在这里,我们提出一个协议,用于对海洋软体动物阿普里西亚的进食器具所固有的肌肉进行微创手术病变,以了解这些肌肉在喂食行为中的作用。
阿普利亚卡利卡是研究学习和行为神经控制的模型系统。这种动物有一个半开放的循环系统,使得它有可能访问其许多内部结构,而不会造成任何重大损害。许多操作可以很容易地在体内和体外执行,使其成为一个高度可操作的模型,用于分析行为和神经电路。为了更好地了解喂食器内肌肉的功能,我们开发了一种技术,在不打开动物的主体腔或破坏喂食器官的外层(即牛体)的情况下对其进行病变。在此技术中,抓手部分被避开,允许直接进入肌肉。此过程允许动物快速可靠地恢复。这使得I7肌肉和亚拉面纤维发生病变成为可能,使我们能够证明两种肌肉对体内的开放有显著作用。
Aplysia californica的供料系统具有悠久的使用历史,用作理解学习和记忆 1、动机行为2、3 以及行为、生物力学和喂食4期间的神经控制。它有高度可访问的神经电路,具有相对较少的大,可识别的神经元。动物有一个半开放的循环系统,使得它有可能访问其许多内部结构,而不会造成重大损害。它还对体内和体外的许多操作都非常强大,使其成为一个高度可操作的模型,用于分析行为和神经回路。
为了理解导致喂食行为的神经模式,必须描述构成喂食器官的软结构的基本力学,即牛体质量4。虽然已经做了工作来描述构成牛体质量5,6的外层肌肉,但控制抓握器表面的牛体质量(气道磷)内部结构的内部肌肉已经基本上无法进入体内实验。虽然对其中一些肌肉的功能进行了体外研究,但缺乏直接进入这些肌肉的机会使得研究它们在完整、行为动物中的作用变得困难。
大多数技术在阿普利亚或类似的软体动物物种的电极植入或病变要求打开身体壁9,10,11,12。打开身体壁会导致上皮损伤,切口必须牢固密封,以防止淋巴逸逸。当试图到达阿普利西亚的抓握器的内侧肌肉(表层或气管的肌肉)时,会面临更严重的困难:通过主体腔进入后,必须经过一些部分肌肉壁的布卡质量获得进入内部结构(图1A)。这种累积的伤害和难以接近,使方法通过传统手段有问题,因为动物没有从这些手术中恢复良好(动物与全版本,只有17%恢复任何喂养能力,N = 12。约85%的非动物恢复了进食能力,N = 84)。
I7肌肉,这已被定性为一个拉面开放8,是深在奥多福本身,进一步复杂化访问。它通过气道中的流明(图1C)在表层茎的基部(图1C)和表层表面的底面之间延伸(图1C)。在I7肌肉的三面是肌肉的壁,第四壁由拉状茎组成。就生物力学研究而言,对这些结构的重大损害会损害喂食装置的正常功能。我们开发了一种新方法,通过下颚锻炼牙周,并通过切口对薄的、细的牙纹表层进行手术,这使得I7肌肉以及新描述的细肌肉纤维有可能发生病变。运行在雷达表面的正下方,我们称之为亚雷达纤维(图1C)。
图1:解剖学概述。(A)阿普利亚境内布卡质量的位置.(B) 气泳的外在解剖。萝卜和拉面囊的表面为黄色;构成气孔的肌肉根据它们的实际颜色以红色显示。(C) 气道的囊性部分,显示亚雷达纤维(弯曲的粉红色线)和 I7 肌肉(直粉线)的位置。I6 肌肉的横截面显示为深红色。请点击此处查看此图的较大版本。
协议中最关键的步骤是需要确保动物完全麻醉,并且牛体质量的蒸发量足以进入底层肌肉。它可能需要一些实践来完善这些步骤,但一旦它们被掌握,手术的产量可能超过所有实验的85%。正确修改和排除协议疑难症的最重要方法是花时间对布卡质量进行解剖,以便调查人员能够完全清楚内部肌肉的位置。由于建议的切口通过表层表面不可避免地对底层亚拉德状纤维造成一些损坏,因此最好修改切口的确切位置以避免这些纤维的特定区域。
手术技术的一个限制是,它可能对喂养反应有非特异性的影响,如前垂的强度。克服这种限制的一个方法是让动物作为他们自己的控制。此外,除了切除特定肌肉(即 I7 或 SRFs)外,必须建立一个受整个手术方案的假病变组。通过遵循这些建议,研究者将减少动物之间变异的影响,并具有手术非特异性影响的内在衡量标准。
以前的工作已经使用方法通过身体壁病变或记录从神经13,14,或肌肉15,16,17。在我们的实验室中,我们观察到,体壁切口往往伴随着淋巴的显著损失,从而导致身体体积的显著损失。动物往往需要几天才能恢复过来,如果身体壁病变不仔细缝合,动物可能无法恢复。此外,对动物的验尸发现切口周围有相当大的疤痕,并且有很强的免疫反应(观察结果)。相反,动物在从本文描述的协议中恢复后,不会显示淋巴损失或身体体积的变化(基于对96只动物的观察)。
该技术的未来应用可能会扩展到Aplysia喂养装置内的其他肌肉,以及其他动物。我们专注于去除I7肌肉和亚拉面纤维。这些相同的一般手术技术也允许访问大多数其他肌肉的气托。其中一些,如I5肌肉的内部部分,最好通过表层表面访问。其他,如I4的内部传单,可能更好地通过奥多福的外皮到达。我们已经进行了初步试验,其中部分左撇子的皮裂下切口允许插入一个锐化钩,然后可以用来病变另一个肌肉内,肌肉I88。由于此处描述的手术方案不打开主体腔,因此无需缝合。
我们所描述的协议可能引起其他从事软组织结构的研究者的普遍兴趣,否则这些结构将难以操作,例如其他软体动物的喂食装置。更一般地讲,这个方案可以建议其他新的手术方法来分析软结构,如舌头,躯干或触角18。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢雪莉·尼格尔、卢西和乔伊·吴为改进和验证这些协议所付出了艰辛的努力。这项工作得到了 NSF 授权 IOS 1754869 的支持。
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |