Her presenterer vi en protokoll for minimalt invasiv kirurgisk lesioning av musklene iboende til fôring apparatet av marine mollusk Aplysia californica å forstå rollene til disse musklene under fôring atferd.
Aplysia californica er et modell system for å studere den nevrale kontroll av læring og atferd. Dette dyret har en semi-åpen sirkulasjons-system, noe som gjør det mulig å få tilgang til mange av sine interne strukturer uten å forårsake noen betydelig skade. Mange manipulasjoner kan enkelt utføres både i vivo og in vitro, noe som gjør det til en svært medgjørlig modell for analyse av atferd og nevrale kretser. For bedre å forstå funksjonene til musklene i fôring grasper, har vi utviklet en teknikk for lesioning dem uten å åpne den viktigste kroppen hulrom av dyret eller skade de ytre lag av fôring organ (dvs. den bukkal massen). I denne teknikken, er grasper delvis vrenges ut, slik at direkte tilgang til muskulaturen. Denne fremgangsmåten gjør at dyrene kan komme seg raskt og pålitelig. Denne har fremstilt den mulig å leksjonen det i7 muskelen og sub-radular fibre, tillater oss å viser det begge to muskelen viktig levere å åpningen inne vivo.
Fôring system av Aplysia californica har en lang historie med bruk som et modell system for å forstå læring og minne1, motivert atferd2,3, og samspillet mellom atferd, biomekanikk og nevrale kontroll under fôring4. Den har lett tilgjengelige nevrale kretser, med et relativt lite antall store, identifiserbare neurons. Dyret har en semi-åpen sirkulasjons-system, noe som gjør det mulig å få tilgang til mange av sine interne strukturer uten å forårsake betydelig skade. Det er også robust for mange manipulasjoner både i vivo og in vitro, noe som gjør det til en svært medgjørlig modell for analyse av atferd og nevrale kretser.
For å forstå nevrale mønstre som gir opphav til fôring atferd, er det viktig å beskrive den underliggende mekanikken i den myke strukturen som utgjør fôring organ, den bukkal massen4. Mens det har vært arbeid gjort for å karakterisere de ytre musklene som utgjør bukkal masse5,6, den indre musklene i den underliggende strukturen innenfor bukkal massen som styrer overflaten av grasper, den odontophore, har vært i stor grad utilgjengelige for in vivo-eksperimentering. Selv om det har vært in vitro studier på funksjonene til noen av disse musklene7,8, mangel på direkte tilgang til disse musklene har gjort det vanskelig å studere deres rolle i intakt, oppfører dyr.
De fleste teknikker for implantat teknikk eller lesjoner i Aplysia eller liknende skjellene arter krever at kropps veggen åpnes9,10,11,12. Åpne kroppen veggen forårsaker epitel skader, og snittet må være forsvarlig forseglet for å hindre hemolymph rømme. Enda mer alvorlige vanskeligheter stilles når du forsøker å nå de indre musklene i grasper av Aplysia (musklene underliggende radular overflaten eller innenfor odontophore): å ha gått inn gjennom de viktigste kroppen hulrom, må man da gå gjennom noen del av muskel veggen av bukkal massen for å få tilgang til de innvendige strukturene (figur 1a). Denne akkumulerte skaden og vanskeligheten av tilgang har gjort tilnærmingen gjennom konvensjonelle betyr problematisk fordi dyrene ikke gjenopprette godt fra disse operasjonene (av dyr med full eversions, bare 17% tilbake noen fôring evne, N = 12. Rundt 85% av ikke-vrenges ut dyr gjenvunnet evnen til å mate, N = 84).
Den i7 muskelen, som har vært karakterisert som en radular opener8, er dypt inne i odontophore selv, ytterligere kompliserer tilgang. Den strekker seg mellom bunnen av radular stilken (figur 1C) og undersiden av radular overflate, gjennom en lumen i Odontophore (figur 1C). På tre sider av i7 musklene er veggene i muskelen, og den fjerde veggen består av radular stengel. Ved anvendelsen av en biomekaniske studie ville betydelig svekkelse av noen av disse strukturene kompromittere normal funksjon av fôrings apparatet. Vi utviklet en ny tilnærming for å jobbe odontophore ut gjennom kjever, og gjennomføre kirurgi gjennom et snitt til den tynne, cartilaginous radular overflate, som gjorde det mulig å lesjon i7 muskelen, samt nylig beskrevet fine muskelfibre som løpe like under radular overflate, som vi refererer til som sub-radular fibre (figur 1C).
Figur 1: anatomisk oversikt. (A) plassering av bukkal massen innen Aplysia. (B) ekstern anatomi av odontophore. Overflaten av Forgjellesnegler og radular SAC er gul; musklene komponere odontophore er vist i rødt, basert på deres faktiske farger. (C) sagittal delen av odontophore, viser plasseringen av sub-radular fibre (buet rosa linje) og i7 muskel (rett rosa linje). Tverrsnitt av i6 muskelen er vist i mørk rød. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De fleste betenkelig skritt innen protokollen er behovet å sikre det det dyr er fullt ut anesthetized, og det eversion av det bukkal masse er rettferdig nok å adgang det underliggende muskelen. Det kan kreve litt øvelse å perfeksjonere disse trinnene, men når de er mestret, avkastningen fra operasjoner er sannsynlig å være større enn 85% av alle eksperimenter gjort. Den viktigste måten å riktig modifisere og feilsøke protokollen er å bruke tid på å gjøre dissections av bukkal massen slik at plasseringen av de interne musklene er helt klart for etterforsker. Fordi den foreslåtte snitt gjennom radular overflaten uunngåelig forårsaker noen skade på underliggende sub-radular fibre, kan det være hensiktsmessig å endre den nøyaktige plasseringen av snittet for å unngå bestemte regioner av disse fibrene.
En begrensning av kirurgisk teknikk er at det kan ha ikke-spesifikke virkninger på fôring svar, slik som styrken av protraction. En måte å overvinne denne begrensningen er å ha dyr tjene som sine egne kontroller. I tillegg er det avgjørende å ha en humbug lesjon gruppe som er utsatt for hele kirurgisk protokoll med unntak av fjerning av den spesifikke muskelen (dvs. i7 eller SRFs). Ved å følge disse forslagene, vil en undersøker redusere virkningene av variasjon mellom dyr og har en iboende mål på de ikke-spesifikke virkningene av kirurgi.
Tidligere arbeid har brukt tilnærminger gjennom kroppen veggen til lesjon eller ta opp enten fra nerver13,14, eller muskler15,16,17. I vårt laboratorium har vi Anecdotally observert at kroppen vegg snitt er ofte ledsaget av et betydelig tap av hemolymph og dermed av kroppens volum. Dyr ofte forlange adskillige dager å komme til hektene igjen etter denne, og hvis kroppen mur leksjonen er ikke forsiktig sutured, dyrene kanskje ikke komme seg. I tillegg, post-obduksjon undersøkelse av dyrene avslører betydelige arrdannelse rundt snittet og en sterk immunrespons (anekdotiske observasjoner). I kontrast, dyr viser ingen tap av hemolymph eller endring i kroppen volum etter utvinning fra protokollen som er beskrevet her (basert på observasjoner i 96 dyr).
Fremtidige anvendelser av teknikken kan utvide den til andre muskler i fôring apparater av Aplysia, og til andre dyr. Vi har fokusert på fjerning av i7 muskel og sub-radular fibre. De samme generelle kirurgiske teknikker gir også tilgang til de fleste av de andre musklene i odontophore. Noen av disse, for eksempel den interne delen av i5 muskelen, er best tilgjengelig gjennom radular overflaten. Andre, som den indre brosjyrer av I4, kan være bedre nås gjennom utvendig epitel av odontophore. Vi har gjort foreløpige forsøk der et snitt under radular kløft av delvis vrenges ut odontophore tillot tilgang for en skjerpet kroken skal settes inn som kan brukes til å lesjon en annen muskel i odontophore, muskel I88. Fordi den kirurgiske protokollen som er beskrevet her ikke åpner den viktigste kroppen hulrom, ingen suturing er nødvendig.
Protokollen som vi har beskrevet kan være av allmenn interesse for andre etterforskere som arbeider på bløtvev strukturer som ellers ville være vanskelig å manipulere, f. eks, fôring apparat av andre bløtdyr. Mer generelt kan denne protokollen foreslå andre romanen kirurgiske tilnærminger til analyse av myke strukturer som tunger, kofferter eller tentakler18.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne erkjenne det harde arbeidet som Sherry Niggel, Sisi Lu, og Joey Wu satt i å forbedre og validere disse protokollene. Dette arbeidet ble støttet av NSF Grant IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |