR-tilordningen, og alternative primere kan være nødvendige for å forsterke de transkripsjoner som oppdages i Northern blot, men ikke av cRT-PCR første gang.

Denne protokollen inkluderer en RT-qPCR trinn for å verifisere cRT-PCR diskriminering resultater. Fordi flere isoformene av noen eldre mRNAs er svært nær i størrelse1, er det umulig å bekrefte alle de diskriminering resultater av RT-qPCR, og noen steady-state transkripsjoner ble bestemt ved å sammenligne CRT-PCR resultater mellom behandlet og ikke-behandlet RNAs bare.

I denne protokollen, de 5 ' og 3 ' Termini av målet transkripsjoner ble kartlagt ved kloning og sekvensering av cRT-PCR-produkter, og det begrenser antall enkelt kloner å være sekvensert. Som en alternativ metode, cRT-PCR-produkter kan være sekvensert av neste generasjons sekvensering, som sekvenser tusenvis av molekyler for ett sett av steady-state transkripsjoner, og kartlegging resultatene ville være mer nøyaktig.

Foruten diskriminering av primær og behandlet 5 ' Termini av cRT-PCR og RT-qPCR, monofosfat 5 ' Termini kan bestemmes ved identifisering av omkringliggende RNA sekundære strukturer1,12. Det er velkjent at RNA sekundære strukturer som tRNA og t-element kunne megle mitokondrie transkripsjon slutten formasjon ved regi endonucleolytic splittelsene av RNase P og/eller RNase Z12,18,19, og 20. Derfor bør de 5 ' Termini tilstøtende til tRNA eller t-element være avledet fra post-transcriptional prosessering og inneholde monophosphates.

Ved å bruke denne protokollen, en stor del av steady-state transkripsjoner har blitt bestemt i mais mitokondrier1. Men noen var ikke differensiert og/eller kartlagt for ukjent grunn1. Videre tror vi at plasseringen av 5 ' transkripsjon Termini er bedre å bli bekreftet av primer forlengelsen analyse, selv om det er inkludert i denne protokollen. På grunn av mangelen på eksperimentelle data, er vi ikke sikker på om denne strategien er egnet for andre plantearter, slik som ris (oryza sativa) og Arabidopsis. Foruten plante mitokondrier, er både primære og bearbeidede transkripsjoner stabilt akkumulert i plastids21, og det er usikkert om denne strategien kan brukes til å kartlegge og diskriminere plastid transkripsjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 31600250, Y.Z.), vitenskap og teknologi prosjekter i Guangzhou City (Grant no. 201804020015, H.N.), og China Agricultural Research system (Grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Tags

Genetikk sirkulær RT-PCR Northern blot kvantitativ RT-PCR RNA 5 ' polyphosphatase behandling RNA normalisering primære og bearbeidede transkripsjoner mais mitokondrie
Discrimintion og kartlegging av primær og behandlet transkripsjoner i mais mitokondrie bruke en sirkulær RT-PCR-basert strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng,… More

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter