Summary

الميكانيكا الحيوية المبطنة عن طريق الاضطرابات الهيكلية 43

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا علي أساس الميكانيكا لعرقله الفجوة تقاطع بمناسبه 43 وقياس الأثر اللاحق هذا له علي الميكانيكا الحيوية البطانية عن طريق مراقبه القصبات والإجهادات البينية.

Abstract

وقد أنشئت الخلايا البطانية لتوليد الضغوط بين الخلايا والقصبات ، ولكن الدور تقاطعات الفجوة تلعب في الإجهاد بين الخلايا البطانية وتوليد الجر غير معروف حاليا. ولذلك ، فاننا نقدم هنا بروتوكول الميكانيكا القائم علي التحقيق في تاثير الفجوة تقاطع بال43 (Cx43) لديه علي الميكانيكا الحيوية البطانية من خلال تعريض متموج البطانات البطانية إلى المثبط Cx43 المعروفة 2 ، 5-ديهيدروكسيتشالكون (الكلداني) و قياس تاثير هذا المثبط علي القصبات والضغوط البينية. نقدم نتائج تمثيليه ، والتي تظهر انخفاضا في كل من القصبات والإجهادات البينية تحت جرعه عاليه المخروط (2 ميكروغرام/مل) بالمقارنة مع السيطرة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول ليس فقط Cx43 ، ولكن أيضا تقاطعات الفجوة الأخرى كذلك ، علي افتراض استخدام المثبط المناسب. ونحن نعتقد ان هذا البروتوكول سيكون مفيدا في مجالات القلب والاوعيه الدموية وبحوث البيولوجيا الميكانيكية.

Introduction

ويعرف الحقل الذي يشير إلى دراسة اثار القوات البدنية والخواص الميكانيكية علي فسيولوجيا الخلايا والانسجه وعلم الامراض باسم البيولوجيا اليه1. وهناك عدد قليل من التقنيات المفيدة التي تم استخدامها في البيولوجيا الميكانيكية هي أحاديه الطبقة المجهر الإجهاد والمجهر قوه الجر. الجر قوه المجهر يسمح لحساب العمليات التي تم إنشاؤها في واجهه الخلية الركيزة ، في حين ان المجهر أحاديه الطبقة الإجهاد يسمح لحساب الضغوط بين الخلوية المتولدة بين الخلايا المجاورة داخل أحادي الطبقة2 ،3،4،5،6. وقد اقترحت النتائج التي أسفرت عنها الأساليب السابقة ان الإجهاد الميكانيكية المستمدة من الخلايا تلعب دورا حاسما في تحديد مصير مجموعه من العمليات الخلوية3,4,5. فعلي سبيل المثال ، عند التعرض لقوه ميكانيكيه خارجيه ، يمكن لمجموعه من الخلايا المهاجرة كجماعه ان تغير شكلها وتقوم باستقطاب اشكالها لمحاذاتها وترحيلها علي طول اتجاه القوه التطبيقية ، وذلك جزئيا بتوليد القصبات7، 8-الآن وتوفر عمليات التعقب مقياسا يمكن استخدامه لتقييم انقباض الخلية وتحسب باستخدام مجهر قوه الجر (TFM). يبدا المجهر قوه الجر (TFM) مع تحديد الخلايا التي يسببها تشوات الركيزة تليها حساب حقل الجر باستخدام صارمة رياضيا ، والميكانيكا المستندة إلى نهج الحسابية. منذ القدرة علي حساب التعقب وقد حول لبعض الوقت ، وقد استخدمت الباحثين TFM للكشف عن اثر القصبات لديها علي مجموعه من العمليات ، بما في ذلك السرطان9، التئام الجروح10 وتقييم القلب المهندسة الانسجه11.

يمكن تقسيم تنفيذ TFM و MSM معا إلى ثلاث خطوات أساسيه يجب تنفيذها بالترتيب التالي: أولا ، يتم تحديد التشوات هيدروجيل التي تنتجها الخلايا. الثانية ، يتم استرداد القصبات من التشوات هيدروجيل. وثالثا ، يتم استخدام نهج العنصر المحدود لحساب الإجهادات البينية العادية والقص داخل الطبقة الاحاديه بأكملها. لحساب الإزاحات هلام ، تم مقارنه الصور حبه مضان مع الخلايا مع صوره حبه المرجع (بدون خلايا) باستخدام قياس سرعه صوره الجسيمات المكتوبة حسب العرف (PIV) الروتينية. تم اختيار حجم اطار الارتباط التبادلي والتداخل لتحليل PIV ليكون 32 × 32 بكسل و 0.5 ، علي التوالي. في هذا الوقت ، تم تحويل بكسل التحولات إلى ميكرون عن طريق ضرب مع عامل تحويل بكسل إلى ميكرون (لمجهر لدينا ، وهذا عامل التحويل هو 0.65) للحصول علي النزوح في الطائرة. الأخطاء المرتبطة بتجاهل عمليات النزوح خارج الطائرة لا تذكر12,13. بعد حساب النزوح هلام ، وهناك نوعان من قياسات الجر التي يمكن استخدامها ، والانزلاقات المقيدة والمتعقبات غير مقيده8،14. توفر عمليات التعقب غير المقيدة حقل الجر لحقل العرض بأكمله (بما في ذلك المناطق التي بها خلايا وبدونها) ، بينما توفر عمليات التعقب المقيدة حقل الجر فقط للمناطق التي تتضمن الخلايا14. ثم يتم احتساب الضغوط البينية باستخدام مجهر الإجهاد أحادي الطبقة (MSM) ، وهو امتداد لمجهر قوه الجر. ويستند تنفيذ MSM قباله افتراض ان القصبات المحلية التي تمارسها أحاديه الطبقة من الخلايا في واجهه الخلية-الركيزة يجب ان تكون متوازنة من قبل القوات الميكانيكية المنقولة بين الخلايا في واجهه خليه خليه كما هو مطلوب من قبل قوانين نيوتن7 و12و13. ومن الافتراضات الرئيسية هنا ان الخلية أحاديه الطبقة يمكن ان تعامل علي انها ورقه مرنه رقيقه لان توزيع الجر في الطبقة الاحاديه معروف وان توازن القوه لا يعتمد علي خصائص المواد الخلوية. ومن الافتراضات الرئيسية الأخرى ان قوي الجر متوازنة بالضغوط المحلية البينية داخل المجال البصري للراي (داخل الطبقة الاحاديه) وان تاثير توازن القوه هذا هو الحد الأدنى في المنطقة البعيدة (خارج الطبقة الاحاديه)13. ولذلك ، فان الظروف الحدودية التي تحددها الضغوطات البينية ، أو الإزاحات ، أو الجمع بين كل من الحدود الاحاديه الطبقة ، هي شروط حاسمه لأداء MSM13. مع الأخذ بعين الاعتبار المعلومات المذكورة أعلاه ، ونحن نستخدم MSM لاجراء تحليل عنصر محدود (فيم) لاستعاده الحد الأقصى الإجهاد الرئيسي (σmax) والحد الأدنى من الإجهاد الرئيسي (σmin) عن طريق تدوير الطائرة الإجهاد في كل نقطه داخل أحادي. وتستخدم هذه الضغوط الرئيسية في وقت لاحق لحساب 2d متوسط الإجهاد البيني العادي [(σmax + σmin)/2] و 2d الحد الأقصى الإجهاد خلاياه [(σmaxmin)/2] داخل الطبقة الاحاديه بأكملها 12,13. ويرد وصف هذا الاجراء بمزيد من التفصيل من قبل tambe وآخرون12،13

المجهر الإجهاد أحاديه الطبقة (MSM) يسمح لحساب الخلايا خليه الضغوط الخلوية المتولدة داخل أحاديه الطبقات6،7،8،12،13. وقد اقترحت هذه الضغوط البينية لتكون مهمة لنمو الانسجه وإصلاح, التئام الجروح, والسرطان الانبثاث12,15,16,17. الاضافه إلى ذلك ، اقترحت الضغوط البينية لتكون أيضا مهمة في هجره الخلايا البطانية والحاجز البطانية وظيفة17،18. في حين ان تقاطعات الخلايا الخلوية مثل التقاطعات الضيقة والتقاطعات الملتصقة قد اقترحت للعب دورا حاسما في توليد الإجهاد الغشائي المتشابك وانتقال العدوى ، فان دور تقاطعات الفجوة لا يزال بعيد المنال. تقاطعات جاب تربط الخلايا المجاورة ماديا وتوفر مسارا لتيار كهربائي وجزيئات (< 1 كده) للمرور بين الخلايا المجاورة19،20،21. علي الرغم من ان الخلايا البطانية التعبير عن Cx37, Cx40, وتقاطعات الفجوة Cx4319,22, Cx43 ويمكن القول ان الأكثر اهميه من حيث تطور المرض23. ويمكن العثور علي أدله علي اهميه Cx43’s في حقيقة ان الحذف الجيني من Cx43 في الفئران يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم24 ولها اثار ضاره علي تولد الاوعيه25. الاضافه إلى ذلك ، تم توثيق Cx43 لتكون مهمة لهجره الخلايا وانتشار وفي تطور تصلب الشرايين18،22،23،24،25 .

في هذا البروتوكول ، استخدمنا TFM و MSM للتحقيق في ما إذا كان الجر وتوليد الإجهاد بين الخلايا داخل المتموج ، سيتاثر أحادي البطانة البطانية من خلال تعطيل مفرق الفجوة البطانية Cx43. قمنا بتعطيل Cx43 مع 2 ، 5-ديهيدروكسيكلالكون (الطباشير) ، وهو جزيء موثقه لمنع Cx43 التعبير26. استعملت [شلكون] كان ان يعطل Cx43 [اينستد وف] [سرنا] بما ان [شسكون] يتلقى يكون يفاد سابقا ب [لي] [آت ال]. ان يعطل Cx43 تعبير26. الاضافه إلى ذلك ، كنا مهتمين بشكل خاص في تاثير chalcone علي بطانة كما قيل أيضا ان يكون مركب مضاد للالتهابات والصفائح الدموية التي يمكن استخدامها للوقاية والعلاج من مختلف الاوعيه الدموية الامراض26. وقد أجريت العلاجات الكلدانية بعد ساعة من بداية التجربة ، وكانت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية لمده ست ساعات ، وتم اجراء معالجه الصور مع رمز MATLAB مكتوبه حسب العرف لتحديد التعقب وفيما بعد البينية تؤكد. أظهرت نتائجنا انخفاضا إجماليا في عمليات التعقب والإجهادات البينية ، مما يوحي بان Cx43 يلعب دورا رئيسيا في الميكانيكا الحيوية البطانية.

Protocol

1. صنع بولياكريلاميد (PA) الهلام اعداد طبق بيتري اعداد ربط سيلان الحل عن طريق خلط 200 mL نقاء المياه مع 80 μl حمض الخليك و 50 μl من 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت. ربط سيلان هو الحل المستخدمة لإضفاء الطابع الوظيفي علي سطح طبق بيتري الزجاج السفلي للمرفق هيدروجيل. يحرك محلول س…

Representative Results

صور التباين المرحلة من السيطرة ، 0.2 ميكروغرام/مل ، و 2 ميكروغرام/مل وقد اتخذت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية 30 دقيقه قبل العلاج الطباشير (الشكل 1ا-ج) وبعد ساعتين من المعالجة الكلدانية (الشكل 1مد-F). ولوحظ ان حالات التشرد ب?…

Discussion

مجموعتنا ، فضلا عن غيرها ، وقد تم بنجاح استخدام tfm و MSM لتحقيق تاثير تقاطعات خليه الخلية في مختلف العمليات الخلوية المرضية والفسيولوجية في المختبر7،15،18،27 . علي سبيل المثال ، Hardin وآخرون قدمت دراسة ثاقبه للغاية التي تشير إ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل جامعه فلوريدا المركزية بدء الأموال ومعهد القلب الوطني, الرئة, والدم من المعهد الوطني للصحة تحت جائزه K25HL132098.

Materials

18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Play Video

Cite This Article
Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

View Video