阿普利西亚的奥多托福雷内在肌肉的微创病变技术

Summary

在这里，我们提出一个协议，用于对海洋软体动物阿普里西亚的进食器具所固有的肌肉进行微创手术病变，以了解这些肌肉在喂食行为中的作用。

Abstract

阿普利亚卡利卡是研究学习和行为神经控制的模型系统。这种动物有一个半开放的循环系统，使得它有可能访问其许多内部结构，而不会造成任何重大损害。许多操作可以很容易地在体内和体外执行，使其成为一个高度可操作的模型，用于分析行为和神经电路。为了更好地了解喂食器内肌肉的功能，我们开发了一种技术，在不打开动物的主体腔或破坏喂食器官的外层（即牛体）的情况下对其进行病变。在此技术中，抓手部分被避开，允许直接进入肌肉。此过程允许动物快速可靠地恢复。这使得I7肌肉和亚拉面纤维发生病变成为可能，使我们能够证明两种肌肉对体内的开放有显著作用。

Introduction

Aplysia californica的供料系统具有悠久的使用历史，用作理解学习和记忆 1、动机行为2、3 以及行为、生物力学和喂食4期间的神经控制。它有高度可访问的神经电路，具有相对较少的大，可识别的神经元。动物有一个半开放的循环系统，使得它有可能访问其许多内部结构，而不会造成重大损害。它还对体内和体外的许多操作都非常强大，使其成为一个高度可操作的模型，用于分析行为和神经回路。

为了理解导致喂食行为的神经模式，必须描述构成喂食器官的软结构的基本力学，即牛体^质量4。虽然已经做了工作来描述构成牛体质量5，6的外层肌肉，但控制抓握器表面的牛体质量（气道磷）内部结构的内部肌肉已经基本上无法进入体内实验。虽然对其中一^{些肌肉的功能}进行了体外研究，但缺乏直接进入这些肌肉的机会使得研究它们在完整、行为动物中的作用变得困难。

大多数技术在阿普利亚或类似的软体动物物种的电极植入或病变^{要求打开身体}壁9，10，11，12。打开身体壁会导致上皮损伤，切口必须牢固密封，以防止淋巴逸逸。当试图到达阿普利西亚的抓握器的内侧肌肉（表层或气管的肌肉）时，会面临更严重的困难：通过主体腔进入后，必须经过一些部分肌肉壁的布卡质量获得进入内部结构（图1A）。这种累积的伤害和难以接近，使方法通过传统手段有问题，因为动物没有从这些手术中恢复良好（动物与全版本，只有17%恢复任何喂养能力，N = 12。约85%的非动物恢复了进食能力，N = 84）。

I7肌肉，这已被定性为一个拉^{面开放8，}是深在奥多福本身，进一步复杂化访问。它通过气道中的流明（图1C）在表层茎的基部（图1C）和表层表面的底面之间延伸（图1C）。在I7肌肉的三面是肌肉的壁，第四壁由拉状茎组成。就生物力学研究而言，对这些结构的重大损害会损害喂食装置的正常功能。我们开发了一种新方法，通过下颚锻炼牙周，并通过切口对薄的、细的牙纹表层进行手术，这使得I7肌肉以及新描述的细肌肉纤维有可能发生病变。运行在雷达表面的正下方，我们称之为亚雷达纤维（图1C）。

图1：解剖学概述。（A）阿普利亚境内布卡质量的位置.（B） 气泳的外在解剖。萝卜和拉面囊的表面为黄色;构成气孔的肌肉根据它们的实际颜色以红色显示。（C） 气道的囊性部分，显示亚雷达纤维（弯曲的粉红色线）和 I7 肌肉（直粉线）的位置。I6 肌肉的横截面显示为深红色。请点击此处查看此图的较大版本。

Protocol

阿普利亚是无脊椎动物，因此不受IAUC的批准。为了尽量减少对动物的不适，在应用下述手术技术之前，请确保它们完全麻醉。

1. 动物选择和麻醉

1. 选择活性动物，提供海藻，并确认咬合间隔不超过3至5秒。
2. 用0.333摩尔氯化镁（见表1）麻醉动物，在60 mL注射器上用18G针头在头部附近注射，这样麻醉剂的最高浓度将围绕牛粪质量。
   1. 小心用针穿透外上皮和内组织层。确保注射大致在犀牛下，在犀牛和脚的中间，针头应倾斜地进入，指向下颚的方向。
3. 10分钟后，轻轻尝试将针插入刺和犀牛，验证它们是否不缩回，以确保充分麻醉。
4. 确保唇部和下巴的松弛，以便可以暴露牙周。
   注：图2A嘴唇上的皱纹表明动物的嘴唇和下巴不够放松，无法进行手术，而不会受到损伤。图2B光滑、松弛的嘴唇表明下颚完全放松。

图2：麻醉性阿普利西亚口腔的紧张和放松。（A ）嘴唇周围表现出高度的肌肉张力.这与下颌张力和禁忌手术有关。（B） 唇部松弛的阿普利西亚，显示下颚内侧（浅灰色）。颜色再次对应于在动物中观察到的颜色。请点击此处查看此图的较大版本。

5. 如果动物的嘴唇不放松，再注射30 mL氯化镁，再等待5分钟。如果这不能导致嘴唇松弛，将它们返回到一个带良好水流的隔离容器，以使它们得以恢复（参见步骤 4），然后继续处理其他动物。

2. 暴露光面

1. 将钳子放置，使头部向下悬挂，使块状质量稳定在钳口上。
2. 用拇指和食指施加压力，将布卡质量推向下颚，将布卡质量固定到位。
3. 旋转钳口，使其可见。同时，保持对布卡质量的压力，以便通过钳口可以看到牛团质量的prow。（图3）

图 3：对爪子内部支持 Buccal 质量。手指支撑着被推到下颚内侧边缘的牛粪质量，直到可以看到下颚的尖端。请点击此处查看此图的较大版本。

4. 轻轻地将钝钳的尖端工作到牙周四的裂口中，并使用它们通过下颚撬动表层。如果钳口不够松弛，使用钳子轻轻抓住裂口的边缘，以帮助此过程。
   警告：这种压力确实有可能对动物造成更大的损害。
5. 一旦表面暴露，将下颚从圆周周围一直工作在雷达表面的前部分。这使得气泳不太可能缩回 （图 4）。确保不超过一半的气泳壁暴露。

图4：奥多托福的局部反转。雷达表面完全暴露，但气管的两侧没有被揭开，因此这只是部分的外向。进一步的反演可能导致动物受损。请点击此处查看此图的较大版本。

注：气泳的完全变身会导致严重的肌肉损伤，动物恢复速度非常缓慢。

3. 外科切口

1. 一旦表层完全暴露，在手术的解剖范围内安排泥浆。
   1. 或者，使用宽的橡皮筋和第三只手来稳定手术的下颚和表层，特别是在学习时。然而，这增加了时间，并增加了组织损伤的程序，这使得它不太理想的长期。
2. 放置雷达表面，使裂角侧面向调查员。
3. 轻轻抓住靠近表层基的雷达表面，使水平褶皱形成垂直于解剖折痕。使用精细剪刀切割这个褶皱，沿着解剖折痕切口（图5）。

图 5：切口到角面的位置。（A） 带切口的拉面表面。（B） 带圆圈的拉面表面，显示双边 I7 肌肉的股部附着的位置;虚线显示在雷达表面下方下降的肌肉的位置。请点击此处查看此图的较大版本。

4. 将初始切口扩展至 3-5 厘米，以便进入块质量的内部。
5. 调整光线，使其通过此切口直接指向返回。
6. 部分切口的边缘，使气托的流明和I7肌肉的细垂直股是可见的。（图6）

图6：I7通过表层表面切口的位置。透过切口，可以看到I7的两股在I4的内表面之间。请点击此处查看此图的较大版本。

7. 通过切口伸入，抓住I7的两股，并通过切口将其拉上来，在那里肌肉可以尽可能被切掉，就像实用一样（图7）。

图7：通过切口拉I7肌肉绞线。I7 肌有高度弹性，可通过切口向上拉取以进行切除。请点击此处查看此图的较大版本。

注：通过实践，通过感觉定位 I7 通常比通过视觉找到 I7 更有效。

4. 术后护理

1. 进行病变后，抓住前触角，向下推下，使泥浆恢复到其原始配置。
2. 将手术后的动物置于水流良好的受保护环境中。氧合增加可加快恢复速度。确保动物在手术后的第二天保持警觉和反应。如果不是这样，可以假定它们不会恢复。
   注：动物通常会在手术后的第一天或第二天开始进食。即使是咬有困难的动物也应该提供海藻，因为我们的传闻是，动物的恢复可以通过它尝试吃来改善。

5. 用于亚雷达纤维病变

1. 按照 1.1 到 3.5 的步骤操作
2. 将小直手术刀刀的尖端（#11或类似）插入切口，锐边向上倾斜。轻轻地从表层表面的底面刮去细肌肉纤维。（图8）

图8：病变下拉纤维。手术刀刃的边缘通过切口向上倾斜到雷达表面的底面，以便可以轻轻刮去亚雷达纤维。请点击此处查看此图的较大版本。

3. 返回到步骤 4.1。

Representative Results

先前的研究表明，I7肌肉有助于打开抓手8。我们自己的解剖学研究表明，亚拉面纤维也可能有助于抓手开口。为了验证这些假说，动物在接受外科手术前后被诱导产生咬伤。沙姆动物接受了所有的手术步骤，包括皮面的切口，但没有切除任何内部肌肉。受到I7病变的动物的I7肌肉都被移除了。受到亚拉面纤维病变的动物在切口下立即去除了+25%的亚拉面纤维。在咬牙达到高峰时，沙姆病变对开口的宽度没有显著影响，而I7和亚拉德状纤维病变确实显著减小了咬合宽度（图9）。

图 9：峰值咬线期间开口宽度的病变结果。数据显示，3组（沙姆、I7病变或SRF病变）中，5只动物（沙姆、I7病变或SRF病变）的手术前后，每只动物的平均标准化开口宽度之间的差异，每种动物都充当自己的对照。平均服用5口之前，和5咬手术后，以确定平均正常化的差异。开口宽度是从拉古拉的中心到峰值拉边的距离，通过从雷达基的内表面到拉面表面的裂边的距离进行归一化。差异显示为均值加或减标准差。在确定差异数据是正态分布后，确定病变没有影响的概率（即，通过应用成对，检验了零假设，即外科手术的效果平均为零）t-测试到每个独立组。数据表明，假病变没有显著效果，而I7肌肉的病变或亚拉面纤维的病变确实对表状开口有显著影响（p < 0.031 对于I7病变组，用单个星号表示p < 0.002 用于 SRF 病变组，用双星号表示）。请点击此处查看此图的较大版本。

体重	氯化镁剂量
<200 g	1/2 体重
200-350克	1/3 体重
350-450克	1/4 体重

表 1：氯化镁剂量（按体重计）。

Discussion

协议中最关键的步骤是需要确保动物完全麻醉，并且牛体质量的蒸发量足以进入底层肌肉。它可能需要一些实践来完善这些步骤，但一旦它们被掌握，手术的产量可能超过所有实验的85%。正确修改和排除协议疑难症的最重要方法是花时间对布卡质量进行解剖，以便调查人员能够完全清楚内部肌肉的位置。由于建议的切口通过表层表面不可避免地对底层亚拉德状纤维造成一些损坏，因此最好修改切口的确切位置以避免这些纤维的特定区域。

手术技术的一个限制是，它可能对喂养反应有非特异性的影响，如前垂的强度。克服这种限制的一个方法是让动物作为他们自己的控制。此外，除了切除特定肌肉（即 I7 或 SRFs）外，必须建立一个受整个手术方案的假病变组。通过遵循这些建议，研究者将减少动物之间变异的影响，并具有手术非特异性影响的内在衡量标准。

以前的工作已经使用方法通过身体壁病变或记录从神经13，14，或肌肉15，16，17。在我们的实验室中，我们观察到，体壁切口往往伴随着淋巴的显著损失，从而导致身体体积的显著损失。动物往往需要几天才能恢复过来，如果身体壁病变不仔细缝合，动物可能无法恢复。此外，对动物的验尸发现切口周围有相当大的疤痕，并且有很强的免疫反应（观察结果）。相反，动物在从本文描述的协议中恢复后，不会显示淋巴损失或身体体积的变化（基于对96只动物的观察）。

该技术的未来应用可能会扩展到Aplysia喂养装置内的其他肌肉，以及其他动物。我们专注于去除I7肌肉和亚拉面纤维。这些相同的一般手术技术也允许访问大多数其他肌肉的气托。其中一些，如I5肌肉的内部部分，最好通过表层表面访问。其他，如I4的内部传单，可能更好地通过奥多福的外皮到达。我们已经进行了初步试验，其中部分左撇子的皮裂下切口允许插入一个锐化钩，然后可以用来病变另一个肌肉内，肌肉I8^8。由于此处描述的手术方案不打开主体腔，因此无需缝合。

我们所描述的协议可能引起其他从事软组织结构的研究者的普遍兴趣，否则这些结构将难以操作，例如其他软体动物的喂食装置。更一般地讲，这个方案可以建议其他新的手术方法来分析软结构，如舌头，躯干或触角18。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data