アプリシア・カリフォルニカのオドントフォアに固有の筋肉のための最小限に侵襲的な病変技術

Summary

ここでは、海洋軟体動物アプリシアカリフォルニカの摂食装置に固有の筋肉の最小限に侵襲的な外科的病変のためのプロトコルを提示し、摂食行動中にこれらの筋肉の役割を理解する。

Abstract

アプリシアカリフォルニカは、学習と行動の神経制御を研究するためのモデルシステムです。この動物は半開き循環システムを有し、重大な損傷を引き起こすことなく、その内部構造の多くにアクセスすることを可能にする。多くの操作は、インビボとインビトロの両方で簡単に行うことができ、動作と神経回路の解析のための非常に扱いやすいモデルです。給餌バッパー内の筋肉の機能をよりよく理解するために、動物の本体腔を開いたり、摂食器官の外層(口腔塊)を損傷することなく、それらを病変する技術を開発しました。この技術では、バッパーは部分的に常に常に、筋肉への直接アクセスを可能にする。この手順は、動物が迅速かつ確実に回復することができます。これにより、I7筋および亜放射状繊維の病変が可能となり、両方の筋肉が生体内の開口部に有意に寄与することを示すことにした。

Introduction

Aplysia californicaの給餌システムは、学習と記憶^を理解するためのモデルシステムとしての長い歴史を持ち、動機付け行動2、3、および行動、バイオメカニクスと給餌中の神経制御⁴.それは非常にアクセス可能な神経回路を有し、比較的少数の大きく、識別可能なニューロンを持つ。動物は半開き循環システムを有し、重大な損傷を引き起こすことなく、その内部構造の多くにアクセスすることを可能にする。また、インビボとインビトロの両方で多くの操作に強く、挙動と神経回路の解析のための非常に扱いやすいモデルです。

摂食行動を引き起こす神経パターンを理解するためには、摂食器官を構成する柔らかい構造の根底にある力学、口腔質量4を記述することが重要である。バッカル質量5、6を構成する外側の筋肉を特徴付ける作業が行われているが、バッパーの表面を制御する球体塊内の基礎構造の内側の筋肉は、オドントフォア、となってきた。生体内実験では、ほとんどアクセスできません。これらの筋肉の一部の機能に関するインビトロ研究が行われている^が、これらの筋肉への直接アクセスの欠如は、動物を振る舞う、無傷で自分の役割を研究することが困難になっています。

Aplysiaまたは同様の軟体動物種における電極移植または病変のためのほとんどの技術は、体壁を開く必要があります 9,^10,11,12.体壁を開くと上皮損傷を引き起こし、出血を防ぐために切開部をしっかりと密封する必要があります。さらに深刻な困難は、Aplysiaのバッパーの内側の筋肉(放射状表面の下の筋肉またはオドントフォア内の筋肉)に到達しようとすると、本体の空洞を通って入った後、いくつかのことを通過する必要があります。内部構造へのアクセスを得るために球体塊の筋肉壁の部分(図1A)。この蓄積された傷害とアクセスの困難は、動物がこれらの手術からよく回復しないため、従来の手段を通じてアプローチを問題にしました(完全な逆転を持つ動物の、わずか17%は任意の摂食能力を取り戻しました、N = 12。非エバーテッド動物の約85%が、N=84)を養う能力を取り戻した。

ラッドオープナー8として特徴付けられたI7筋肉は、オドントフォア自体の奥深くにあり、アクセスをさらに複雑にする。これは、ラッド状茎の基部(図1C)と放射状表面の下側の間に伸び、オドントフォアの内膜を通して(図1C)。I7筋肉の3つの側面には筋肉の壁があり、4番目の壁は角状の茎で構成されています。生体力学的研究の目的のために、これらの構造のいずれかに大きな障害は、供給装置の正常な機能を損なうだろう。我々は、顎を通してオドントフォアを働かせて手術を行い、薄くて軟骨な基性表面への切開を通して手術を行い、I7筋の病変を可能にした、ラドラーサーフェスのすぐ下で実行し、ラジキュラー以下の繊維と呼びます(図1C)。

図1:解剖学的概要。(A)アプリシア内の球菌塊の位置。(B) オドントフォアの外部解剖学。ラデュラとラドゥル嚢の表面は黄色です。オドントフォアを構成する筋肉は、実際の色に基づいて赤で表示されます。(C)オドントフォアの矢状部は、基線状繊維(曲面ピンク線)およびI7筋(直線ピンク線)の位置を示す。I6筋の断面は濃い赤色で示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

アプリシアは無脊椎動物であるため、IAUCの承認を受け取りません。動物に対する不快感を最小限に抑えるため、以下に説明する外科的手法を適用する前に、完全に麻酔されていることを確認してください。

1. 動物の選択と麻酔

1. 海藻を提供し、噛み間隔が3~5秒以下であることを確認して、アクティブな動物を選択します。
2. 60 mL注射器に18Gの針で頭部付近に注入して、0.333モル塩化マグネシウム(表1参照)で動物を麻酔し、麻酔薬の最高濃度が軟体質量の周りとなるようにします。
   1. 外側の上皮と内組織層の両方を針で貫通するように注意してください。注射はサイの下、鼻と足の中間にあり、針が顎の方向を指して斜めに入ることを確認してください。
3. 10分後、穏やかにギルとサイにピンを挿入しようとし、これらが後退しないことを確認し、十分な麻酔を確保する。
4. ナメクジの唇と顎がリラックスして、オドントフォアが露出できるようにしてください。
   注:図2Aの唇のしわは、動物の唇および顎が損傷なしに行われる外科的処置のために十分に緩和されていないことを示す。図2Bの滑らかでリラックスした唇は、顎が完全にリラックスしていることを示しています。

図2:麻酔されたアプリシア口の緊張とリラクゼーション(A) 唇の周りに高い筋肉張力を示すアプリシア。 これは顎の緊張と相関し、手術を進めいことを逆に示す。(B)リラックスした唇を持つアプリシアは、顎の内側(薄い灰色)を示す。色は再び動物で観察されるものに対応します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. 動物の唇がリラックスしていない場合は、塩化マグネシウムの追加の30 mLを注入し、さらに5分待ちます。これが唇の弛緩に結びつかない場合は、良好な水の流れを持つ隔離された容器に戻し(ステップ4を参照)、別の動物を進めます。

2. ラドゥラーサーフェスの露出

1. 頭が下方にぶら下がるようにナメクジを配置し、顎に対して塊が落ち着くようにします。
2. 親指と人差し指で圧力をかけて、頭の塊を顎に向かって押し、頭の塊を所定の位置に保持します。
3. 顎が見えるように回転させます。同時に、頭袋塊のプロウが顎を通して見えるように、球塊の圧力を維持する。(図3)。

図3:顎の内側に対する球団質量を支持する。指は、プロウの先端が見えるまで顎の内側の端に押し上げられた球菌塊をサポートします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 鈍い鉗子の先端をオドントフォアの裂け目に穏やかに働き、顎を通して放射状の表面を利用する。顎が十分に緩んでいない場合は、鉗子を使用して、このプロセスを支援するために裂け目の端をそっとつかみます。
   注意:この圧力は動物に大きなダメージを与える危険性がある。
5. サーフェスが露出したら、周囲の周囲をずっとラッド状の表面の前部から顎を取り除きます。これにより、オドントフォアが後退する可能性が低くなります(図4)。オドントフォアの壁の半分以下が露出していないことを確認します。

図4:オドントフォアの部分的な反転。ラッド状の表面は完全に露出しているが、オドントフォアの側面は明らかにされず、これは部分的な反転のみである。さらなる転換は、動物に損傷をもたらす可能性が高いです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

注:オドントフォアの完全な逆転は、動物が回復するのが非常に遅い大きな筋肉の損傷を引き起こす。

3. 外科切開

1. ラッド状の表面が完全に露出したら、手術の解剖スコープの下にスラッグを配置します。
   1. あるいは、広いゴムバンドと第三の手を使用して、特に学習中に、手術のための顎と放射状表面を安定させます。しかし、これは、時間を追加し、手順に組織の損傷を増加させ、長期的にはあまり理想的ではありません。
2. 裂け目側が調査者に向かるように、ラッドサーフェスを配置します。
3. 放射状の表面をゆっくりとつかみ、基底付近で、解剖学的折り目に対して垂直に水平折り目が形成するようにする。この折り目を切り取り、解剖学的折り目に沿って切開を行うには、細かいはさみを使用します(図5)。

図 5: ラドラー サーフェスへの切開位置。(A)角状表面、切開部付き。(B) 両側I7筋の鎖が付着する場所を示す円を持つ放射状の表面;点線は、放射状の表面の下に降りてくる筋肉の位置を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. この初期切開を3〜5cmに延長し、塊の内部へのアクセスを可能にする。
5. この切開部を直接戻るようにライトを調整します。
6. 切開の縁部は、Odontophoreの内膜の背面とI7筋の細い垂直鎖が見えるようにする。(図 6)

図 6: ラドゥラーサーフェス切開を通る I7 の位置。切開部を通して見ると、I7の両方の鎖がI4の内面の間に見える。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

7. 切開部を通して手を伸ばし、I7の両方の鎖をつかみ、切開部を通して引き上げ、筋肉を実用的な限り切り取ることができる(図7)。

図7:切開部を通してI7筋鎖を引っ張る。I7筋肉は非常に弾性であり、除去のための切開を通して引き上げることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

注:練習では、通常、視力よりも感じでI7を見つける方が効果的です。

4. 術後ケア

1. 病変が行われた後、前触手をつかみ、ラッド状の表面を押し下げて、ナメクジを元の構成に戻します。
2. 良好な水の流れで保護された環境に手術後の動物を置きます。酸素化の増加は回復を速くする。動物が手術の翌日に警戒し、応答していることを確認してください。そうでない場合は、回復しないと仮定できます。
   注:動物は通常、手術後1日目または2日目に餌を与え始める。噛むのに苦労している動物でさえ、食べようとする試みによって動物の回復が改善されるという逸話的な観察なので、海藻を提供する必要があります。

5. 基板下線部電性

1. 1.1 から 3.5 までの手順に従います。
2. 鋭いエッジを上向きに傾けた切開部を通して、小さなまっすぐなメスブレード(#11または類似)の先端を挿入します。ラッド状の表面の下側から細かい筋肉繊維をそっとこすり取ります。(図8)。

図8:基照性繊維の病変。メスブレードの端は、ラジカル表面の下側に切開を通して上向きに角度を付け、亜放射状繊維をそっと削り取ることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. 手順 4.1 に戻ります。

Representative Results

以前の研究は、I7筋肉がブッパー8の開口部に貢献したことを示唆していた.我々自身の解剖学的研究は、亜放射状繊維もバッパーの開口部に寄与するかもしれないことを示唆した。これらの仮説をテストするために、動物は外科的処置を受ける前と後の両方に咬傷を生成するように誘導された。シャム動物は、放射状表面の切開を含むすべての外科的処置を受けたが、内部筋肉は除去されなかった。I7病変を受けた動物は、両方のI7筋肉を除去した。基照性線維病変を受けた動物は、切開部のすぐ下に取り出した亜放射状繊維の約25%を有していた。シャム病変は噛み付きのピーク時の開口部の幅に有意な影響を及ぼさなかったのに対し、I7と亜放射状繊維病変の両方が噛み幅を有意に減少させました(図9)。

図9:ピーク噛み付き時の開口幅に関する病変の結果示されたデータは、3群(シャム、I7病変、またはSRF病変)の5匹の動物の外科的処置の前後のラデュラの平均正規化開幅との差であり、各動物は独自の制御として機能する。平均は、前に5咬傷、および平均正規化差を決定するために外科的処置後に5回の咬傷を採取した。開口幅は、ラドゥラの中心からピーク時のラドゥラエッジまでの距離であり、放射基部の内面からラドゥル面の裂縁側エッジまでの距離によって正規化された。差異は、標準偏差のプラスマイナスの平均として表示されます。差分データが正規分布していることを証明した後、病変が効果を持たない確率が決定された(すなわち、帰無仮説は、対に適用することによって、外科的処置の効果が平均してゼロであることがテストされた)。各独立グループに対して t 検定を行います。データは、シャム病変が有意な影響を及ぼさなかったことを示し、I7筋肉の病変または亜放射状繊維の病変は、単一のアスタリスクで示されたI7病変群の場合、基部開放に有意な影響を及ぼした。、または SRF 病変群の p < 0.002 を、二重アスタリスクで示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

体重	塩化マグネシウム用量
<200 g	1/2 体重
200-350グラム	1/3 体重
350-450グラム	1/4 体重

表 1:体重別塩化マグネシウム投与量.

Discussion

プロトコル内の最も重要なステップは、動物が完全に麻酔されていることを確認する必要性であり、頭の中の筋肉の回りは、基礎となる筋肉にアクセスするのに十分です。これらのステップを完成させるには何らかの練習が必要かもしれませんが、いったん習得すると、手術による収量は、行われたすべての実験の85%を超える可能性があります。プロトコルを適切に変更し、トラブルシューティングする最も重要な方法は、内部筋肉の位置が研究者に完全に明確にできるように、口腔質量の解剖に時間を費やすることです。ラジカル表面を通る推奨切開は必然的に基になる亜放射性繊維に何らかの損傷を引き起こすので、これらの繊維の特定の領域を避けるために切開の正確な位置を変更することが適切な場合があります。

外科的手法の1つの制限は、それが、引き起しの強さなどの摂食応答に非特異的な影響を有し得るであろうことである。この制限を克服する一つの方法は、動物が独自のコントロールとして機能することです。さらに、特定の筋肉(すなわち、I7またはSRF)の除去を除いて、外科プロトコル全体に供される偽の病変群を有することが重要である。これらの提案に従うことによって、研究者は動物間の変動の影響を減らし、外科手術の非特異的効果の本質的な尺度を持つ。

以前の研究は、病変または神経13、14、または筋肉15、16、17のいずれかから記録するために体壁を介してアプローチを使用しています。私たちの研究室では、体壁切開はしばしばヘモリンパの著しい損失を伴い、したがって体積を伴うことを逸話的に観察しました。動物は、多くの場合、これから回復するために数日を必要とし、体壁病変が慎重に縫合されていない場合、動物は回復しないことがあります。さらに、動物の死後検査は、切開の周りにかなりの瘢痕と強い免疫応答(逸話的観察)を明らかにする。対照的に、動物は、ここで説明したプロトコルからの回復後のhemoinmphの損失または体積の変化を示さない(96匹の動物の観察に基づく)。

技術の将来の応用は、Aplysiaの摂食装置内の他の筋肉、および他の動物に拡張し得る。我々は、I7筋肉および亜放射状繊維の除去に焦点を当てている。これらの同じ一般的な外科的技術はまた、オドントフォアの他の筋肉のほとんどへのアクセスを可能にする。これらのいくつかは、I5筋の内部部分など、放射状の表面を通してアクセスされるのが最適です。他の人は、I4の内側のリーフレットのように、オドントフォアの外皮を通してより良い到達することができるかもしれません。我々は、部分的に絶え間ないオドントフォアの基性裂断下の切開が、その後、オドントフォア内の別の筋肉を病変するために使用することができる鋭利なフックへのアクセスを可能にした予備試験を行った、 筋肉I8^8。ここで説明する外科的プロトコルは本体空洞を開かないため、縫合は必要ない。

我々が説明したプロトコルは、他の軟体動物の摂食装置など、操作が困難な軟部組織構造に取り組む他の研究者に一般的に関心があるかもしれない。より一般的には、このプロトコルは、舌、幹または触^手18のような柔らかい構造の分析に対する他の新しい外科的アプローチを示唆し得る。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data