Perturbing endotelial biomekanik via Connexin 43 strukturella störningar
Summary
Här presenterar vi ett mekanisbaserat protokoll för att störa gap Junction Connexin 43 och mäta den efterföljande påverkan detta har på endotelial biomekanik genom observation av Tractions och intercellulära spänningar.
Abstract
Endotelceller har etablerats för att generera intercellulära spänningar och Tractions, men roll gapet korsningar spela i endotelceller intercellulära stress och Traction generation är för närvarande okänd. Därför presenterar vi här ett mekaniskbaserat protokoll för att söka påverkan av gap Junction Connexin 43 (Cx43) har på endotelceller biomekanik genom att exponera konfluenta endotelceller enskiktslager till en känd Cx43 hämmare 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) och mäta effekten denna hämmare har på Tractions och intercellulära spänningar. Vi presenterar representativa resultat, som visar en minskning av både Tractions och intercellulära spänningar under en hög Chalkon dosering (2 μg/ml) jämfört med kontroll. Detta protokoll kan tillämpas på inte bara Cx43, men även andra gap korsningar också, förutsatt att lämplig hämmare används. Vi tror att detta protokoll kommer att vara användbart inom områdena kardiovaskulär och mechanobiologi forskning.
Introduction
Det fält som hänvisar till studiet av effekterna av fysikaliska krafter och av mekaniska egenskaper på cellulär och vävnadfysiologi och patologi kallas Mekanobiologi1. Några användbara tekniker som har utnyttjats i Mekanobiologi är enskiktslager stressmikroskopi och dragkraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi möjliggör beräkning av Tractions genereras vid cell-substrat gränssnitt, medan enskiktslager stress mikroskopi möjliggör beräkning av intercellulära påfrestningar som genereras mellan angränsande celler i ett enskiktslager2 ,3,4,5,6. Resultat som framkommit från tidigare metoder har föreslagit att cell-härledda mekaniska spänningar spelar en avgörande roll för att fastställa ödet för en mängd cellulära processer3,4,5. Till exempel, vid exponering för en extern mekanisk kraft, en grupp av celler som migrerar som ett kollektiv kan förändra deras morfologi och polarisera deras form för att anpassa och migrera längs riktningen av tillämpad kraft genom att delvis generera Tractions7, 8. Tractions ger ett mått som kan användas för att utvärdera cell kontraktilitet och beräknas med hjälp av dragkraft mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) börjar med bestämning av cell-inducerad substrat deformationer följt av beräkningen av dragkraft fältet med hjälp av en matematiskt rigorös, mekanik-baserade beräkningsmetoder. Eftersom förmågan att beräkna Tractions har funnits under ganska lång tid, forskare har utnyttjat TFM att avslöja effekterna Tractions har på en mängd processer, inklusive cancer9, sårläkning10 och bedömning av konstruerade hjärt vävnad11.
Genomförandet av TFM och MSM tillsammans kan delas in i tre viktiga steg som måste utföras i följande ordning: för det första bestäms de hydrogel-deformationer som produceras av cellerna. andra, Tractions återvinns från hydrogel deformationer; och för det tredje, en finita element metod används för att beräkna normala och skjuvning intercellulära påfrestningar inom hela monolayer. För att beräkna gel förskjutningar, fluorescens pärla bilder med celler jämfördes med referens pärla bilden (utan celler) med hjälp av en skräddarsydd partikel bild Velocimetry (PIV) rutin. Kors korrelations fönstrets storlek och överlappning för PIV-analys valdes till 32 x 32 pixlar respektive 0,5. Vid denna tid, pixel förskjutningar omvandlades till mikrometer genom att multiplicera med en pixel-till-micron omvandlingsfaktor (för vårt Mikroskop, denna omvandlingsfaktor är 0,65) för att få in-plane förskjutningar. Fel i samband med ignorera out-of-Plane förskjutningar är försumbar12,13. Efter uträkning av gel förskjutningar, finns det två typer av dragkrafts mätningar som kan utnyttjas, begränsade Tractions och oinskränkt Tractions8,14. Oinskränkt Tractions ger dragkraft fältet för hela synfält (inklusive regioner med och utan celler), medan begränsade Tractions ger dragkraft fältet endast för regioner som innehåller celler14. Sedan, intercellulära påfrestningar beräknas med hjälp av enskiktslager stress mikroskopi (MSM), som är en förlängning av dragkraft mikroskopi. Genomförandet av MSM bygger på antagandet att lokala Tractions utövas av en enskiktslager av celler vid cell-substrat gränssnitt måste balanseras av mekaniska krafter överförs mellan celler vid cell-cell-gränssnittet som krävs av Newtons lagar7 ,12,13. Ett avgörande antagande här är att cellen enskiktslager kan behandlas som ett tunt elastiskt ark eftersom dragkraft distributionen i enskiktslager är känd och kraften balansen inte beror på cell materialegenskaper. En annan viktig förutsättning är att drag krafterna balanseras av lokala intercellulära påfrestningar inom det optiska synfält (inom monolayer) och påverkan av denna kraftbalansen är minimal i distala regionen (utanför monolayer)13. Därför är de gräns förhållanden som definieras av intercellulära spänningar, förskjutningar eller en kombination av båda vid enskiktslager gränsen avgörande för att utföra MSM13. Med hänsyn till ovanstående information, vi använder MSM för att utföra en finita element analys (FEM) för att återvinna den maximala huvudsakliga stressen (σMax) och minsta huvudsakliga stress (σmin) genom att rotera stress planet vid varje punkt i enskiktslager. Dessa huvudsakliga spänningar används därefter för att beräkna den 2D genomsnittliga normala intercellulära spänningen [(σMax + σmin)/2] och 2D maximal skjuvning intercellulära spänning [(σMax -σmin)/2] inom den hela enskiktslager 12,13. Denna procedur beskrivs mer detaljerat av tambe et al.12,13
Enskiktslager stress mikroskopi (MSM) möjliggör beräkning av cell-cell intercellulära påfrestningar som genereras inom ett enskiktslager6,7,8,12,13. Dessa intercellulära spänningar har föreslagits vara viktigt för vävnad tillväxt och reparation, sårläkning, och cancermetastaser12,15,16,17. Dessutom, intercellulära spänningar har föreslagits att också vara viktiga i endotelceller cell migration och endotelceller barriärfunktion17,18. Medan cell-cell korsningar såsom snäva korsningar och anhängare korsningar har båda föreslagits för att spela en kritisk roll i endotelceller intercellulära stress generation och transmission, den roll som gap korsningar förblir svårfångade. Gap korsningar fysiskt ansluta angränsande celler och ge en väg för elektrisk ström och molekyler (< 1 kDa) att passera mellan angränsande celler19,20,21. Även endotelceller uttrycka Cx37, Cx40, och Cx43 gap korsningar19,22, Cx43 är utan tvekan den viktigaste när det gäller sjukdomsprogression23. Bevis på Cx43’s betydelse kan hittas i det faktum att genetisk radering av Cx43 hos möss resulterar i hypotoni24 och har negativa effekter på angiogenes25. Dessutom har Cx43 dokumenterats för att vara viktigt för cell migration och proliferation och i utvecklingen av åderförkalkning18,22,23,24,25 .
I detta protokoll använde vi TFM och MSM för att undersöka om dragkraft och intercellulära spännings generering inom det konflytande, endoteliala enskiktslager skulle påverkas av störningen av endotelceller gap Junction Cx43. Vi störde Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), en molekyl som dokumenterats för att hämma Cx43 uttryck26. Chalkon användes för att störa Cx43 istället för siRNA eftersom Chalkon tidigare har rapporterats av Lee et al. för att störa Cx43 Expression26. Dessutom var vi särskilt intresserade av chalcone inflytande på endotelet eftersom det har också rapporterats vara en anti-inflammatorisk och trombocythämmande förening som potentiellt kan användas för att förebygga och behandla olika vaskulära patologier26. Chalcone behandlingar utfördes en timme efter försöket debut, chalcone-behandlade enskiktslager var avbildade i totalt sex timmar, och bildbehandling utfördes med en skräddarsydd MATLAB-kod för att bestämma Tractions och därefter intercellulära Betonar. Våra resultat visade en generell minskning av Tractions och intercellulära spänningar, vilket tyder Cx43 spelar en nyckelroll i endotelceller biomekanik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår grupp, liksom andra, har framgångsrikt använt TFM och MSM för att söka påverkan av cell-cell korsningar i olika patologiska och fysiologiska cellulära processer in vitro-7,15,18,27 . Till exempel presenterade Hardin et al. en mycket insiktsfull studie som antyder intercellulära stress överföring guider paracellulär gap formation i endotelceller15. Även om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av University of Central Florida start-up fonder och National Heart, lung, och Blood Institute i National Institute of Health under Award K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
