Summary
在这里，我们描述了一种通过成年小鼠的间感染途径诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的方法。提出了从接种制备到间感染的脑膜炎球菌感染的一步一步方案;然后记录动物的生存，并评估鼠组织中的细菌负荷。
Abstract
脑膜炎球菌（脑膜炎球菌）是一种窄宿主范围的微生物，全球公认的细菌性脑膜炎的主要原因。脑膜炎球菌是人类鼻咽的瞬时殖民者，约占健康受试者的10%。在特定情况下，它获得侵入能力，穿透粘膜屏障，并侵入血液导致败血症。在最近一个病例中，即使没有随后发展脑膜炎，也可能出现脓毒症。相反，细菌在血液中繁殖不良，穿过血脑屏障，到达中枢神经系统，导致脑膜炎。细菌性脑膜炎的鼠群模型是研究宿主-病原体相互作用和分析导致这种致命疾病的病理遗传机制的有用工具。虽然在过去几十年中，已经评估了几个实验模型系统，但其中没有一个能够重现脑膜炎球菌病的特征病理事件。在本实验协议中，我们描述了基于细菌内接种的小鼠模型中诱导脑膜炎球菌性脑膜炎的详细过程。通过评估临床参数（如温度、体重）、存活率评估、微生物分析和脑损伤组织学检查，在鼠宿主中记录了人类脑膜炎的奇特症状。当使用内囊虫（即cist.）接种时，meningococci完全传递到水凝管，导致脑组织中非常有效的脑膜炎球菌复制。在大约18小时内观察到细菌的活量增加了1000倍。此外，在受感染小鼠的脾脏和肝脏中也发现了脑膜炎球菌，这表明肝脏可能代表脑膜炎球菌复制的目标器官。
Introduction
奈瑟氏脑膜炎是一种限于人类宿主的革兰氏阴性β-蛋白酶，众所周知，它是全世界人群中脑膜炎和败血症的最常见原因之一。它殖民健康和无症状的携带者的上呼吸道（鼻子和喉咙），但细菌有时逃避各种宿主免疫防御，从血液传播到大脑，导致不受控制的局部炎症，称为脑膜炎球菌性脑膜炎。宿主和细菌因素的组合似乎有助于从共生体向侵入性行为1的过渡。
脑膜炎是专门用于人类殖民化和感染的。它的宿主范围很窄，因此，由于缺乏复制人类脑膜炎球菌病的合适动物模型，体内发病机制研究有限。因此，在理解脑膜炎球菌引起的败血症和脑膜炎的发病机制方面，它造成了根本的差距。在过去的几十年里，许多体外系统的发展使得几个脑膜炎球菌毒性因子2，3，4的识别。尽管这些有价值的研究为了解这些因素对成功脑膜炎球菌感染的作用提供了重要见解，但这些模型不允许评估细菌与体液和细胞相互作用的后果免疫系统，甚至更少与整个组织。体内动物感染模型对于评估疫苗制剂所赋予的保护程度也有很大的意义。作为人-热带病原体，脑膜炎球菌拥有成功感染所需的适当决定因素，如表面结构（即IV型皮利蛋白和不截面蛋白）和人体受体和运输蛋白的铁吸收系统（即转移蛋白和乳铁蛋白）5，6，7适当地坚持， 生存和入侵人类宿主.最后，病原体的遗传变异能力，以逃避和/或阻止人体免疫反应，进一步促进高物种对流性8，9。因此，缺乏特定的宿主因素，参与相互作用，可以阻碍病原体生命周期的步骤，在小型动物模型的发展中遇到重大困难，从而总结脑膜炎球菌的生命周期。
在过去的几十年中，已经开发出几种方法来增进我们对脑膜炎球菌感染周期的了解。两种动物模型，小鼠和大鼠的感染，无论是腹内（即）或内陆（即），被开发繁殖脑膜炎球菌病10，11，12，13，14 ，15，16，17.实验鼠可能是诱导实验性脑膜炎球菌感染的更通用的动物之一。
然而，i.p. 感染方式导致严重败血症的发展，虽然它不模仿感染的自然途径，而i.n. 感染途径是有用的评估脑膜炎球菌发病机制，即使它可能导致肺部感染在败血症10，11，12，13，14，15，16，17之前。
i.p. 小鼠模型有助于评估对脑膜炎球菌挑战10、11、12的保护。基于i.n.感染途径的脑膜炎球菌殖民化小鼠模型已经开发给幼鼠，因为它们更容易感染脑膜炎球菌，以繁殖模仿人类脑膜炎球菌病的侵入性感染13，14，15，16，17。此外，为了促进脑膜炎球菌在鼠宿主的复制，越来越多的技术策略也被应用，包括给动物施用铁，以改善感染，使用高细菌接种，通过小鼠的细菌菌株，以及雇用婴儿或免疫功能低下的动物宿主10，13，15，18，19。表达特定的人为因素，如CD4620或转移性药物21增加了小鼠对这种人-热带细菌的易感性;人类皮肤异种移植模型的感染也有助于评估脑膜炎球菌对人内皮的粘附能力22，23。总体而言，人化转基因小鼠的最近发展提高了对脑膜炎球菌发病机制及其宿主相互作用的理解。
此前，我们开发了脑膜炎球菌性脑膜炎的鼠模型，其中细菌的接种被执行到成年小鼠的水箱中，这些老鼠带有老鼠通过的细菌24。受感染小鼠的临床参数和存活率表明，脑膜炎的建立具有与人类宿主相似的特点，以及大脑的微生物学和组织学分析。从这些受感染的小鼠中，细菌也从血液、肝脏和脾脏中恢复，而周围器官的细菌负荷也与传染性剂量相关。特别是，该模型用于评估在L-谷氨酸运输机GltT24中有缺陷的异源突变菌株的毒性。最近，使用我们的小鼠模型脑膜炎球菌性脑膜炎基于i.cist。血清组 C 菌株 93/42862，24和异体突变缺陷在cssA基因编码为 UDP-N-乙酰葡萄糖胺 2-表皮酶25，我们分析了暴露的西沙酸在建立中的作用在老鼠的疾病。
在本协议中，我们描述了一种基于i.cist诱导实验性脑膜炎球菌性脑膜炎的直截了当的方法。巴尔布/c成年小鼠的感染途径。该方法对于鼠类宿主脑膜炎球菌感染的表征，以及野生型参考菌株和异种突变体之间的毒性评估特别有用。水池内感染途径确保将脑膜炎直接输送到凝乳中，从而促进脑脊液 （CSF） 中的细菌复制，并诱导脑膜炎具有模仿这些特征存在于人类2，24，25，26。
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Protocol
根据欧洲共同体理事会1986年11月24日指令（86/609/EEC），执行这项议定书是为了尽量减少动物痛苦和减少小鼠数量。本研究中报告的体内实验得到了伦理动物护理和使用委员会（2012年12月14日第2号）和意大利卫生部（Prot. 编号 0000094-A-03/01/2013）的批准。所有程序应在 BSL2 房间的生物安全机柜 2 （BSC2） 内执行，潜在受感染的废物应放在专用容器中。
1. 小鼠感染N. 脑膜炎血清群 C 应变
注意：N. 脑膜炎可能是一种有害的病原体，在处理此微生物时必须采取一切必要的预防措施。整个实验需要生物安全 2 级 （BSL2） 遏制。参与动物研究的研究人员应在实验期间佩戴一次性个人防护设备（PPE）。
- 培养用于体内感染研究的细菌
- 从GC（Gonococcal）琼脂板上的新鲜奈瑟里亚脑膜炎菌培养中挑选一个菌落，辅以1%（vol/vol）多维毒补充剂，并在10 mL GC汤中接种。
- 以220rpm的速度在轨道摇床孵化器中以37°C生长细菌。使用分光光度计继续检查区域性的 O.D.以光学密度 OD600nm 0.7，对应于 ± 7 x 108 CFU/mL，将培养成早期指数相。
- 一旦获得所需的O.D.，通过添加10%甘油来冷冻库存。在冷冻中分配1 mL的文化。将小瓶储存在-80°C，直到使用。
注：虽然最好使用新鲜的细菌培养物，但冷冻储存被用来简化和规范体内实验。通常，冷冻库存在准备后大约6个月内就已使用。 - 感染前，在室温下解冻冷冻细菌。
- 在1，500 x g下通过离心15分钟收获细菌细胞，并在含有铁的GC汤（5mg/kg）的1mL中重新悬浮。
注：GC肉汤是准备与添加铁dextran （5毫克/千克），以利于在宿主组织14，18，27的美宁球菌的复制. - 在使用之前，执行可行的细菌计数，以确定感染的CFU的确切数量。为此，拿起10μL的细菌悬浮液，进行连续稀释，并在GC琼脂板上分散每次稀释，并在37°C与5%CO2一起孵育，18-24小时。
- 小鼠的蓄水内注射
注意：整个过程在层流柜中执行，以保持无菌条件。- 家庭实验鼠（8周大，雌性Balb/c）在特定无病原体条件下。提供食物颗粒和水。
- 在开始实验之前，在新环境中将动物安置1周。
- 在开始实验之前，称量并评估他们的体温。
注：八周大的近亲繁殖的Balb/c雌性小鼠平均重约19克。实验鼠生理温度在36-38°C24之间。 - 用70%乙醇清洁腹部区域，用25G针0.5毫米x16毫米注射，在小鼠腹部右下象限（溶解在1%磷酸盐盐碱缓冲液中，250mg/kg）中。，感染前约2-3小时。
注：腹腔内注射在小鼠腹部右下象限进行，以避免损害腹部器官，如膀胱、胆囊等。外源铁源的分给，以铁多伦的形式，对动物在感染前有利于宿主14、18、27的细菌增殖。 - 2-3小时后，使用氯胺酮（50毫克/千克）和木拉津（3毫克/千克）和眼科润滑剂进行动物麻醉。
- 检查麻醉的深度，确保捏脚趾时无疼痛反应。
- 将小鼠置于胸腔内，并小心地伸展四肢和颈椎，以保持椎柱处于直线位置。
- 在装载 30 G 针 x 8 mm 的注射器之前，轻轻混合细菌悬架以保持一致的悬浮液。
注：尽可能接近注射时间，准备细菌悬浮液;同时，在室温下存放。 - 根据解冻后的细菌定子（CFU/mL），根据被感染动物的总数（每只动物的CFU细菌剂量）计算要使用的CFU总数。继续计算从小瓶中取取的确切体积，以获得在解冻后细菌定子 （CFU/mL） 与用于 n 小鼠感染的总 CFU（解冻后细菌定子 CFU）之间的总 CFU 应用比例：毫升= 总 CFU ： x）. 建立与被感染动物总数有关的最终体积。
注：在这些实验中，使用了从每只动物104到109的广泛端口。 - 用70%乙醇清洁手术区域。
- 在针头的帮助下识别注射点，并将已建立的CFU的meningococci（野生型菌株和异体突变菌株），或GC肉汤辅以铁dextran（5mg/kg）作为对照，总体积为10μL到小鼠的蓄水池使用 30 G 针 x 8 mm 穿过一个孔径。
- 通过将针头放在颅骨结处，特别是在背椎下膜空间，执行水池接种。文特罗弗的头，使这个空间访问28。
- 简单地说，将动物置于横向回旋状态，将耳朵挡在外，并适度弯曲颈部（90 至 100°）。确保颈部和头部的中线（从鼻子到表位）与桌面完全平行。
- 触摸阿特拉斯机翼并确保它们重叠，消除轴向旋转。自然缩进通常可以触及中间线，其中针最有可能进入眼孔。
- 注射带有奈瑟利亚的小鼠后，安全地丢弃注射器和针头。
- 将动物放在笼子里，等待运动的觉醒和完全恢复。
- 将受感染小鼠的笼子放在层流柜下。
- 监测小鼠，感染后24小时，根据昏迷量表29的临床昏迷迹象。昏迷量： 1 = 昏迷， 2 = 打开后不直立， 3 = 直立在 30 秒内， 4 = 直立在 5 秒内， 最小流动活动， 5 = 正常.
注：当动物被记录疼痛时，使用梅洛西卡姆（5毫克/千克，研究期间）的肛门炎被施用。 - 继续动物生存或CFU计数测定受感染的动物，详见步骤2。
- 对颈椎脱位得分为2的小鼠实施安乐死，并记录为死亡，进行统计分析。
2. 动物生存和CFU计数
-
动物生存
- 以不同剂量（每只小鼠104至109 CFU）制备细菌接种，通过i.cist感染动物。路由（请参阅步骤 1.2）。
- 用GC汤接种控制小鼠，以同样的方式补充铁丁丁（5毫克/千克）。
- 监测动物的临床症状：毛毛皱褶，驼背外观，体温过低，体重减轻，嗜睡，或垂死24，25，26，30，每天在整个实验168小时（7天）在实验期间每天至少两次。
- 每天分别使用数字天平和直肠温度计测量体重和温度。
- 记录小鼠一周的生存情况。
注：记录动物感染后的自然死亡，而达到昏迷值2或存活超过168小时的观察的动物将被安乐死。 - 用氯胺酮（50毫克/千克）和木兰素（3毫克/千克）麻醉昏迷值为2或生存在观察时间内的小鼠，并涂抹眼膏。
- 检查脚趾捏是否缺乏疼痛反应。
- 通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死，并记录为死亡，以进行统计分析。
-
外围器官菌群形成单元（CFU）计数的评估
- 根据动物生存结果使用亚致命细菌剂量（5 x 105CFU/小鼠），通过 i.cist 给动物接种疫苗。路线（见第1.2节）。
- 在感染期间每天监测直肠温度，并在感染后48小时对动物进行麻醉，如步骤2所述。
- 继续胸部70%乙醇消毒，使用25G针0.5毫米x16毫米，通过胸腔心脏穿刺提取600-700μL的血液。
- 将血液收集在含有3.8%柠酸钠的管中，并储存在-80°C，用于以后可行的细菌细胞计数。
- 进行宫颈脱位，以牺牲动物。根据所有相关的体制和道德准则牺牲小鼠后，确认死亡记录无心跳。
- 将鼠标放在上摆位置，并使用剪刀和钳子沿着身体的下垂平面继续切割毛皮。用针钉将毛皮固定在身体两侧。
- 用锋利的剪刀切断围膜。使用剪刀和一次性钳子切除器官（如脾脏和肝脏），并将每个器官放入无菌培养皿中，并加1mL的GC汤，辅以10%（vol/vol）甘油。
- 根据 IACUC 准则安全地处置鼠标主体。
- 在室温下用5mL注射器的柱塞机械地将器官均匀化约2-3分钟，直到形成单细胞悬浮液并将其转移到管中。
- 将管与均质组织样本立即放在干冰上。
注：样品可在-80°C下储存在2 mL无菌管中，以便稍后进行可行的细菌细胞计数评估。 - 必要时用抗生素制作GC琼脂板。在37°C前将板干燥2-3小时。
- 从每个均质组织和板中制备 GC 汤中样品的 10 倍连续稀释到 GC 琼脂板上。在37°C下孵育过夜，CO2为5%。
3. 为CFU计数准备脑组织
- 根据动物生存结果使用亚致命细菌剂量（5 x 105 CFU/小鼠），通过 i.cist 给动物接种疫苗。路线（见第1.2节）。
- 如步骤2所述，在既定的感染时间对动物进行麻醉。
- 通过宫颈脱位对动物实施安乐死。
- 用70%乙醇清洁手术区域。
- 用一把大剪刀砍掉老鼠的头。
- 在小手术剪刀和细尖钢钳的帮助下，重新切除毛皮和皮肤，朝头骨顶部前进，以便清楚地看到缝合线并引导颅骨的开口。
- 插入一个小剪刀的尖端，通过前臂臂，打开头骨。
- 切向颅骨的中心，穿过头骨的中线到头骨的另一侧。沿着羔羊皮缝合线的侧边轻轻切割。
- 从后角抬起颅骨，然后用细尖钳子对角向上拉，以发现大脑。
- 当头骨被抬起时，确保脑组织不附着在头部的任何骨骼上。
- 使用一次性钳子去除头骨和大脑之间的任何结缔组织，以确保脑组织与头骨一起被移除。
- 不要让脑组织过多干燥。将大脑，使用一次性钳子，在培养皿与1mL的GC汤补充10%（vol/vol）甘油。
- 使用 5 mL 注射器的柱塞以机械方式使大脑均匀化（参见步骤 2.2.9）。将样品转移到2 mL无菌管中，并储存-80°C，以进行步骤2.2中讨论的后可行细菌细胞计数评估。
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Representative Results
感染N.脑膜炎野生型和异体突变菌株的小鼠存活。
这些代表性结果中使用的奈瑟利亚脑膜炎菌株是血清群 C 参考菌株 93/4286 （ET-37） 及其同源突变体 93/4286+cssA通过插入性失活cssA基因获得，编码为UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-表皮酶，该图在胶囊合成位点25。为了评估目前鼠模型中cssA缺陷菌株的毒性程度，评估了能够确定50%受感染动物死亡（LD50）的致命剂量。为此，三组动物在切口内受到感染，剂量范围为野生型菌株93/4286的104至106 CFU，突变菌株剂量为93/4286°cssA，剂量为107至109 CFU.一般来说，临床参数（如体重和体温）的减少和死亡率的上升发生在感染后的前72小时内。野生型菌株的LD50对应于104 CFU的脑膜炎球菌挑战，而剂量为105 CFU的死亡率等于83.4%，106 CFU为100%（图1A）。相反，要获得LD50的突变菌株93/4286+cssA，它是必要的剂量108 CFU（图1B），量比野生型菌株高10，000倍。
评价小鼠脑组织中N.脑膜炎活化CFU。
为了跟踪受感染动物脑组织感染的动力学，对野生型或cssA突变菌株25进行了时间过程测定。在i.cist之后注射5x105 CFU 93/4286或93/4286+cssA菌株，脑组织野生型细菌迅速增加，在感染后24小时左右达到最高数量（图2A）;相反，在被同源性cssA-缺陷突变体挑战的小鼠大脑中，活的计数会随着时间逐渐下降，直到2.026对CFU = 1.774 72 h感染后（图2A）。实验表明，33.3%的突变受挑战小鼠表现出细菌清除从感染部位，而野生型菌株的感染从未根除从动物的大脑。
评估脾脏和肝脏48h后脑膜炎球菌负荷。
进行这项实验是为了评估受感染小鼠在周围器官挑战后48小时清除细菌的清除情况。为此，两组小鼠感染了5×105 CFU，其中93/4286或93/4286+cssA菌株，并在受感染小鼠的脾脏和肝脏中评估细菌活量（图2B）。在脑膜炎球菌注射48小时后，cssA缺陷突变体在脾脏和肝脏中完全清除，而感染野生型菌株的动物则表现出持续的全身感染框架。48小时后CFU的平均值在脾脏和肝脏中确实仍为3.212对CFU = 3.354和6.949日志CFU=1.37。两个动物组肝脏组织中细菌负荷的差异具有统计学意义（P < 0.001）。
图1：感染93/4286野生型或cssA-缺陷N.脑膜炎菌株的小鼠存活。（A） 三组 Balb/c 小鼠 （n= 6/剂量） 被感染 i.cist.与104，105，和 106 CFU/小鼠的野生类型应变 93/4286 和 （B） 与 107，108和 109 CFU/小鼠的异源cssA- 缺陷突变体.对老鼠进行了一周的监测，并记录了其存活率。结果以不同剂量的存活率百分比表示，对于感染野生型菌株的小鼠，日志排名 p 值为 < 0.05。这个数字已由科利奇奥等人25日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：评估用93/4286或93/4286+cssA菌株接种的小鼠随时间的细菌负荷。（A） 在 i.cist 之后大脑组织中细菌负荷的时间过程.感染。两组Balb/c小鼠（n = 20/组）感染了i.cist。路由与5 x 105 CFU的野生类型应变93/4286或cssA-有缺陷的突变体。动物在感染后4、24、48和72小时被牺牲。大脑被收获，在GC培养基中机械均质化，并确定了可行的计数。结果以接种后不同时间点每个器官的CFU数的平均=SD日志表示。星号表示统计显著性（*，P < 0.01）。（B） 随着时间的推移，细菌在脾脏和肝脏中负荷。两组Balb/c小鼠（n = 5/组）被感染i.cist。与5 x 105 CFU的野生类型菌株93/4286或cssA-有缺陷的突变体。动物在感染后48小时被安乐死。脾脏和肝脏被收获，机械均质，并确定了可行的计数。结果表示为每个器官的日志 CFU 编号。水平条表示细菌定子的平均日志。星号表示统计显著性（*，P < 0.001）。这个数字已由科利奇奥等人25日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了一种实验方案，通过i.cist诱导成年小鼠的脑膜炎球菌性脑膜炎。脑膜炎球菌的接种。据我们所知，在感染i.cist的实验鼠中，还没有开发出其他脑膜炎球菌性脑膜炎模型。路线;过去，人们一直在探索这种方法，为大鼠31和兔子32提供脑膜炎球菌性脑膜炎的模型。众所周知，脑膜炎球菌病发病率最高的是幼儿、青少年和33岁、34岁、35岁的年轻人;因此，在我们的脑膜炎小鼠模型中，8周大的免疫能力动物被雇用，而不是关注新生儿或婴儿动物。
在我们的实验模型中，我们决定使用i.cist。接种，因为它确保释放的meningococci直接到蓄水池，从而促进细菌复制在CSF。这种接种途径在生理上更容易获得，并且比颅内下甲细胞虫途径创伤更少，由于链球菌，已经用于脑膜炎的发展。36，37.虽然它不代表脑膜炎球菌的天然感染方式，但该地区细菌的注射有助于诱发脑膜炎球菌性脑膜炎，如小鼠存活率、细菌负荷、临床参数以及组织分析24，25，26。有趣的是，参考菌株93/4286诱发脑膜炎，其组织病理学特征模仿人类疾病24、25、26观察到的特征。
为了建立一个标准化的鼠感染和保证研究人员的安全，它更可取的是从一个带头的冷冻细菌库存，而不是一个新的细菌生长24，25，30，38，此外，我们决定使用亚致命剂量的活脑膜炎球菌，目的是限制快速致命的结果，并允许脑损伤的发展2，24，25，26。然而，为了确定不同菌株的适当传染性剂量，必须进行初步实验。在本研究中，我们测试了血清群 C 参考菌株 93/4286 和同源突变菌株 93/4286+cssA，剂量为 5 x 105 CFU/小鼠。
虽然这个模型不模仿脑膜炎球菌的殖民化和入侵的初始阶段，细菌分离物不仅在CSF中生长良好，而且还能够留在脾脏和肝脏隔间中。在肾病感染的再皮病阶段，大部分血因衍生的铁仍然与肝铁蛋白结合。由于铁蛋白可用于脑膜炎球菌获得铁39，肝脏构成细菌复制的目标器官。
在这个实验过程中，近亲繁殖的Balb/c小鼠菌株用于替代最初用于开发脑膜炎球菌性脑膜炎24的杂交CD-1菌株。出养小鼠具有广泛的遗传变异性，在一个可变群体（如40，41岁）中，可能更适合揭示几种影响。然而，这种变异性需要更高的样本量才能获得足够的统计意义，并可能干扰程序和有针对性的研究的标准化。
尽管脑膜炎球菌的宿主范围很窄，但为了确保在鼠体内复制细菌，增强脑膜炎球菌的毒性，在感染6、14之前，对动物施用铁多特。最后，与其他脑膜炎实验模型相比，动物没有用任何抗生素治疗，不会影响疾病过程和/或炎症反应的概况26。
迄今为止，我们的研究已经强调了i.cist。模型是诱导脑膜炎和侵入性脑膜炎球菌病与i.p.或i.n.感染模型相比，其特点是在脑膜炎建立前出现败血症和细菌血症10，11 ，12，13，14，15，16，17。因此，这种基于鼠性宿主脑膜炎诱导的感染模型，不仅可用于评估预防细菌直接复制到CSF的创新治疗策略，而且有助于分析可能的被动免疫的疗效治疗人类病原体。
然而脑膜炎球菌感染是一个多步骤的过程，包括鼻咽殖民化，进入血液，跨越血脑屏障，最后在CSF不受控制的扩散，我们的模型只复制了某些方面脑膜炎球菌感染，为了部分地颠覆这些局限性的转基因动物模型，可能有助于模仿人类脑膜炎球菌病的发病机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
研究部分得到了PRIN 2012 [授权编号 2012WJSX8K]的支持："粘膜感染中的宿主-微生物相互作用模型：新治疗策略的开发"，以及 PRIN 2017 [2017SFBFER]："解决粘膜感染之间的相互作用的综合方法具有挑战性的病原体的适应、压力条件和抗微生物药物耐药性"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
