Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural
Summary
Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.
Abstract
Las células endoteliales se han establecido para generar tensiones y tracción intercelulares, pero actualmente se desconoce el papel que desempeñan las uniones de brecha en la generación de tensión y tracción intercelular endotelial. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo basado en la mecánica para sondear la influencia de la unión de brecha connexina 43 (Cx43) tiene en la biomecánica endotelial mediante la exposición de monocapas endoteliales confluentes a un conocido inhibidor Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) y medir el impacto que este inhibidor tiene en las tracciones y tensiones intercelulares. Presentamos resultados representativos, que muestran una disminución en las tracciones y tensiones intercelulares bajo una dosis alta de chalcone (2 g/ml) en comparación con el control. Este protocolo se puede aplicar no sólo a Cx43, sino también a otros cruces de separación, suponiendo que se utilice el inhibidor adecuado. Creemos que este protocolo será útil en los campos de la investigación cardiovascular y mecanobiología.
Introduction
El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología1. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa2 ,3,4,5,6. Los resultados obtenidos de métodos anteriores han sugerido que las tensiones mecánicas derivadas de células desempeñan un papel crucial en la determinación del destino de una serie de procesos celulares3,4,5. Por ejemplo, al exponerse a una fuerza mecánica externa, un grupo de células que migran como colectivo puede alterar su morfología y polarizar su forma para alinear y migrar a lo largo de la dirección de la fuerza aplicada, en parte, generando tracción7, 8. Las tracciones proporcionan una métrica que se puede utilizar para evaluar la contractilidad celular y se calculan mediante microscopía de fuerza de tracción (TFM). La microscopía de fuerza de tracción (TFM) comienza con la determinación de deformaciones de sustrato inducidas por células seguidas por el cálculo del campo de tracción utilizando un enfoque computacional matemáticamente riguroso y basado en la mecánica. Dado que la capacidad de calcular las tracciones ha existido durante bastante tiempo, los investigadores han utilizado TFM para revelar el impacto que las tracciones tienen en una serie de procesos, incluyendo el cáncer9,la cicatrización de heridas10 y la evaluación de tejido11.
La implementación de TFM y MSM juntos se puede dividir en tres pasos esenciales que deben ejecutarse en el siguiente orden: primero, se determinan las deformaciones de hidrogel producidas por las células; en segundo lugar, las tracciones se recuperan de las deformaciones de hidrogel; y en tercer lugar, se utiliza un enfoque de elementos finitos para calcular tensiones intercelulares normales y cortantes dentro de toda la monocapa. Para calcular los desplazamientos de gel, las imágenes de perlas de fluorescencia con células se compararon con la imagen del cordón de referencia (sin celdas) mediante una rutina de velocimetría de imagen de partículas (PIV) escrita a medida. El tamaño de la ventana de correlación cruzada y la superposición para el análisis PIV se eligieron para ser de 32 x 32 píxeles y 0,5, respectivamente. En este momento, los cambios de píxeles se convirtieron en micras multiplicando con un factor de conversión de píxel a micra (para nuestro microscopio, este factor de conversión es 0,65) para obtener desplazamientos en el plano. Los errores asociados con ignorar desplazamientos fuera del plano son insignificantes12,13. Después del cálculo de los desplazamientos de gel, hay dos tipos de mediciones de tracción que se pueden utilizar, tracciones restringidas y tracciones sin restricciones8,14. Las tracciones sin restricciones proporcionan el campo de tracción para todo el campo de visión (incluidas las regiones con y sin celdas), mientras que las tracciones restringidas proporcionan el campo de tracción solo para las regiones que incluyen las celdas14. A continuación, las tensiones intercelulares se calculan mediante microscopía de tensión monocapa (MSM), que es una extensión de la microscopía de fuerza de tracción. La implementación de MSM se basa en la suposición de que las tracciones locales ejercidas por una monocapa de células en la interfaz célula-sustrato deben equilibrarse mediante fuerzas mecánicas transmitidas entre células en la interfaz de células celulares según lo exigido por las leyes 7 de Newton ,12,13. Una suposición clave aquí es que la monocapa de celda se puede tratar como una hoja elástica delgada porque se conoce la distribución de tracción en la monocapa y el equilibrio de fuerza no depende de las propiedades del material celular. Otra suposición clave es que las fuerzas de tracción están equilibradas por tensiones intercelulares locales dentro del campo de visión óptico (dentro de la monocapa) y la influencia de este equilibrio de fuerza es mínima en la región distal (fuera de la monocapa)13. Por lo tanto, las condiciones límite definidas por tensiones intercelulares, desplazamientos o una combinación de ambos en el límite monocapa son cruciales para realizar MSM13. Teniendo en cuenta la información anterior, utilizamos MSM para realizar un análisis de elementos finitos (FEM) para recuperar la tensión principal máxima(máx.)y la tensión principal mínima(min)girando el plano de tensión en cada punto dentro del Monocapa. Estas tensiones principales se utilizan posteriormente para calcular la tensión intercelular normal promedio 2D [((max + ?min) /2] y la tensión intercelular de cizallamiento máxima 2D [(máx. –min) /2] dentro de toda la monocapa 12,13. Este procedimiento es descrito con más detalle por Tambe et al.12,13
La microscopía de tensión monocapa (MSM) permite el cálculo de tensiones intercelulares de células celulares generadas dentro de una monocapa6,7,8,12,13. Estas tensiones intercelulares se han sugerido para ser importantes para el crecimiento y reparación de tejidos, cicatrización de heridas, y metástasis de cáncer12,15,16,17. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares también son importantes en la migración de células endoteliales y la función de barrera endotelial17,18. Mientras que las uniones de células celulares tales como uniones estrechas y uniones adheridas han sido sugeridas para desempeñar un papel crítico en la generación y transmisión de estrés intercelular endotelial, el papel de las uniones de separación sigue siendo esquivo. Las uniones de brecha conectan físicamente las células adyacentes y proporcionan una vía para que la corriente eléctrica y las moléculas (<1 KDa) pasen entre las células vecinas19,20,21. Aunque las células endoteliales expresan las uniones de brecha Cx37, Cx40 y Cx4319,22, Cx43 es posiblemente la más importante en términos de progresión de la enfermedad23. La evidencia de la importancia de Cx43 se puede encontrar en el hecho de que la eliminación genética de Cx43 en ratones resulta en hipotensión24 y tiene efectos adversos sobre la angiogénesis25. Además, se ha documentado que Cx43 es importante para la migración y proliferación celular y para la progresión de la aterosclerosis18,22,23,24,25 .
En este protocolo, utilizamos TFM y MSM para investigar si la tracción y la generación de tensión intercelular dentro del confluente, monocapa endotelial se vería afectada por la interrupción de la unión de brecha endotelial Cx43. Interrumpimos Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molécula documentada para inhibir cx43 expresión26. Chalcone se utilizó para interrumpir Cx43 en lugar de siRNA como chalcone ha sido reportado previamente por Lee y otros para interrumpir la expresión26de Cx43. Además, estábamos particularmente interesados en la influencia de chalcone en el endotelio, ya que también se ha informado de que es un compuesto antiinflamatorio y antiplaquetario que potencialmente se puede utilizar para la prevención y el tratamiento de varios vasculares patologías26. Los tratamientos de Chalcone se realizaron una hora después del inicio del experimento, se tomaron imágenes monocapas tratadas con chalcone durante un total de seis horas, y el procesamiento de imágenes se realizó con un código MATLAB escrito a medida para determinar las tracciones y, posteriormente, intercelulares Tensiones. Nuestros resultados mostraron una disminución general en las tracciones y tensiones intercelulares, lo que sugiere que Cx43 desempeña un papel clave en la biomecánica endotelial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro grupo, así como otros, ha estado utilizando con éxito TFM y MSM para sondear la influenciade las uniones celulares en diversos procesos celulares patológicos y fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por ejemplo, Hardin et al. presentaron un estudio muy perspicaz que sugiere que la transmisión de tensión intercelular guía la formación de brechas paracelulares en las células endotelia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los fondos de la Start-up de la Universidad de Florida Central y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del Instituto Nacional de Salud bajo el premio K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
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