Perturbing endothelial biomekanikk via Connexin 43 strukturelle avbrudd
Summary
Her presenterer vi en mekanikk-basert protokoll for å forstyrre gapet knutepunkt connexin 43 og måle den påfølgende effekten dette har på endothelial biomekanikk via observasjon av tractions og intercellulære påkjenninger.
Abstract
Endothelial celler har blitt etablert for å generere intercellulære påkjenninger og tractions, men rolle gapet kryss spille i endothelial intercellulære stress og trekkraft generasjon er foreløpig ukjent. Derfor presenterer vi her en mekanikk-basert protokoll for å granske påvirkning av gap Junction connexin 43 (Cx43) har på endothelial biomekanikk ved å utsette confluent endothelial monolagere til en kjent Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (kalkon) og måle effekten denne hemmer har på tractions og intercellulære påkjenninger. Vi presenterer representative resultater, som viser en nedgang i både tractions og intercellulære påkjenninger under en høy kalkon dose (2 μg/mL) sammenlignet med kontroll. Denne protokollen kan brukes til ikke bare Cx43, men også andre gap veikryss i tillegg, forutsatt at riktig inhibitor brukes. Vi tror denne protokollen vil være nyttig innen hjerte-og mechanobiology forskning.
Introduction
Feltet som refererer til studiet av virkningene av fysiske krefter og av mekaniske egenskaper på cellulære og vev fysiologi og patologi er kjent som mechanobiology1. Noen nyttige teknikker som har blitt benyttet i mechanobiology er monolag stress mikroskopi og trekkraft kraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi tillater beregning av tractions generert på cellen-substrat grensesnitt, mens monolag stress mikroskopi tillater beregning av intercellulære påkjenninger generert mellom tilstøtende celler i en monolag2 ,3,4,5,6. Resultater gitt fra tidligere metoder har antydet at celle-avledet mekaniske påkjenninger spille en avgjørende rolle i å bestemme skjebnen til en rekke cellulære prosesser3,4,5. For eksempel, ved eksponering for en ekstern mekanisk kraft, en gruppe celler migrerer som en kollektiv kan endre sin morfologi og polariserer deres form til å justere og migrere langs retningen av anvendt kraft ved, delvis genererer tractions7, 8i den. Tractions gi en beregning som kan brukes til å evaluere celle contractility og beregnes ved hjelp av traction Force mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) begynner med fastsettelse av celle-indusert substrat deformasjoner etterfulgt av beregning av trekkraft feltet ved hjelp av en matematisk streng, mekanikk-baserte beregningsorientert tilnærming. Siden evnen til å beregne tractions har eksistert i ganske lang tid, har forskerne benyttet TFM å avdekke virkningen tractions har på en rekke prosesser, inkludert kreft9, såret healing10 og vurdering av konstruert CARDIAC vev11.
Implementering av TFM og MSM sammen kan deles inn i tre viktige trinn som må utføres i følgende rekkefølge: først hydrogel deformasjoner produsert av cellene bestemmes; andre, tractions utvinnes fra hydrogel deformasjoner; og for det tredje brukes en endelig element tilnærming til å beregne normal og skjær intercellulære spenninger i hele monolag. For å beregne gel forskyvninger, fluorescens perle bilder med celler ble sammenlignet med referanse perle bildet (uten celler) ved hjelp av en tilpasset skrevet partikkel bilde velocimetry (PIV) rutine. Størrelsen på kryss korrelasjons vinduet og overlappingen for PIV-analyse ble valgt til henholdsvis 32 x 32 piksler og 0,5. På denne tid, pixel Skift var omvendt i mikron av multiplisere med en pixel-å-mikron omdanne faktoren (for våre mikroskop, denne omdanne faktoren er 0,65) å få inne-plan forskyvninger. Feil forbundet med ignorerer ut-av-plan forskyvninger er ubetydelig12,13. Etter beregning av gel forskyvninger, er det to typer trekkraft målinger som kan utnyttes, begrenset tractions og ubegrenset tractions8,14. Ubegrenset tractions gir trekkraft feltet for hele synsfeltet (inkludert regioner med og uten celler), mens begrensede tractions gir trekkraft feltet bare for regioner som inneholder celler14. Deretter intercellulære spenninger beregnes ved hjelp av monolag stress mikroskopi (MSM), som er en forlengelse av traction Force mikroskopi. Implementering av MSM er basert på antagelsen om at lokale tractions utøves av en monolag av celler på cellen substrat-grensesnittet må balanseres av mekaniske krefter som overføres mellom cellene på celle-celle-grensesnittet som kreves av Newtons lover7 ,12,13. En viktig forutsetning her er at celle monolag kan behandles som et tynt elastisk ark fordi trekkraft fordelingen i monolag er kjent og kraftbalansen ikke er avhengig av celle materialets egenskaper. En annen viktig forutsetning er at trekkraft kreftene er balansert av lokale intercellulære påkjenninger innenfor det optiske synsfeltet (innenfor monolag) og innflytelsen av denne kraftbalansen er minimal i den ytre regionen (utenfor monolag)13. Grense forholdene som er definert av intercellulære påkjenninger, forskyvninger eller en kombinasjon av begge ved monolag grense, er derfor avgjørende for å utføre MSM13. Tatt i betraktning ovennevnte opplysninger, bruker vi MSM å utføre en endelig element analyse (FEM) for å gjenopprette den maksimale viktigste stress (σMax) og minimum viktigste stress (σmin) ved å rotere stress planet på hvert punkt i monolag. Disse viktigste påkjenninger blir senere brukt til å beregne 2D gjennomsnittlig normal intercellulære stress [(σMax + σmin)/2] og 2D maksimal skjær intercellulære stress [(σMax -σmin)/2] innenfor hele monolag 12,13. Denne fremgangsmåten er beskrevet i mer detalj av Tambe et al.12,13
Monolag stress mikroskopi (MSM) tillater beregning av celle-celle intercellulære påkjenninger generert i en monolag6,7,8,12,13. Disse intercellulære påkjenninger har blitt foreslått å være viktig for vev vekst og reparasjon, sår helbredelse, og kreft metastasering12,15,16,17. I tillegg har intercellulære påkjenninger blitt foreslått å også være viktig i endothelial celle migrasjon og endothelial barrierefunksjon17,18. Mens celle-celle veikryss som tette veikryss og adherens knutepunkter har begge blitt foreslått å spille en avgjørende rolle i endothelial intercellulære stress generasjon og overføring, er rollen som gap knutepunkter fortsatt unnvikende. Gap knutepunkter fysisk koble tilstøtende celler og gi en vei for elektrisk strøm og molekyler (< 1 KDa) å passere mellom nabocellene19,20,21. Selv om endothelial Cells Express Cx37, Cx40, og Cx43 gap veikryss19,22, Cx43 er uten tvil det viktigste i forhold til sykdomsprogresjon23. Bevis på Cx43’s betydning kan bli funnet i det faktum at genetisk sletting av Cx43 i mus resulterer i hypotensjon24 og har uheldige virkninger på angiogenese25. I tillegg har Cx43 blitt dokumentert å være viktig for celle migrasjon og spredning og i progresjon av aterosklerose18,22,23,24,25 .
I denne protokollen, vi brukte TFM og MSM å undersøke om trekkraft og intercellulære stress generasjon innenfor confluent, endothelial monolag ville bli påvirket av forstyrrelsen av endothelial gap Junction Cx43. Vi forstyrret Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (kalkon), et molekyl dokumentert å hemme Cx43 uttrykk26. Kalkon ble brukt til å forstyrre Cx43 i stedet for siRNA som kalkon har blitt rapportert tidligere av Lee et al. å forstyrre Cx43 uttrykket26. I tillegg var vi spesielt interessert i kalkon innflytelse på endotelet som det har også blitt rapportert å være en anti-inflammatorisk og anti-plate sammensatte som kan potensielt brukes til forebygging og behandling av ulike vaskulære patologi26. Kalkon behandlinger ble utført en time etter forsøket utbruddet, kalkon-behandlet monolagere ble avbildet i totalt seks timer, og bildebehandling ble utført med en tilpasset skrevet MATLAB kode for å bestemme tractions og senere intercellulære Understreker. Våre resultater viste en generell nedgang i tractions og intercellulære påkjenninger, antyder Cx43 spiller en nøkkelrolle i endothelial biomekanikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår gruppe, så vel som andre, har vært vellykket ved hjelp av TFM og MSM å granske påvirkning av celle-celle veikryss i ulike patologiske og fysiologiske cellulære prosesser in vitro7,15,18,27 . For eksempel Hardin et al. presentert en svært innsiktsfull studie som antyder intercellulære stress overføring guider paracellular gap dannelse i endothelial celler15. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of Central Florida oppstart midler og National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institute of Health under prisen K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
