Здесь мы представляем протокол для минимально инвазивного хирургического поражения мышц, присущих аппарату кормления морского моллюска Aplysia californica, чтобы понять роль этих мышц во время кормления поведения.
Aplysia californica является модельной системой для изучения нейронного контроля обучения и поведения. Это животное имеет полуоткрытую систему кровообращения, что позволяет получить доступ ко многим из его внутренних структур, не причиняя каких-либо значительных повреждений. Многие манипуляции можно легко выполнять как in vivo, так и in vitro, что делает его высокоуступчивой моделью для анализа поведения и нейронных схем. Чтобы лучше понять функции мышц в кормущей хватке, мы разработали методику поражения их без открытия основной полости тела животного или повреждения внешних слоев кормящего органа (т.е. буккальной массы). В этом методе, захват частично everted, позволяющ сразу доступ к мускулатуре. Эта процедура позволяет животным быстро и надежно восстанавливаться. Это позволило к поражению мышц I7 и субрадулярных волокон, что позволяет нам показать, что обе мышцы вносят значительный вклад в открытие in vivo.
Система кормления Aplysia californica имеет долгую историю использования в качестве модели системы для понимания обучения и памяти1, мотивированное поведение 2,3, и взаимодействие между поведением, биомеханики и нейронного контроля во время кормления4. Он имеет высокодоступную нейронную схему, с относительно небольшим числом крупных, идентифицируемых нейронов. У животного полуоткрытая кровеносная система, что позволяет получить доступ ко многим его внутренним структурам, не причиняя значительного ущерба. Он также является надежным для многих манипуляций как in vivo, так и in vitro, что делает его высокоуступчивой моделью для анализа поведения и нейронных схем.
Чтобы понять нейронные модели, которые приводят к кормления поведения, важно описать основные механики мягкой структуры, которая составляет орган питания, buccal массы4. Хотя была проделана работа, чтобы охарактеризовать внешние мышцы, которые составляют buccal массы5,6, внутренние мышцы основной структуры в buccal массы, которая контролирует поверхность захвата, одонтофор, были в значительной степени недоступны для экспериментов in vivo. Хотя были в пробирке исследования о функциях некоторых из этих мышц7,8, отсутствие прямого доступа к этим мышцам затрудняет изучение их роли в нетронутых, ведя себя животных.
Большинство методов для имплантации электродов или поражений в Aplysia или аналогичных моллюсков видов требуют, чтобы стенка тела быть открыт9,10,11,12. Открытие стенки тела вызывает эпителиальную травму, и разрез должен быть надежно запечатан, чтобы предотвратить побег гемолимфы. Еще более серьезные трудности возникают при попытке достичь внутренних мышц захвата Aplysia (мышцы, лежащие в основе радулярной поверхности или в одонтофоре): введя через основную полость тела, нужно затем пройти через некоторые часть мышечной стенки буккальной массы, чтобы получить доступ к внутренним структурам(рисунок 1A). Эта накопленная травма и трудность доступа сделали подход с помощью обычных средств проблематичным, потому что животные не оправиться хорошо от этих операций (животных с полными отвращениями, только 17% восстановили любую способность кормления, N No 12. Около 85% невсегдаевки животных восстановили способность к корму, N No 84).
Мышца I7, которая была охарактеризованакак радулярный нож 8, находится глубоко внутри самого одонтофора, что еще больше усложняет доступ. Он простирается между основанием радулярного стебля(рисунок 1С)и нижней частью радулярной поверхности, через просвет в одонтофоре (рисунок1С). С трех сторон мышц I7 находятся стенки мышц, а четвертая стена состоит из радулярного стебля. Для целей биомеханического исследования, серьезные нарушения любой из этих структур будет поставить под угрозу нормальную функцию кормления аппарата. Мы разработали новый подход к работе одонтофора через челюсти, и проведение операции через разрез на тонкой, хрящевой радулярной поверхности, что позволило к поражению мышцы I7, а также недавно описанные тонкие мышечные волокна, которые работать прямо под радулярной поверхности, которую мы называем субрадулярных волокон(рисунок 1C).
Рисунок 1: Анатомический обзор. (A) Расположение buccal массы в Aplysia. (B) Внешняя анатомия одонтофора. Поверхность радула и радулярного мешка желтая; мышцы, составляющие одонтофор, показаны красным цветом, в зависимости от их фактических цветов. (C) Сагиттальный раздел одонтофора, показывающий расположение субрадулярных волокон (изогнутая розовая линия) и I7 мышцы (прямая розовая линия). Поперечное сечение мышцы I6 показано темно-красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Наиболее важными шагами в протоколе являются необходимость обеспечения того, чтобы животное полностью обезглавлена, и что эверсия buccal массы достаточно, чтобы получить доступ к основным мышцам. Это может потребовать некоторой практики для совершенствования этих шагов, но как только они освоены, выход от операций, вероятно, будет больше, чем 85% всех экспериментов. Самый важный способ правильно изменить и устранить неполадки протокола, чтобы тратить время делать вскрытия buccal массы так, что расположение внутренних мышц полностью ясно следователю. Поскольку предлагаемый разрез через радулярную поверхность неизбежно наносит некоторый ущерб основным подрадным волокнам, может быть целесообразным изменить точное расположение разреза, чтобы избежать определенных областей этих волокон.
Одним из ограничений хирургической техники является то, что она может иметь неспецифические последствия для кормления ответов, таких как сила затягивания. Один из способов преодолеть это ограничение заключается в том, чтобы животные служат в качестве своего собственного контроля. Кроме того, крайне важно иметь группу фиктивного поражения, которая подвергается всему хирургическому протоколу, за исключением удаления конкретной мышцы (т.е. I7 или SRF). Следуя этим предложениям, исследователь уменьшит последствия изменчивости между животными и имеет внутреннюю меру неспецифических эффектов хирургии.
Предыдущая работа использовала подходы через стенку тела к поражению или записи либо от нервов13,14, или мышцы15,16,17. В нашей лаборатории, мы анекдотически наблюдается, что разрезы стенки тела часто сопровождается значительной потерей гемолимфы и, следовательно, объем тела. На восстановление животных часто требуется несколько дней, а если на стенке тела не пришиваются тщательно, животные могут не оправиться. Кроме того, вскрытие животных выявило значительные рубцы вокруг разреза и сильный иммунный ответ (анекдотические наблюдения). В отличие от этого, животные не показывают потери гемолимфы или изменения объема тела после восстановления из протокола, описанного здесь (на основе наблюдений в 96 животных).
Дальнейшее применение метода может распространить его на другие мышцы в кормовом аппарате Аполисии, а также на других животных. Мы сосредоточились на удалении мышц I7 и субрадулярных волокон. Эти же общие хирургические методы также позволяют доступ к большинству других мышц одонтофора. Некоторые из них, такие как внутренняя часть мышцi I5, лучше всего доступны через радулярную поверхность. Другие, как внутренние листовки I4, могут быть лучше достигнуты через внешний эпителий одонтофора. Мы сделали предварительные испытания, где разрез под радулярной расщелины частично everted одонтофора позволило доступ к заточенный крюк, который будет вставлен, которые затем могут быть использованы для поражения другой мышцы в одонтофоре, мышцы I88. Поскольку описанный здесь хирургический протокол не открывает основную полость тела, не требуется зашивания.
Протокол, который мы описали, может представлять общий интерес для других исследователей, работающих над структурами мягких тканей, которыми в противном случае было бы трудно манипулировать, например, аппаратом кормления других моллюсков. В более общем плане, этот протокол может предложить другие новые хирургические подходы к анализу мягких структур, таких как языки, стволы или щупальца18.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы отметить тяжелую работу, которую Шерри Ниггель, Лу и Джоуи Ву вложили в совершенствование и проверку этих протоколов. Эта работа была поддержана NSF Грант IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |