Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para o lesioning cirúrgico minimamente invasor dos músculos intrínsecos ao instrumento de alimentação do molusco marinho Aplysia californica para compreender os papéis destes músculos durante o comportamento de alimentação.
Abstract
Aplysia californica é um sistema modelo para estudar o controle neural da aprendizagem e do comportamento. Este animal tem um sistema circulatório semiaberto, tornando possível o acesso a muitas de suas estruturas internas sem causar nenhum dano significativo. Muitas manipulações podem ser facilmente realizadas tanto in vivo e in vitro, tornando-se um modelo altamente tratável para a análise de comportamento e circuitos neurais. Para compreender melhor as funções dos músculos dentro do Grasper de alimentação, nós desenvolvemos uma técnica para lesioning os sem abrir a cavidade de corpo principal do animal ou danificar as camadas exteriores do órgão de alimentação (isto é, a massa oral). Nesta técnica, o Grasper é parcialmente everted, permitindo o acesso direto à musculatura. Este procedimento permite que os animais se recuperem rapidamente e confiantemente. Isso possibilitou a lesão dos músculos i7 e das fibras subradulares, permitindo-nos demonstrar que ambos os músculos contribuem significativamente para a abertura in vivo.
Introduction
O sistema de alimentação de Aplysia californica tem uma longa história de uso como um sistema modelo para a compreensão da aprendizagem e memória1, comportamentos motivados2,3, ea interação entre comportamento, biomecânica e controle neural durante a alimentação4. Tem circuitos neurais altamente acessíveis, com um número relativamente pequeno de grandes neurônios identificáveis. O animal tem um sistema circulatório semiaberto, tornando possível o acesso a muitas de suas estruturas internas sem causar danos significativos. Também é robusto para muitas manipulações tanto in vivo e in vitro, tornando-se um modelo altamente tratável para a análise de comportamento e circuitos neurais.
Para compreender os padrões neurais que dão origem a comportamentos alimentares, é importante descrever a mecânica subjacente da estrutura macia que compõe o órgão de alimentação, a massa bucal4. Embora tenha havido trabalho feito para caracterizar os músculos exteriores que compõem a massa vestibular5,6, osmúsculos internos da estrutura subjacente dentro da massa bucal que controla a superfície do Grasper, o odontophore, foram em grande parte inacessível à experimentação in vivo. Embora tenha havido estudos in vitro sobre as funções de alguns desses músculos7,8, afalta de acesso direto a esses músculos dificultou o estudo de seu papel em animais intactos, comportando-se.
A maioria das técnicas para implante de eletrodos ou lesões em Aplysia ou espécies semelhantes de moluscos requer que a parede do corpo seja aberta9,10,11,12. Abrir a parede do corpo provoca lesão epitelial, e a incisão deve ser selada de forma segura para evitar o escape da hemolinfa. As dificuldades ainda mais sérias são colocadas ao tentar alcangar os músculos internos do Grasper de Aplysia (músculos que estão subjacentes à superfície radular ou dentro do odontophore): tendo entrado através da cavidade do corpo principal, um deve então atravessar algum porção da parede muscular da massa bucal para obter acesso às estruturas interiores (Figura 1a). Essa lesão acumulada e a dificuldade de acesso tornaram a abordagem por meio de meios convencionais problemáticos porque os animais não se recuperam bem dessas cirurgias (de animais com eversões completas, apenas 17% recuperaram qualquer habilidade de alimentação, N = 12. Cerca de 85% dos animais não-everted recuperaram a capacidade de alimentação, N = 84).
O músculo i7, que tem sido caracterizado como um abridor de radulares8, é profundamente dentro do próprio odontóforo, complicando ainda mais o acesso. Estende-se entre a base da haste radular (Figura 1C) e a parte inferior da superfície radular, através de um lúmen no odontóforo (Figura 1C). Em três lados dos músculos i7 são paredes do músculo, e a quarta parede consiste na haste radular. Para efeitos de um estudo biomecânico, o prejuízo importante para qualquer uma destas estruturas comprometeria a função normal do aparelho de alimentação. Nós desenvolvemos uma aproximação nova de trabalhar o odontóforo para fora através das maxilas, e conduzindo a cirurgia através de uma incisão à superfície radular fina, cartilaginosa, que fêz possível à lesão o músculo i7, assim como as fibras de músculo finas recentemente-descritas que executado logo abaixo da superfície radular, a qual nos referimos como as fibras subradulares (Figura 1C).
Figura 1: visão geral anatômica. (A) localização da massa bucal dentro de Aplysia. (B) anatomia externa do odontophore. A superfície do rádula e do saco radular é amarela; os músculos que compõem o odontóforo são mostrados no vermelho, baseado em suas cores reais. (C) seção sagital do odontophore, mostrando a localização de fibras subradulares (linha rosa curvada) e músculo i7 (linha reta rosa). A secção transversal do músculo E6 é mostrada em vermelho escuro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Aplysia são invertebrados e, portanto, não submetidos à aprovação da IAUC. Para minimizar o desconforto aos animais, assegure-se de que eles sejam totalmente anestesiados antes de aplicar as técnicas cirúrgicas descritas abaixo.
1. seleção animal e Anestesiarização
- Selecione um animal ativo, oferecendo-lhe algas marinhas e confirmando que os intervalos de mordida não são maiores do que entre 3 e 5 s.
-
Anestesie o animal com 0,333 cloreto de magnésio molar (ver tabela 1) injetando perto da cabeça com uma agulha de 18 G em uma seringa de 60 mL para que a maior concentração de anestésico será em torno da massa bucal.
- Tome cuidado para penetrar o epitélio externo e a camada interna do tecido com a agulha. Certifique-se de que a injeção está aproximadamente o rhinophore, a meio caminho entre o rhinophore e o pé, e a agulha deve entrar obliquamente, apontando na direção das mandíbulas.
- Após 10 min, tente delicadamente inserir um pino na brânquia e no rhinophore, verificando que estes não retraem, para assegurar a suficiente anestesiarização.
- Assegure-se de que os bordos e a maxila do slug estejam relaxados de modo que o odontóforo possa ser expor.
Nota: O enrugamento nos lábios da Figura 2a indica que os lábios e a mandíbula do animal não estão suficientemente relaxados para que o procedimento cirúrgico seja realizado sem prejuízo. Os lábios suaves e relaxados da Figura 2b indicam que as mandíbulas estão totalmente relaxadas.
Figura 2: tensão e relaxamento em bocas de Aplysia anestesiadas. (A) Aplysia mostrando um alto grau de tensão muscular ao redor dos lábios. Isto correlaciona-se com a tensão da maxila e contraindicates que prosseguem com a cirurgia. (B) Aplysia com lábios relaxados, mostrando o interior das mandíbulas (cinza claro). As cores correspondem novamente àquelas observadas no animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Se os lábios de um animal não estiverem relaxados, injete um adicional de 30 mL de cloreto de magnésio e aguarde mais 5 min. Se isso não resultar em relaxamento labial, devolva-os a um recipiente isolado com bom fluxo de água para que eles se recuperem (consulte a etapa 4) e prossiga com um animal diferente.
2. expor a superfície radular
- Posicione o Slug de modo que a cabeça pendure para baixo, permitindo que a massa oral se estabeleça de encontro às maxilas.
- Aplique pressão com o polegar e o indicador para empurrar a massa bucal em direção às mandíbulas, segurando a massa bucal no lugar.
- Gire as mandíbulas para que elas sejam visíveis. Ao mesmo tempo, manter a pressão sobre a massa bucal para que o proa da massa bucal é visível através das mandíbulas. (Figura 3).
Figura 3: apoiando a massa bucal contra o interior das mandíbulas. Os dedos apoiam a massa bucal que foi empurrada acima de encontro à borda interna das maxilas até que a ponta do proa possa ser considerada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Trabalhe delicadamente as pontas do fórceps sem corte na fenda do odontóforo e use-as para alavancar a superfície radular através das maxilas. Se as mandíbulas não estão suficientemente relaxado, use o fórceps para agarrar suavemente a borda da fenda para ajudar este processo.
Atenção: Esta pressão arrisca maior dano ao animal. - Uma vez que a superfície é exposta, trabalhe as maxilas desobstruídas da parcela anterior da superfície radular toda a maneira em torno do perímetro. Isso faz com que o odontóforo menos propensos a retrair (Figura 4). Assegure-se de que não mais do que a metade das paredes do odontóforo esteja exposta.
Figura 4: eversão parcial do Odontophore. A superfície radular é totalmente exposta, mas os lados do odontóforo não são descobertos, tornando isso apenas uma eversão parcial. Mais eversão provavelmente resultará em danos ao animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Uma eversão completa do odontóforo causará dano de músculo principal de que os animais são muito lentos recuperar.
3. incisões cirúrgicas
-
Uma vez que a superfície radular é exposta inteiramente, arranje o Slug um espaço da dissecção para a cirurgia.
- Alternativamente, use uma faixa de borracha larga e uma terceira mão para estabilizar as maxilas e a superfície radular para a cirurgia, especial ao aprender. Isso, no entanto, acrescenta tempo e maior dano tecidual ao procedimento, o que o torna menos ideal a longo prazo.
- Coloque a superfície radular de modo que o lado da fenda enfrenta o investigador.
- Agarre delicadamente a superfície radular, perto da base radular, de modo que uma dobra horizontal seja dada forma perpendicular ao vinco anatômico. Use uma tesoura fina para cortar através desta dobra, fazendo uma incisão ao longo do vinco anatômico (Figura 5).
Figura 5: localização da incisão na superfície radular. (A) superfície radular, com uma incisão. (B) superfície radular com círculos mostrando onde os fios do músculo i7 bilateral anexar; as linhas pontilhadas mostram a localização dos músculos descendentes embaixo da superfície radular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Estenda esta incisão inicial a 3-5 cm para permitir o acesso ao interior da massa bucal.
- Ajuste a luz de modo que aponte diretamente para trás através desta incisão.
- Peça as bordas da incisão de modo que a parte traseira do lúmen do odontóforo e as costas verticais finas do músculo i7 sejam visíveis. (Figura 6)
Figura 6: localização do i7 através da incisão de superfície radular. Olhando através da incisão, ambas as vertentes de i7 pode ser visto entre as superfícies internas de i4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Alcançar através da incisão, segure ambas as vertentes do i7, e puxe-as através da incisão, onde tanto quanto o músculo pode ser cortado como é prático (Figura 7).
Figura 7: puxando a vertente do músculo i7 através da incisão. O músculo i7 é altamente elástico e pode ser puxado para cima através da incisão para remoção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Com a prática, é geralmente mais eficaz para localizar i7 por sentir do que pela vista.
4. cuidados pós-operatórios
- Depois que as lesões foram executadas, segure os tentáculos anteriores, e empurre para baixo na superfície radular para retornar o Slug a sua configuração original.
- Coloque os animais pós-cirúrgicos em um ambiente protegido com bom fluxo de água. O aumento da oxigenação acelera a recuperação. Assegure-se de que os animais estejam atentos e responsivos no dia após a cirurgia. Se esse não for o caso, pode-se supor que eles não se recuperarão.
Nota: Os animais geralmente começam a se alimentar no primeiro ou segundo dia após a cirurgia. Mesmo os animais que estão tendo dificuldade em morder deve ser oferecida algas, como é a nossa observação anedótica de que a recuperação de um animal é melhorada por suas tentativas de comer.
5. para a lesão da fibra do secundário-radular
- Siga os passos de 1,1 a 3,5
- Insira a ponta de uma pequena lâmina de bisturi reto (#11 ou similar) através da incisão com a aresta afiada inclinada para cima. Raspe delicadamente as fibras musculares finas da parte inferior da superfície radular. (Figura 8).
Figura 8: Lesioning as fibras Subradulares. A borda da lâmina do bisturi é inclinada para cima através da incisão para a parte inferior da superfície radular para que possa raspar suavemente as fibras subradulares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Retorne à etapa 4,1.
Representative Results
Trabalhos anteriores sugeriram que o músculo i7 contribuiu para a abertura do Grasper8. Nossos próprios estudos anatômicos sugeriram que as fibras subradulares também pudessem contribuir para a abertura do Grasper. Para testar essas hipóteses, os animais foram induzidos a gerar picadas antes e após o recebimento de um procedimento cirúrgico. Os animais Sham foram submetidos a todas as etapas cirúrgicas, incluindo a incisão na superfície radular, mas não foram removidos músculos internos. Os animais submetidos a uma lesão i7 tiveram ambos os músculos i7 removidos. Os animais submetidos a uma lesão de fibra subradular apresentaram ~ 25% das fibras subradulares removidas imediatamente abaixo da incisão. Lesões Sham não tiveram efeito significativo na largura da abertura no pico de mordida, enquanto as lesões das fibras i7 e subradulares reduziram significativamente a largura da mordida (Figura 9).
Figura 9: resultados das lesões na largura de abertura durante o pico de mordedura. Os dados mostrados são as diferenças entre a largura de abertura normalizada média da rádula antes e após o procedimento cirúrgico para 5 animais em cada um dos 3 grupos (Sham, lesão i7, ou lesão de SRF), com cada animal servindo como seu próprio controle. As médias foram realizadas de 5 picadas antes e 5 picadas após o procedimento cirúrgico para determinar a diferença normalizada média. A largura de abertura foi a distância do centro de rádula à borda radular na protração máxima, normalizada pela distância da superfície interna da base radular até as bordas da fenda lateral da superfície radular. As diferenças são mostradas como os meios mais ou menos o desvio padrão. Depois de estabelecer que os dados de diferença foram normalmente distribuídos, a probabilidade de que a lesão não teve efeito foi determinada (ou seja, a hipótese nula foi testada que os efeitos dos procedimentos cirúrgicos seria zero, em média), aplicando um par teste t para cada grupo independente. Os dados demonstram que a lesão Sham não teve efeito significativo, enquanto que uma lesão dos músculos i7 ou uma lesão das fibras subradulares teve um efeito significativo na abertura do radular (p < 0, 31 para o grupo de lesões i7, indicada com um único asterisco , ou p < 0, 2 para o grupo de lesões SRF, indicado por um asterisco duplo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Peso corporal | Dose de cloreto de magnésio |
| < 200 g | 1/2 peso corporal |
| 200-350 g | 1/3 peso corporal |
| 350-450 g | 1/4 peso corporal |
Tabela 1: Dosagem de cloreto de magnésio por peso corporal.
Discussion
As etapas mais críticas dentro do protocolo são a necessidade de garantir que o animal está totalmente anestesiado, e que a eversão da massa bucal é apenas o suficiente para acessar os músculos subjacentes. Pode exigir alguma prática para aperfeiçoar estas etapas, mas uma vez que são dominada, o rendimento das cirurgias é provável ser maior de 85% de todos os experimentos feitos. A maneira a mais importante de modificar corretamente e pesquisar defeitos o protocolo é gastar o tempo que faz dissecções da massa oral de modo que as posições dos músculos internos estejam completamente desobstruídas ao investigador. Porque a incisão sugerida através da superfície radular inevitavelmente causa algum dano às fibras subradulares subjacentes, pode ser apropriado modificar a localização exata da incisão para evitar regiões específicas dessas fibras.
Uma limitação da técnica cirúrgica é que pode ter efeitos não específicos sobre as respostas alimentares, como a força da protração. Uma maneira de superar esta limitação é ter os animais servem como seus próprios controles. Além, é crítico ter um grupo Sham da lesão que seja sujeitado ao protocolo cirúrgico inteiro à exceção da remoção do músculo específico (isto é, i7 ou os SRFs). Ao seguir estas sugestões, um investigador reduzirá os efeitos da variabilidade entre os animais e terá uma medida intrínseca dos efeitos não específicos da cirurgia.
O trabalho anterior utilizou abordagens através da parede corporal para lesão ou registro dos nervos13,14ou músculos15,16,17. Em nosso laboratório, nós observamos curiosamente que as incisões da parede do corpo são acompanhadas frequentemente de uma perda significativa de hemolinfa e assim do volume de corpo. Os animais muitas vezes exigem vários dias para se recuperar disso, e se a lesão da parede do corpo não é cuidadosamente suturada, os animais não podem se recuperar. Além disso, a examinação post-mortem dos animais revela cicatrizes consideráveis em torno da incisão e uma resposta imune forte (observações anedóticas). Em contrapartida, os animais não apresentam perda de hemolinfa ou alteração do volume corporal após a recuperação do protocolo descrito aqui (com base em observações em 96 animais).
As aplicações futuras da técnica podem estendê-la a outros músculos dentro do instrumento de alimentação de Aplysia, e a outros animais. Temos focado na remoção do músculo i7 e fibras subradulares. Estas mesmas técnicas cirúrgicas gerais igualmente permitem o acesso à maioria dos outros músculos do odontophore. Alguns destes, como a porção interna do músculo i5, são melhor acessados através da superfície radular. Outros, como os folhetos internos de i4, podem ser alcançados melhor através do epitélio exterior do odontophore. Nós fizemos testes preliminares onde uma incisão o cleft radular do odontóforo parcialmente evertido permitiu o acesso para que um gancho afiada fosse introduzido que poderia então ser usado à lesão um outro músculo dentro do odontóforo, músculo i88. Porque o protocolo cirúrgico descrito aqui não abre a cavidade do corpo principal, nenhuma sutura é exigida.
O protocolo que temos descrito pode ser de interesse geral para outros investigadores que trabalham em estruturas de tecidos moles que de outra forma seriam difíceis de manipular, por exemplo, o aparelho de alimentação de outros moluscos. Mais geralmente, este protocolo poderia sugerir outras abordagens cirúrgicas novas à análise de estruturas macias tais como línguas, troncos ou tentáculos18.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer o trabalho duro que Sherry Niggel, sisi Lu, e Joey Wu põr em melhorar e em validar estes protocolos. Este trabalho foi apoiado pelo NSF Grant IOS 1754869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
- Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
- Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
- Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
- Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
- Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
- Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
- Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
- Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
- Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
- Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
- Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
- de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
- Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
- Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).
