Summary
Здесь мы описываем метод индуцирования менингококкового менингита через инбактериальный маршрут инфекции у взрослых мышей. Мы представляем шаг за шагом протокол менингококковой инфекции от подготовки инокулума к инрасистской инфекции; затем записать выживаемость животных и оценить бактериальные нагрузки в мурин тканях.
Abstract
Neisseria meningitidis (менингококк) является микроорганизмом узкого диапазона, всемирно признанным в качестве ведущей причины бактериального менингита. Менингококк является преходящим колонизатором носоглотки человека примерно 10% здорового субъекта. В особых обстоятельствах он приобретает инвазивную способность проникать через слизистый барьер и вторгается в кровоток, вызывая септицемию. В последнем случае, фумиминиз может возникнуть даже без последующего развития менингита. И наоборот, бактерии могут плохо размножаться в кровоток, пересекать гематоэнцефалический барьер, достигать центральной нервной системы, что приводит к фуминантному менингиту. Морин модели бактериального менингита представляют собой полезный инструмент для изучения взаимодействия хозяина-патогена и анализа патогенетических механизмов, ответственных за это смертельное заболевание. Хотя за последние десятилетия было оценено несколько экспериментальных модельных систем, ни одна из них не смогла воспроизвести характерные патологические явления менингококковой инфекции. В этом экспериментальном протоколе мы описываем детальную процедуру индукции менингококкового менингита в мышиной модели, основанной на инрасистальной прививке бактерий. Специфические признаки человеческого менингита были зафиксированы в муринском хозяине путем оценки клинических параметров (например, температуры, массы тела), оценки выживаемости, микробиологического анализа и гистологического исследования черепно-мозговой травмы. При использовании intracisternal (i.cist.) инокулум, менингококки полной доставки непосредственно в цистерну magna, что приводит к очень эффективной менингококковой репликации в ткани мозга. 1000-кратное увеличение жизнеспособного количества бактерий наблюдается примерно в 18 ч. Кроме того, менингококки также находятся в селезенке и печени инфицированных мышей, предполагая, что печень может представлять собой целевой орган для менингококковой репликации.
Introduction
Neisseria meningitidis является Грам отрицательным -proteobacterium ограничивается человеческого хозяина, хорошо известный как одна из наиболее распространенных причин менингита и сепсиса в человеческой популяции во всем мире. Он колонизирует верхние дыхательные пути (нос и горло) здоровых и бессимптомных носителей (2-30% населения), но бактерия иногда уклоняется от различных иммунной защиты хозяина и распространяется из кровотока в мозг, вызывая неконтролируемый местный воспаление, известное как менингококковый менингит. Сочетание хоста и бактериальных факторов, как представляется, способствуют переходу от commensal к инвазивному поведению1.
N. meningitidis специализируется исключительно на колонизации человека и инфекции. Он имеет узкий диапазон хоста и, следовательно, имеет ограниченный в виво патогенеза исследований из-за отсутствия подходящих моделей животных, которые воспроизводят человека менингококковой инфекции. В результате этого возникли фундаментальные пробелы в понимании патогенеза септицемии и менингита, вызванного менингококком. В последние десятилетия, развитие многих систем in vitro позволило выявить несколько менингококковых факторов вирулентности2,3,4. Хотя эти ценные исследования дали важные идеи, чтобы понять роль этих факторов для успешной менингококковой инфекции, эти модели не позволили оценить последствия бактериальных взаимодействий с юмористической и клеточной иммунной системы и тем более со всей тканью. In vivo животных моделей инфекции имеют большое значение, а также для оценки степени защиты присуждается вакцины составы. Как человек-тропический патоген, менингококк обладает соответствующими детерминантами, необходимыми для успешной инфекции, такие как поверхностные структуры (т.е. iv тип pili и непрозрачные белки) и системы поглощения железа для человеческих рецепторов и транспортных белков (т.е., трансферрин и лактоферрин)5,6, 7правильно придерживаться, выжить и вторгнуться в человека хозяина. Наконец, генетические способности вариации патогена, чтобы избежать и / или блокировать иммунный ответ человека далее способствовать высоким видов тропизма8,9. Поэтому отсутствие конкретных факторов, участвующих во взаимодействии, может блокировать этапы жизненного цикла возбудителя, создавая значительные трудности в развитии моделей мелких животных, суммирующих менингококковый жизненный цикл.
За последние десятилетия было разработано несколько подходов для улучшения нашего понимания менингококкового инфекционного цикла. Инфекции двух животных модели, мыши и крысы, либо интраперитонеально (т.п.) или интраназалически (т.н.), были разработаны для воспроизведения менингококковой инфекции10,11,12,13,14 ,15,16,17. Лабораторная мышь, вероятно, является одним из наиболее универсальных животных для индуцирования экспериментальной менингококковой инфекции.
Тем не менее, i.p. способ инфекции приводит к развитию тяжелого сепсиса, хотя он не имитирует естественный маршрут инфекции, в то время как i.n. маршрут инфекции был полезен для оценки менингококкового патогенеза, хотя это может вызвать легочную инфекцию до сепсиса10,11,12,13,14,15,16,17.
Модель мыши i.p. сыграла важную роль для оценки защиты от менингококковой задачи10,11,12. Мышь модель менингококковой колонизации на основе i.n. маршрут инфекции была разработана с младенцем мышей, так как они более восприимчивы к менингококки, чтобы воспроизвести инвазивную инфекцию, имитирующую ход менингококковой инфекции у людей 13,14,15,16,17. Кроме того, для содействия менингококковой репликации в мурин хост, все большее число технических стратегий были также применены в том числе введение железа для животных для улучшения инфекции, использование высокобактериального инокулума, мышь проходимых бактериальногоштамма,а также занятости младенцев или иммунокомпромиссных животных хостов10,13,15,18,19. Выражение специфических человеческих факторов, таких как CD4620 или трансферрин21, повысило восприимчивость мышей к этой антропо-тропической бактерии; занятости кожи человека ксенотрансплантат амодель инфекции также было полезно для оценки способности сагения менингококков к человеческому эндотелию22,23. В совокупности недавнее развитие гуманизированных трансгенных мышей улучшило понимание менингококкового патогенеза и его взаимодействий с хозяином.
Ранее мы разработали модель менингококкового менингита, где прививка бактерий была выполнена в цистерну magna взрослых мышей с мышью проходных бактерий24. Клинические параметры и выживаемость инфицированных мышей продемонстрировали установление менингита с характеристиками, сравнимыми с характеристиками, наблюдаемыми у хозяина человека, а также микробиологическим и гистологическим анализом мозга. Из этих инфицированных мышей, бактерии были, также, извлечены из крови, печени и селезенки, и бактериальные нагрузки из периферических органов коррелирует с инфекционной дозы. В частности, эта модель была использована для оценки вирулентности изогенного штамма мутантов, дефектных в L-глютамате транспортер GltT24. Недавно, используя нашу мышь модель менингококкового менингита на основе i.cist. маршрут с штаммом серогруппы С 93/42862,24 и изогенным мутантом, дефектным в гене csSA, кодирующем для UDP-N-ацетилглукосазамин 2-эпимемараза25, мы проанализировали роль подвергаются сиалевой кислоты в учреждении болезней у мышей.
В этом протоколе мы описываем простой метод индуцирования экспериментального менингококкового менингита на основе i.cist. маршрут инфекции у взрослых мышей Balb/c. Этот метод особенно полезен для характеристики менингококковой инфекции у муринхообразного хозяина, а также для оценки вирулентности между штаммами дикого типа и изогенными мутантами. Внутрицистеральный маршрут инфекции обеспечивает полную доставку менингококков непосредственно в цистерну магна, которая, в свою очередь, облегчает бактериальную репликацию в спинномозговой жидкости (CSF) и индуцирует менингит с функциями, которые имитируют те присутствует у людей2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был проведен для минимизации страданий животных и сокращения числа мышей в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC). Эксперименты In vivo, о которых сообщается в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этическому уходу и использованию животных (Prot. 2, 14 декабря 2012 г.) и Министерством здравоохранения Италии (Prot. number 0000094-A-03/01/2013). Все процедуры должны выполняться в кабинете биобезопасности 2 (BSC2) в помещении BSL2, а потенциальные зараженные отходы должны быть утилизированы в специальных контейнерах.
1. Инфекция мышей с N. meningitidis Серогрупп C Штамм
ВНИМАНИЕ: N. meningitidis потенциально является вредным патогеном, и при обращении с этим микроорганизмом необходимо принять все необходимые меры предосторожности. Вся экспериментация требует сдерживания уровня биобезопасности 2 (BSL2). Исследователь, участвующий в исследованиях на животных, должен носить одноразовые средства индивидуальной защиты (СИЗ) в течение всего эксперимента.
- Подготовка бактерий для исследований инфекции in vivo
- Выберите одну колонию из свежей культуры Neisseria meningitidis на GC (Gonococcal) агарпластинке, дополненной 1% (vol/vol) Дополнением поливитокса и привить в 10 мл бульона GC.
- Выращивайте бактерии при 37 градусах По Цельсия в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью 220 об/мин. Продолжайте проверять О.Д. культуры с помощью спектрофотометра. Выращивайте культуру до ранней экспоненциальной фазы с оптической плотностьюOD 600nm 0,7, что соответствует 7 х 108 CFU/mL.
- После получения необходимой О.Д., сделать замороженные запасы, добавив 10% глицерола. Распределить 1 мл культуры в криовиала. Храните флаконы при -80 градусах по Цельсию до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя лучше использовать свежую бактериальную культуру, замороженные запасы были использованы для упрощения и стандартизации эксперимента in vivo. Обычно замороженные запасы были использованы в течение примерно 6 месяцев с момента подготовки. - Перед инфекцией разморозить замороженные бактерии при комнатной температуре.
- Урожай бактериальных клеток путем центрифугации в течение 15 мин при 1500 х г и повторно в 1 мл свежего бульона GC, содержащего железо dextran (5 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Бульон GC готовится с добавлением железа dextran (5 мг/кг) в пользу репликации менингококков в ткани хозяина14,18,27. - Перед использованием, выполнять жизнеспособные количества бактерий, чтобы определить точное количество CFU для инфекции. Для этого подберите 10 кЛ бактериальной суспензии и приступайте к серийным разбавлениям и распространяйте каждое разбавление на агарные пластины GC и инкубируете при 37 градусах Цельсия с 5% CO2,для 18-24 ч.
- Внутрицистеральная инъекция мышей
Примечание:Вся процедура выполняется в ламинарном шкафу для поддержания асептических состояний.- Дом лабораторных мышей (8 недель, самка Balb/c) при специфических условиях свободного патогена. Предоставьте пищевые гранулы и воду объявление libitum.
- Поселить животных в новой среде в течение 1 недели до начала эксперимента.
- Перед началом эксперимента взвесьте и оцените температуру тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инбреты Balb/c самок мышей восьминедельного возраста весят в среднем около 19 г. Средняя температура лабораторных мышей физиологически колеблется от 36-38 градусов по Цельсию24. - Скрэпт животных с шеи, очистить область живота с 70% этанола и вводить i.p. железо dextran (растворенный в 1% фосфатно-соленовый буфер, 250 мг/кг) в правом нижнем правом квадранте брюшной полости с помощью 25 G иглы 0,5 мм х 16 мм , примерно за 2-3 ч до заражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интраперитонеальная инъекция была проведена в правом нижнем квадранте брюшной полости, чтобы избежать повреждения органов брюшной полости, таких как мочевой пузырь, cecum и т.д. Администрация экзогенного источника железа, в виде железа dextran, для животных до инфекции способствует бактериального размножения в принимающей14,18,27. - После 2-3 ч выполните анестезию животных с кетамином (50 мг/кг) и ксилазином (3 мг/кг) и офтальмологическим смазкой.
- Проверьте глубину анестезии, обеспечивая отсутствие боли ответ при щипать нос.
- Расположите мышь в стернальной декубит и тщательно растянуть конечностей и шейного отдела позвоночника, чтобы держать позвоночный столб в прямом положении.
- Аккуратно смешайте бактериальную подвеску для поддержания последовательной подвески перед загрузкой шприца 30 G иглы x 8 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте бактериальную суспензию как можно ближе к времени инъекции; между тем, хранить его при комнатной температуре. - На основе пост оттаивания бактериального титра (CFU/mL), приступить к расчету общего CFU, которые будут использоваться, в отношении общего числа животных, которые будут инфицированы (CFU бактериальной дозы на количество животных). Продолжить расчет точного объема, который будет взят из флакона, чтобы получить общий CFU применения пропорции между пост оттаивания бактериального титра (CFU/mL) и общей CFU полезно для инфекции n мышей (после оттаивания бактериального титра CFU : ml итог CFU : x). Установить окончательный объем в отношении общего числа животных, которые будут инфицированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этих экспериментах был использован широкий спектр титра от 104 до 109 на одно животное. - Очистите хирургическую область с 70% этанола.
- Определите точку инъекции с помощью иглы и введите установленный CFU менингококков (дикий тип штамма и изогенного штамма мутантов), или GC бульон, дополненный железом dextran (5 мг/кг) в качестве контроля, в общем объеме 10 ЗЛ в цистерну magna мышей через затылочной заусенец отверстие с помощью 30 G иглы х 8 мм.
- Выполните цистернальное инокулум, поместив иглу на черепно-мозговом стыке, в частности, в субарахноидальном пространстве. Ventroflex голову, чтобы сделать это пространство доступным28.
- Кратко, поместите животное в боковой recumbency, держать уши в сторону и сгибать шею умеренно (90 до 100 " Убедитесь, что средняя линия шеи и головы (от носа до occiput) находятся в идеально параллельном положении с столешницы.
- Прикоснитесь к крыльям атласа и убедитесь, что они перекрываются, устраняя осевое вращение. Естественный отступ обычно может быть затронут на средней линии, где игла, скорее всего, войти в затылочной дыры.
- Отбросьте шприц и иглу безопасно после инъекции мышей с Neisseria.
- Поместите животное в клетку и ждите пробуждения и полного восстановления движения.
- Держите клетки с инфицированными мышами под ламинарным шкафом потока.
- Мониторинг мышей, 24 ч после инфекции, для клинических признаков комы в соответствии с комой шкалы29. Кома масштаб: 1 кома, 2 " не выдерживает вертикально после того, как включен на спине, 3 " стоит вертикально в течение 30 с, 4 " стоит вертикально в течение 5 с, минимальные амбулаторные мероприятия, 5 " нормально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда у животных была зафиксирована боль, вводилась анальгезия с мелоксикамом (5 мг/кг т.п. на протяжении всего исследования). - Продолжить для выживания животных или CFU рассчитывает на инфицированных животных, как подробно в шаге 2.
- Выполните эвтаназию мышей со счетом 2 по вывиху шейки матки и запись, как мертвые для статистического анализа.
2. Выживание животных и CFU графов
-
Выживание животных
- Подготовка бактериальной инокула в различных дозах (от 104 до 109 CFU на мышь), чтобы заразить животных i.cist. маршрут (см. шаг 1.2).
- Прививать контроль мышей с бульоном GC, дополненный железом dextran (5 мг/кг), таким же образом.
- Мониторинг животных для клинических симптомов: взъерошенный мех, сгорбленный внешний вид, переохлаждение, потеря веса, вялость, или умирающий24,25,26,30, каждый день в течение всего эксперимента на 168 ч (7 дней) не реже двух раз в день в течение всего эксперимента.
- Измерьте вес и температуру тела с помощью цифрового баланса и ректального термометра, соответственно каждый день.
- Запишите выживание мышей в течение недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись естественной смерти животных после инфекции в то время как животные, которые достигают комы значение 2 или которые выживают более 168 ч наблюдения будут усыплены. - Анестезия мышей с кома значение 2 или которые выживают в течение времени наблюдения с кетамина (50 мг/кг) и ксилазин (3 мг/кг) и применять офтальмологическую мазь.
- Убедитесь, что боль ответ отсутствует на носу щепотку.
- Выполните эвтаназию мышей путем вывиха шейки матки и записывать как мертвых для статистического анализа.
-
Оценка количества формирующихся колоний (CFU) в периферических органах
- Используйте субсмертельную бактериальную дозу (5 x 105CFU/мышей) на основе результатов выживания животных для привить животных i.cist. маршрут (см. подраздел 1.2).
- Мониторинг ректальной температуры каждый день во время инфекции и выполнять анестезию животных на 48 ч после инфекции, как упоминалось в шаге 2.
- Продолжить 70% этанола дезинфекции грудной клетки и снять 600-700 л крови путем сердечного прокола грудной полости с помощью 25 G иглы 0,5 мм х 16 мм.
- Соберите кровь в трубке, содержащей 3,8% цитрат натрия и хранить на -80 градусов по Цельсию для более поздних жизнеспособных бактериальных клеток.
- Выполните вывих шейки матки, чтобы принести в жертву животных. Подтвердите смерть записи отсутствие сердцебиения, после жертву мыши в соответствии со всеми соответствующими институциональными и этическими руководящими принципами.
- Положите мышь в положение на спине и использовать ножницы и щипцы, чтобы продолжить с разрезом меха вдоль сагитальной плоскости тела. Закрепите кожу мехом по бокам тела булавками.
- Отрежьте перитонеальную мембрану острыми ножницами. Используйте ножницы и одноразовые щипцы для акцизного органов (например, селезенки и печени) и положить каждый из них в стерильные Петри блюдо с 1 мл бульона GC дополняется 10% (vol/vol) глицерол.
- Безопасно распоряжаться телом мыши в рамках руководящих принципов IACUC.
- Гомогенизировать органы механически при комнатной температуре с поршенем шприца 5 мл в течение 2-3 мин до тех пор, пока одноклеточная подвеска не образуется и не переведет ее в трубку.
- Положите трубку с гомогенизированным образцом ткани сразу на сухой лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию в стерильной трубке 2 мл для выполнения жизнеспособной оценки количества бактериальных клеток в более поздних точках. - Сделать GC агар пластины с антибиотиками, когда это необходимо. Высушите пластины перед использованием предварительного инкубации при 37 градусах по Цельсию в течение 2-3 ч.
- Приготовьте 10-кратное серийное разбавление образцов в бульоне GC из каждой гомогенизированной ткани и пластины на пластины гК-агара. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
3. Подготовка тканей мозга для CFU Граф
- Используйте субсмертельную бактериальную дозу (5 x 105 CFU/мышей) на основе результатов выживания животных для привить животных i.cist. маршрут (см. подраздел 1.2).
- Выполните анестезию животных в установленное время заражения, как указано в шаге 2.
- Выполните эвтаназию животных путем вывиха шейки матки.
- Очистите хирургическую область с 70% этанола.
- Отрежьте голову мыши с помощью больших ножниц.
- Рассекать мех и кожу с помощью небольших хирургических ножниц и тонкой наконечником стальные щипцы, переходя к верхней части черепа, чтобы иметь возможность четко видеть швы и направлять открытие черепа.
- Вставьте кончик крошечных ножниц через foramen magnum, чтобы открыть череп.
- Вырезать к центру черепа и через средней линии теменной кости на противоположную сторону черепа. Аккуратно разрежьте вдоль бокового края шва лямбдоида.
- Поднимите череп, начиная с заднего теменной углу и потяните его по диагонали вверх, чтобы обнаружить мозг, используя штраф наконечником щипц.
- Убедитесь, что ткань мозга не прикреплена ни к одной кости головы, когда череп поднимается.
- Используйте одноразовые щипцвы, чтобы удалить любые соединительные ткани между черепом и мозгом, чтобы гарантировать, что ткань мозга удаляется вместе с черепом.
- Не позволяйте ткани мозга высохнуть слишком много. Поместите мозг, используя одноразовые щипцвые пущи, в чашку Петри с 1 мл бульона GC дополнен 10% (vol/vol) глицерол.
- Гомогенизировать мозг механически с поршенем шприца 5 мл (см. шаг 2.2.9). Перенесите образцы в стерильную трубку 2 мл и храните -80 градусов по Цельсию для более поздней жизнеспособной бактериальной оценки клеток, как это обсуждалось в шаге 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выживание мышей, инфицированных N. meningitidis дикого типа и изогенных штаммов мутантов.
Штаммы Neisseria meningitidis, используемые в этих репрезентативных результатах, являются штаммом серогруппы C 93/4286 (ET-37) и его изогенным мутантом 93/4286cssA, полученным путем вставки инактивации гена CSSA, кодируя для UDP-N-ацетилглукосамин 2-эпимараза, что карты в капсуле синтез локуса25. Для оценки степени вирулентности cssA-дефективногоштамма в нынешней модели мурина была оценена смертельная доза, способная определить смерть 50% инфицированных животных (LD50). С этой целью три группы животных были инфицированы интрацистернатом с дозами от 104 до 106 CFU штамма дикого типа 93/4286 и с дозами штамма мутантов 93/4286cssA между 107 до 109 CFU . Как правило, снижение клинических параметров (например, масса тела и температура) и увеличение смертности произошло в течение первых 72 ч после заражения. LD50 для штамма дикого типа соответствовал менингококковой проблеме 104 CFU, в то время как коэффициент смертности с дозой 105 CFU был равен 83,4% и с 106 CFU 100%(рисунок 1A). И наоборот, чтобы получить LD50 для штамма мутантов 93/4286cssA, было необходимо дозу 108 CFU (Рисунок 1B), количество 10000 складок выше по сравнению с диким штаммом типа.
Оценка N. meningitidis жизнеспособного CFU в тканях мозга мыши.
Чтобы следовать кинетике инфекции в тканях мозга инфицированных животных, время курс анализ был выполнен с диким типом или cssA мутант штамм25. После i.cist. инъекции с 5x105 CFU 93/4286 или 93/4286"cssA штаммов, было быстрое увеличение дикого типа бактерий в ткани мозга достижения самых высоких чисел на уровне около 24 ч после инфекции (Рисунок 2A); наоборот, в мозгу мышей оспаривается с изогенной cssA-дефектныймутант, жизнеспособные рассчитывает упал постепенно с течением времени до 2,026 журнала CFU 1,774 72 ч после инфекции (Рисунок 2A). Эксперимент показал, что 33,3% мутантов бросили вызов мышам показали бактериальный зазор с места инфекции, в то время как инфекция с диким штаммом типа никогда не была искоренена из мозга животных.
Оценка менингококковой нагрузки в селезенке и печени 48h после вызова.
Этот эксперимент был проведен для оценки очистки бактерий от инфицированных мышей 48 h после вызова в периферических органах. С этой целью, две группы мышей были инфицированы 5 х 105 CFU либо 93/4286 или 93/4286"CSSA штаммов, и бактериальные жизнеспособные кол-во были оценены в селезенке и печени инфицированных мышей25 (Рисунок 2B). После 48 ч от менингококковой инъекции, cssA-дефектныймутант был полностью очищен в селезенке и печени, в то время как животные, инфицированные диким штаммом типа выставлены стойкие системные рамки инфекции. Средние значения CFU после 48 ч были действительно еще 3,212 журнала CFU 3,354 и 6,949 журнала CFU 1,37 в селезенке и печени, соответственно. Разница в бактериальных нагрузках в тканях печени двух групп животных была статистически значимой (с P qlt; 0.001).
Рисунок 1: Выживание мышей, инфицированных 93/4286 дикого типа или cssA-дефектных штаммов N. meningitidis. (A) Три группы балб / с мышей (n' 6/дозы) были инфицированы i.cist. с 104, 105, и 106 CFU / мышь дикого типа штамма 93/4286 и (B) с 107, 108, и 109 CFU / мышь изогенных cssA-дефектный мутант. Мыши наблюдались в течение недели, и выживание было записано. Результаты выражаются как процент выживания в различных дозах с течением времени, ранг журнала р значение было lt; 0,05 для мышей, инфицированных диким штаммом типа. Эта цифра была изменена от Colicchio и др.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка бактериальных нагрузок с течением времени у мышей, привитых с штаммами 93/4286 или 93/4286. (A) Время курс бактериальных нагрузок в тканях мозга после i.cist. Инфекции. Две группы мышей Balb/c (n no 20/group) были инфицированы i.cist. маршрут с 5 х 105 CFU либо дикий штамм типа 93/4286 или cssA-дефектныймутант. После заражения животных было принесено в жертву 4, 24, 48 и 72 ч. Мозги были собраны, механически гомогенизированы в СРЕДе GC, и жизнеспособные подсчеты были определены. Результаты выражаются в виде среднего журнала CFU на один орган в разное время после прививки. Звездочки указывают на статистическую значимость (яп. (B) Бактериальные нагрузки с течением времени в селезенке и печени. Две группы мышей Balb/c (n no 5/group) были инфицированы i.cist. с 5 х 105 CFU либо дикий штамм типа 93/4286 или cssA-дефектныймутант. После заражения животных усыпили 48 ч. Селезенки и печень были собраны, механически однородны, и жизнеспособные количества были определены. Результаты выражены как номера CFU журнала в орган. Горизонтальные бары указывают на средние журналы бактериальных титров. Звездочки указывают на статистическую значимость (з, П.л.; 0,001). Эта цифра была изменена от Colicchio и др.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описываем экспериментальный протокол, чтобы вызвать менингококковый менингит у взрослых мышей i.cist. прививка менингококковых бактерий. Насколько нам известно, никакая другая модель менингококкового менингита не была разработана у лабораторных мышей, инфицированных i.cist. маршрут; в прошлом, этот путь был изучен, чтобы обеспечить модели менингококкового менингита в крысы31 икролика 32. Хорошо известно, что самый высокий уровень менингококковой инфекции встречается среди маленьких детей, подростков и молодых людей33,34,35; по этой причине, в нашей модели мыши менингита, вместо того, чтобы сосредоточиться на неонатальных или детских животных, 8 недельных иммунокомпетентных животных были использованы.
В нашей экспериментальной модели мы решили использовать i.cist. inoculum, как это обеспечивает освобождение менингококки непосредственно в цистерну magna так способствует бактериальной репликации в CSF. Этот маршрут прививки физиологически более доступен28 и менее травматичен, чем внутричерепный субарахноидальный маршрут, уже используемый для развития менингита из-за стрептококкового сппа. 36,37. Хотя это не представляет собой естественный способ заражения менингококка, инъекции бактерий в этой области сыгралважную для индукции менингококкового менингита, как показано на выживание мыши, бактерии нагрузки, клинические параметры, а также гистологический анализ24,25,26. Интересно, что эталонный штамм 93/4286 индуцированного менингита с гистопатологическими особенностями, имитирующимите,которые наблюдаются при болезни человека24,25,26.
Чтобы установить стандартизированную инфекцию мурин и гарантировать безопасность исследователей, было предпочтительно начать с титрованного замороженных запасов бактерий, а не свежий рост бактерий24,25,30, 38, кроме того, мы решили использовать субсмертельную дозу живого менингококка с целью ограничить быстрый смертельный исход и разрешить развитие повреждения мозга2,24,25,26. Тем не менее, чтобы определить соответствующую инфекционную дозу для различных штаммов, необходимо провести предварительные эксперименты. В настоящем исследовании мы протестировали штамм серогруппы С 93/4286 и изогенный штамм мутантов 93/4286-cssA с дозой 5 х 105 CFU/ мышей.
Хотя эта модель не имитирует начальные фазы колонизации и вторжения менингококка, бактериальный изолят хорошо растет не только в CSF, но и способен оставаться в селезенке и печеночных отсеках. Во время гипоферремии фазы нейссерийной инфекции, большая часть гема полученных железных останков в сочетании с ферритина печени. Как ферритин может быть использован менингококки для получения железа39, печень представляет собой целевой орган для бактериальной репликации.
В этой экспериментальной процедуре, инбредный штамм мыши Balb/c был использован в замене выведенного штамма CD-1, который был первоначально использован для разработки менингококкового менингита модели24. Выведенные мыши были охарактеризованы широкой генетической изменчивостью, которая может быть более подходящей, чтобы выявить несколько эффектов в переменной когорте, таких как человеческая популяция40,41. Однако для получения достаточной статистической значимости такая изменчивость требует более высокого размера выборки и может помешать стандартизации процедур и целевых исследований.
Несмотря на узкий диапазон хозяина менингококка, чтобы обеспечить репликацию бактерий в мурин хост и повысить вирулентность менингококки, железо dextran вводили животным до инфекции6,14. Наконец, по сравнению с другими экспериментальными модели менингита, животные не лечились антибиотиками, чтобы не влиять на течение болезни и / или профиль воспалительного ответа26.
На сегодняшний день, наши исследования подчеркнули, что i.cist. модель является функциональной, чтобы вызвать как менингит и инвазивные менингококковой инфекции по сравнению с i.p. или i.n. модели инфекции, которые характеризуются возникновением сепсиса и бактериемии до установления менингита10,11 ,12,13,14,15,16,17. Таким образом, эта модель инфекции, основанная на индукции менингита у мурин хоста, может быть полезна не только для оценки инновационной терапевтической стратегии для предотвращения бактериальной репликации непосредственно в CSF, но и для анализа эффективности возможного пассивного иммунного терапии против патогенных микроорганизмов человека.
Однако менингококковая инфекция является многоступенчатым процессом, который включает в себя колонизацию носоглотки, доступ к кровотоканию, пересечение гематоэнцефалического барьера и, наконец, неконтролируемое распространение в CSF, наша модель только воспроизводит некоторые аспекты менингококковой инфекции, для того, чтобы подорвать в части этих ограничений трансгенной модели животных может быть полезным для имитации патогенеза человека менингококковой инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования были частично поддержаны PRIN 2012 «Грант номер 2012WJSX8K»: «Модели взаимодействия хозяина-микроба при слизистых инфекциях: разработка новых терапевтических стратегий» и PRIN 2017 (2017SFBFER): «Интегрированный подход к взаимодействию между адаптация, стрессовые условия и устойчивость к противомикробным препаратам сложных патогенов».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
