Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, um Meningokokken-Meningitis durch einen intrazisternalen Infektionsweg bei erwachsenen Mäusen zu induzieren. Wir präsentieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der Meningokokken-Infektion von der Vorbereitung von Inokulum bis zur intrazisternalen Infektion; dann erfassen Sie das Überleben des Tieres und bewerten Sie die bakteriellen Belastungen in murinen Geweben.
Abstract
Neisseria meningitidis (Meningokokken) ist ein Mikroorganismus mit schmaler Host-Bereich, weltweit als die Hauptursache für bakterielle Meningitis anerkannt. Meningokokken ist ein vorübergehender Kolonisator des menschlichen Nasopharynx von etwa 10% des gesunden Subjekts. Unter bestimmten Umständen erwirbt es eine invasive Fähigkeit, die Schleimhautbarriere zu durchdringen und dringt in den Blutkreislauf ein, der Septikämie verursacht. Im jüngsten Fall könnte eine fulminanende Sepsis auch ohne die daraus resultierende Entwicklung der Meningitis entstehen. Umgekehrt könnten sich Bakterien im Blut arm vermehren, die Blut-Hirn-Schranke überqueren, das zentrale Nervensystem erreichen, was zu einer fulminanten Meningitis führt. Die murinen Modelle der bakteriellen Meningitis stellen ein nützliches Werkzeug dar, um die Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen und die pathogenetischen Mechanismen zu analysieren, die für diese tödliche Krankheit verantwortlich sind. Obwohl in den letzten Jahrzehnten mehrere experimentelle Modellsysteme evaluiert wurden, war keines von ihnen in der Lage, die charakteristischen pathologischen Ereignisse der Meningokokken-Krankheit zu reproduzieren. In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Induktion von Meningokokken-Meningitis in einem Mausmodell, das auf der intrazisternalen Inokulation von Bakterien basiert. Die besonderen Anzeichen einer menschlichen Meningitis wurden im murinen Wirt durch die Beurteilung klinischer Parameter (z. B. Temperatur, Körpergewicht), die Beurteilung der Überlebensrate, die mikrobiologische Analyse und die histologische Untersuchung von Hirnverletzungen aufgezeichnet. Bei der Verwendung von intrazisternalen (i.cist.) Inokulum, Meningokokken vollständige Lieferung direkt in Cisterna magna, was zu einer sehr effizienten Meningokokken-Replikation im Gehirngewebe. Eine 1.000-fache Erhöhung der lebensfähigen Anzahl von Bakterien wird in etwa 18 h beobachtet. Darüber hinaus, Meningokokken sind auch in der Milz gefunden, und Leber von infizierten Mäusen, was darauf hindeutet, dass die Leber ein Zielorgan für Meningokokken-Replikation darstellen kann.
Introduction
Neisseria meningitidis ist ein Gram-negatives -proteobacterium, das auf den menschlichen Wirt beschränkt ist und als eine der häufigsten Ursachen für Meningitis und Sepsis in der menschlichen Bevölkerung auf der ganzen Welt bekannt ist. Es kolonisiert die oberen Atemwege (Nase und Hals) von gesunden und asymptomatischen Trägern (2-30% der Bevölkerung), aber das Bakterium entzieht sich manchmal verschiedenen Wirtsabwehren und breitet sich von der Blutbahn auf das Gehirn aus, was zu einem unkontrollierten lokalen Entzündung, bekannt als Meningokokken-Meningitis. Eine Kombination von Wirts- und Bakterienfaktoren scheint zum Übergang vom Commensal zum invasiven Verhalten beizutragen1.
N. meningitidis ist ausschließlich auf menschliche Kolonisation und Infektion spezialisiert. Es hat einen engen Wirtsbereich und hat daher begrenzte In-vivo-Pathogenese-Studien aufgrund des Mangels an geeigneten Tiermodellen, die die menschliche Meningokokken-Krankheit reproduzieren. Infolgedessen hatte es zu grundlegenden Lücken im Verständnis bezüglich der Pathogenese von Septikämie und Meningitis durch Meningokokken geführt. In den letzten Jahrzehnten ermöglichte die Entwicklung vieler In-vitro-Systeme die Identifizierung mehrerer meningokokkener Virulenzfaktoren2,3,4. Obwohl diese wertvollen Studien wichtige Erkenntnisse lieferten, um die Rolle dieser Faktoren für eine erfolgreiche Meningokokken-Infektion zu verstehen, erlaubten diese Modelle keine Bewertung der Folgen bakterieller Wechselwirkungen mit dem humoralen und zellulären Immunsystem und noch weniger mit dem gesamten Gewebe. In vivo-Tiermodelle von Infektionen sind auch für die Bewertung des Schutzgrades durch Impfstoffformulierungen von großer Bedeutung. Als human-tropischer Erreger verfügen Meningokokken über geeignete Determinanten, die für eine erfolgreiche Infektion erforderlich sind, wie z. B. Oberflächenstrukturen (d. h. Pili typ IV und Opazitätsproteine) und Eisenaufnahmesysteme für menschliche Rezeptoren und Transportproteine (d. h. Transferrin und Lactoferrin)5,6,7 richtig haften, überleben und in den menschlichen Wirt eindringen. Schließlich tragen die genetischen Variationsfähigkeiten des Erregers, um die menschliche Immunantwort zu umgehen und/oder zu blockieren, weiter zum hohen Tropismus der Spezies8,9bei. Daher kann das Fehlen spezifischer Wirtsfaktoren, die an der Wechselwirkung beteiligt sind, Schritte des Lebenszyklus des Erregers blockieren und erhebliche Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Kleintiermodellen verursachen, die den Meningokokken-Lebenszyklus zusammenfassen.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Ansätze entwickelt, um unser Verständnis des Meningokokken-Infektionszyklus zu verbessern. Infektionen von zwei Tiermodell, Maus und Ratte, entweder intraperitoneal (i.p.) oder intranasal (i.n.), wurden entwickelt, um Meningokokken-Krankheit zu reproduzieren10,11,12,13,14 ,15,16,17. Die Labormaus ist wahrscheinlich eines der vielseitigeren Tiere für die Induktion experimenteller Meningokokken-Infektionen.
Jedoch, die i.p. Art der Infektion führt zur Entwicklung einer schweren Sepsis, obwohl es nicht den natürlichen Weg der Infektion iimitiert, während der i.n. Infektionsweg war nützlich, um Meningokokken pathogenese zu bewerten, obwohl es Lungeninfektion enden kann vor Sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
Das i.p. Mausmodell war entscheidend, um den Schutz vor der meningokokken Herausforderung10,11,12zu beurteilen. Das Mausmodell der Meningokokken-Kolonisation auf der Grundlage des i.n. Infektionsweges wurde mit Säuglingsmäusen entwickelt, da sie anfälliger für Meningokokken sind, um eine invasive Infektion zu reproduzieren, die den Verlauf der Meningokokkenerkrankung beim Menschen imitiert. 13,14,15,16,17. Darüber hinaus, um die Meningokokken-Replikation im murinen Wirt zu fördern, wurden eine wachsende Anzahl von technischen Strategien auch angewendet, einschließlich der Verabreichung des Eisens an die Tiere, um die Infektion zu verbessern, die Verwendung von hochbakteriellem Inokulum, Maus-Passagen-Bakterienstamm sowie die Beschäftigung von Säuglingen oder immungeschwächten Tierwirten10,13,15,18,19. Die Expression spezifischer menschlicher Faktoren wie CD4620 oder Transferrin21 hat die Anfälligkeit von Mäusen für dieses human-tropische Bakterium erhöht; die Beschäftigung der menschlichen Haut Xenograft Modell der Infektion war auch nützlich, um die Adhäsionsfähigkeit von Meningokokken auf menschlicheen Endothel zu bewerten22,23. Insgesamt hat die jüngste Entwicklung von humanisierten transgenen Mäusen das Verständnis der Meningokokkenpathogenese und ihrer Wirtswechselwirkungen verbessert.
Zuvor haben wir ein murines Modell der meningokokken Meningitis entwickelt, bei dem die Inokulation von Bakterien in die Zisternenmagna von erwachsenen Mäusen mit mausdurchdreten Bakterien durchgeführt wurde24. Klinische Parameter und die Überlebensrate infizierter Mäuse zeigten die Etablierung einer Meningitis mit Merkmalen, die mit denen des menschlichen Wirts vergleichbar sind, sowie der mikrobiologischen und histologischen Analysen des Gehirns. Von diesen infizierten Mäusen wurden auch Bakterien aus Blut, Leber und Milz und bakteriellen Belastungen von peripheren Organen, die mit der infektiösen Dosis korrelierten, zurückgewonnen. Insbesondere wurde dieses Modell eingesetzt, um die Virulenz eines isogenen Mutantenstamms zu bewerten, der im L-Glutamat-Transporter GltT24defekt war. Kürzlich, mit unserer Maus Modell der Meningokokken-Meningitis auf i.cist basiert. Route mit Serogruppe C-Stamm 93/42862,24 und einem isogenen Mutant, der in der cssA-Gencodierung für UDP-N-Acetylglucosamin 2-Epimerase25defekt ist, haben wir die Rolle der exponierten Sialinsäure im Von Krankheit bei Mäusen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode, um experimentelle Meningokokken-Meningitis auf der Grundlage der i.cist zu induzieren. Infektionsweg bei erwachsenen Balb/c-Mäusen. Diese Methode ist besonders nützlich für die Charakterisierung von Meningokokken-Infektionen in einem murinen Wirt, sowie für die Beurteilung der Virulenz zwischen wildarten Referenzstämmen und isogenen Mutagenmutanten. Der intrazisternförmige Infektionsweg gewährleistet die vollständige Abgabe der Meningokokken direkt in die Zisterne magna, was wiederum die bakterielle Replikation in der zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) erleichtert und Meningitis mit Merkmalen induziert, die diese imitieren. vorhanden beim Menschen2,24,25,26.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG) durchgeführt, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Zahl der Mäuse zu verringern. In-vivo-Experimente, die in dieser Studie berichtet wurden, wurden vom Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. Nummer 2, 14. Dezember 2012) und dem italienischen Gesundheitsministerium (Prot. Nummer 0000094-A-03/01/2013) genehmigt. Alle Verfahren sollten innerhalb des Biosafety Cabinet 2 (BSC2) in einem BSL2-Raum durchgeführt werden, und die potenziellen infizierten Abfälle sollten in speziellen Behältern entsorgt werden.
1. Infektion von Mäusen mit N. meningitidis Serogroup C Stamm
VORSICHT: N. meningitidis ist potenziell ein schädlicher Erreger und alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen müssen beim Umgang mit diesem Mikroorganismus getroffen werden. Die gesamte Experimentierierung erfordert ein Eindämmen der Biosafety Level 2 (BSL2). Der an Tierversuchen beteiligte Forscher sollte für die Dauer des Versuchs persönliche Einwegschutzausrüstung (PSA) tragen.
- Vorbereitung von Bakterien für In-vivo-Infektionsstudien
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer frischen Neisseria meningitidis Kultur auf GC (Gonococcal) AgarPlatte ergänzt mit 1% (vol/vol) Polyvitox Ergänzung und impfen in 10 ml GC Brühe.
- Wachsen Sie die Bakterien bei 37 °C in einem Orbital-Shaker-Inkubator mit einer Geschwindigkeit von 220 Rpm. Überprüfen Sie den O.D. der Kultur weiterhin mit einem Spektralphotometer. Wachsen Sie die Kultur bis zur frühen Exponentialphase bei einer optischen Dichte OD600nm von 0,7, was 7 x 108 CFU/ml entspricht.
- Sobald das erforderliche O.D. erhalten ist, machen Sie gefrorene Vorräte, indem Sie 10% Glycerin hinzufügen. Geben Sie 1 ml der Kultur in den Kryovials. Bewahren Sie die Durchstechflaschen bei -80 °C auf, bis sie verwendet werden.
HINWEIS: Obwohl es besser ist, frische Bakterienkultur zu verwenden, wurden gefrorene Bestände verwendet, um das In-vivo-Experiment zu vereinfachen und zu standardisieren. In der Regel wurden die gefrorenen Bestände innerhalb von etwa 6 Monaten nach der Zubereitung verwendet. - Vor der Infektion, tauen gefrorene Bakterien bei Raumtemperatur.
- Die Bakterienzellen durch Zentrifugieren 15 min bei 1.500 x g ernten und in 1 ml frischer GC-Brühe mit Eisendextran (5 mg/kg) wieder aufsetzen.
HINWEIS: Die GC-Brühe wird mit der Zugabe von Eisendextran (5 mg/kg) hergestellt, um die Replikation von Meningokokken im Wirtsgewebe14,18,27zu begünstigen. - Vor der Verwendung, führen Sie lebensfähige Anzahl von Bakterien, um die genaue Anzahl der KBE für Infektionen zu bestimmen. Nehmen Sie dazu 10 l bakterielle Suspension auf und fahren Sie mit seriellen Verdünnungen fort und verteilen Sie jede Verdünnung auf GC-Agarplatten und brüten bei 37 °C mit 5%CO2für 18-24 h.
- Intrazisterne Injektion von Mäusen
notiz:Das gesamte Verfahren wird im laminaren Strömungsschrank durchgeführt, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.- Hauslabormäuse (8 Wochen alt, weiblich Balb/c) unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen. Geben Sie Lebensmittelpellets und Wasser ad libitum.
- Settle die Tiere in der neuen Umgebung für 1 Woche vor Beginn des Experiments.
- Vor Beginn des Experiments ihre Körpertemperatur wiegen und bewerten.
HINWEIS: Die inzuchtigen Balb/c-Mäuse von acht Wochen alt wiegen durchschnittlich etwa 19 g. Die durchschnittliche Temperatur von Labormäusen physiologisch reicht von 36-38 °C24. - Das Tier vom Hals absägen, den Bauchbereich mit dem 70% Ethanol reinigen und i.p. Eisendextran (gelöst in 1 % Phosphat-Saline-Puffer, 250 mg/kg) im unteren rechten Quadranten des murinen Bauches mit einer 25 G Nadel 0,5 mm x 16 mm injizieren , ca. 2-3 h vor der Infektion.
HINWEIS: Die intraperitoneale Injektion wurde im unteren rechten Quadranten des murinen Abdomens durchgeführt, um schädliche Bauchorgane wie Harnblase, Cecum usw. zu vermeiden. Die Verabreichung von exogenen Eisenquelle, in Form von Eisendextran, an Tiere vor der Infektion begünstigt die bakterielle Vermehrung im Wirt14,18,27. - Nach 2-3 h Tieranästhesie mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg) und ophthalmologischem Schmiermittel durchführen.
- Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass keine Schmerzreaktion beim Kneifen der Zehen.
- Positionieren Sie die Maus in sternalen Dekubitus und ziehen Sie vorsichtig die Gliedmaßen und die Halswirbelsäule, um die Wirbelsäule in einer geraden Position zu halten.
- Mischen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten, bevor Sie eine Spritze von 30 G Nadel x 8 mm laden.
HINWEIS: Bereiten Sie die bakterielle Suspension so nah wie möglich an die Injektionszeit; in der Zwischenzeit bei Raumtemperatur aufbewahren. - Basierend auf dem post-auftauenden bakteriellen Titer (CFU/mL), fahren Sie mit der Berechnung der gesamten zu verwendenden KBE in Bezug auf die Gesamtzahl der zu beanfallenden Tiere fort (KFU-Bakteriendosis pro Anzahl von Tieren). Fahren Sie mit der Berechnung des genauen Volumens fort, das aus der Durchstechflasche entnommen werden soll, um die gesamte KBE zu erhalten, die einen Anteil zwischen dem postauftauenden bakteriellen Titer (CFU/mL) und der gesamtkBE anwendet, die für die Infektion von n Mäusen nützlich ist (nach dem Auftauen bakterieller TITer KEU : ml = Gesamt-KBE : x). Bestimmen Sie das endgültige Volumen in Bezug auf die Gesamtzahl der zu befallenen Tiere.
HINWEIS: In diesen Experimenten wurde ein breites Spektrum an Titern von 104 bis 109 pro Tier verwendet. - Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol.
- Identifizieren Sie den Injektionspunkt mit Hilfe einer Nadel und injizieren Sie die etablierte CFU von Meningokokken (Wild-Typ-Stamm und isogener Mutant-Stamm), oder GC-Brühe mit Eisendextran (5 mg/kg) als Kontrolle, in einem Gesamtvolumen von 10 l in die Zisterne magna von Mäusen durch ein okzipitales Gratloch mit einer 30 G Nadel x 8 mm.
- Führen Sie das zisterne Inokulum durch Platzieren der Nadel an der craniocervical Kreuzung, speziell im dorsalen Subarachnoidraum. Ventroflex den Kopf, um diesen Raum zugänglich zu machen28.
- Kurz, legen Sie das Tier in seitliche Recumbency, halten Sie die Ohren aus dem Weg und beugen Sie den Hals mäßig (90 bis 100°). Stellen Sie sicher, dass die Mittellinie des Halses und des Kopfes (von der Nase bis zum Okziput) in perfekt paralleler Position zur Tischplatte ist.
- Berühren Sie die Atlasflügel und stellen Sie sicher, dass sie sich überlappen, wodurch die axiale Rotation vermieden wird. Ein natürlicher Einzug kann in der Regel an der Mittellinie berührt werden, wo die Nadel am ehesten in das okzipitale Loch eindringen kann.
- Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel sicher nach der Injektion von Mäusen mit Neisseria.
- Legen Sie das Tier in den Käfig und warten Sie auf das Erwachen und die vollständige Wiederherstellung der Bewegung.
- Bewahren Sie die Käfige mit infizierten Mäusen unter einem laminaren Strömungsschrank auf.
- Monitor Mäuse, 24 h nach der Infektion, für klinische Anzeichen von Koma nach der Komaskala29. Komaskala: 1 = Koma, 2 = steht nicht aufrecht, nachdem er auf dem Rücken eingeschaltet wurde, 3 = steht aufrecht innerhalb von 30 s, 4 = steht aufrecht innerhalb von 5 s, minimale ambulante Aktivitäten, 5 = normal.
HINWEIS: Bei Tieren wurden Schmerzen festgestellt, analgesie mit Meloxicam (5 mg/kg i.p. für die Dauer der Studie) verabreicht. - Gehen Sie für das Überleben der Tiere oder KBE zählt Assay auf die infizierten Tiere wie in Schritt 2 beschrieben.
- Führen Sie die Euthanasie von Mäusen mit einer Punktzahl von 2 durch Zervixdislokation durch und zeichnen Sie sie für statistische Analysen als tot auf.
2. Tierüberleben und KBE Zählt
-
Überleben der Tiere
- Bereiten Sie bakterielle Inocula in verschiedenen Dosen (von 104 bis 109 KBE pro Maus) vorzubereiten, um Tiere durch die i.cist zu infizieren. Route (siehe Schritt 1.2).
- Impfkurat-Kontrollmäuse mit GC-Brühe, ergänzt mit Eisendextran (5 mg/kg), auf die gleiche Weise.
- Beobachten Sie Tiere auf klinische Symptome: Rüschenfell, geknicktes Aussehen, Unterkühlung, Gewichtsverlust, Lethargie oder Moribund24,25,26,30, jeden Tag während des gesamten Experiments für 168 h (7 Tage) mindestens zweimal täglich für die Dauer des Versuchs.
- Messen Sie das Körpergewicht und die Temperatur mit einem digitalen Gleichgewicht und einem Rektalthermometer, jeweils täglich.
- Zeichnen Sie das Überleben von Mäusen für eine Woche auf.
HINWEIS: Zeichnen Sie den natürlichen Tod von Tiernachinfektionen auf, während die Tiere, die einen Komawert von 2 erreichen oder über 168 h Beobachtung überleben, eingeschläfert werden. - Anästhesisieren Sie Mäuse mit einem Komawert von 2 oder die über die Beobachtungszeit mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg) überleben und ophthalmologische Salbe anwenden.
- Überprüfen Sie, ob die Schmerzreaktion durch Zehenkniff fehlt.
- Durchführung der Euthanasie von Mäusen durch zervikale Dislokation und Aufzeichnung als tot für statistische Analysen.
-
Bewertung der Koloniebildenden Einheiten (CFU) in peripheren Organen
- Verwenden Sie eine subtödliche bakterielle Dosis (5 x 105KBE/Mäuse) auf der Grundlage der Überlebensergebnisse der Tiere, um Tiere durch den i.cist zu impfen. (siehe Unterabschnitt 1.2).
- Überwachen Sie die rektale Temperatur jeden Tag während der Infektion und führen Anästhesie von Tieren bei 48 h post-Infektion, wie in Schritt 2 erwähnt.
- Fahren Sie mit der 70%igen Ethanoldesinfektion der Brust fort und ziehen Sie 600-700 l Blut durch Herzpunktion der Brusthöhle mit einer 25 G Nadel 0,5 mm x 16 mm ab.
- Sammeln Sie das Blut in einer Röhre mit 3,8 % Natriumcitrat und lagern Sie bei -80 °C für die später lebensfähigen Bakterienzellzahlen.
- Führen Sie zervikale Dislokation durch, um die Tiere zu opfern. Bestätigen Sie den Tod, der das Fehlen von Herzschlag aufzeichnet, nachdem sie die Maus gemäß allen relevanten institutionellen und ethischen Richtlinien geopfert hat.
- Legen Sie die Maus in die Supine-Position und verwenden Sie Schere und Zange, um mit dem Schnitt des Fells entlang der sagittalen Ebene des Körpers fortzufahren. Fixieren Sie die Haut mit dem Fell an den Seiten des Körpers mit Stiften.
- Schneiden Sie die Peritonealmembran mit einer scharfen Schere ab. Verwenden Sie Scheren und Einwegzange, um die Organe (z. B. Milz und Leber) zu verbrauchen und legen Sie jede in sterile Petrischale mit 1 ml GC-Brühe, ergänzt mit 10% (vol/vol) Glycerin.
- Entsorgen Sie den Mauskörper nach den IACUC-Richtlinien sicher.
- Homogenisieren Sie die Organe mechanisch bei Raumtemperatur mit dem Kolben einer 5 ml Spritze für ca. 2-3 min, bis eine einzellige Suspension gebildet wird, und übertragen Sie sie in ein Rohr.
- Das Rohr mit der homogenisierten Gewebeprobe sofort auf das Trockeneis legen.
HINWEIS: Proben können bei -80 °C in einem 2 ml sterilen Rohr gelagert werden, um die lebensfähige Auswertung der Bakterienzellzahlen an späteren Stellen durchzuführen. - Machen Sie GC AgarPlatten mit Antibiotika, wenn erforderlich. Trocknen Sie die Platten vor der Verwendung vor der Inkubation bei 37 °C für 2-3 h.
- 10-fachserielle Verdünnungen der Proben in GC-Brühe aus jedem homogenisierten Gewebe und Jeder Platte auf GC-Agarplatten vorbereiten. Über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
3. Vorbereitung von Hirngewebe n. Chr. für die KBE-Anzahl
- Verwenden Sie eine subtödliche bakterielle Dosis (5 x 105 KBE/Mäuse) auf der Grundlage der Überlebensergebnisse der Tiere, um Tiere durch den i.cist zu impfen. (siehe Unterabschnitt 1.2).
- Führen Sie die Anästhesie von Tieren zur etablierten Infektionszeit durch, wie in Schritt 2 erwähnt.
- Euthanasie von Tieren durch zervikale Dislokation durchführen.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie den Mauskopf mit einer großen Schere ab.
- Resekt das Fell und die Haut mit Hilfe einer kleinen chirurgischen Schere und einer feinen gekippten Stahlzange, in Richtung der Oberseite des Schädels, um in der Lage, deutlich zu sehen, die Nähte und die Öffnung des Schädels zu führen.
- Legen Sie die Spitze einer winzigen Schere durch das Foramen magnum, um den Schädel zu öffnen.
- In Richtung der Mitte des Schädels und über die Mittellinie des parietalen Knochens auf die gegenüberliegende Seite des Schädels schneiden. Entlang des seitlichen Rands der Lambdoid-Naht vorsichtig schneiden.
- Heben Sie den Schädel von der hinteren parietalen Ecke aus und ziehen Sie ihn diagonal nach oben, um das Gehirn zu entdecken, indem Sie fein gekippte Zangen verwenden.
- Achten Sie darauf, dass das Hirngewebe nicht an einem Knochen des Kopfes befestigt ist, wenn der Schädel angehoben wird.
- Verwenden Sie Einwegzange, um jegliches Bindegewebe zwischen Schädel und Gehirn zu entfernen, um sicherzustellen, dass Das Hirngewebe zusammen mit dem Schädel entfernt wird.
- Lassen Sie das Hirngewebe nicht zu sehr austrocknen. Legen Sie das Gehirn mit Einwegzange in eine Petrischale mit 1 ml GC-Brühe, ergänzt mit 10% (vol/vol) Glycerin.
- Homogenisieren Sie das Gehirn mechanisch mit dem Kolben einer 5 ml Spritze (siehe Schritt 2.2.9). Die Proben in ein 2 ml steriles Rohr geben und -80 °C für die später lebensfähige Bakterienzahlauswertung speichern, wie in Schritt 2.2 erläutert.
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Representative Results
Überleben von Mäusen, die mit N. meningitidis Wildtyp und isogenen mutierten Stämmen infiziert sind.
Die in diesen repräsentativen Ergebnissen verwendeten Neisseria meningitidis-Stämme sind der Serogruppe C-Referenzstamm 93/4286 (ET-37) und sein isogener Mutant 93/4286"cssA, der durch Insertionsinaktivierung des cssA-Gens die UDP-N-Acetylglucosamin 2-Epimerase, die in Kapselsynthese-Locus25abbildet. Um den Virulenzgrad des cssA-defektenStammes im vorliegenden murinen Modell zu bewerten, wurde die tödliche Dosis bewertet, die in der Lage ist, den Tod von 50% der infizierten Tiere (LD50) zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden drei Gruppen von Tieren intracisternal mit Dosen von 104 bis 106 KBE des Wildstamms 93/4286 und mit Dosen des mutierten Stammes 93/4286"cssA zwischen 107 und 109 KBE infiziert. . Im Allgemeinen erfolgten die Verringerung der klinischen Parameter (z. B. Körpergewicht und Temperatur) und die Erhöhung der Sterblichkeitsrate innerhalb der ersten 72 h nach der Infektion. Die LD50 für den Wildstamm entsprach der Meningokokken-Herausforderung von 104 KBE, während die Sterblichkeitsrate mit der Dosis von 105 KBE 83,4% und mit 106 KBE von 100% entsprach (Abbildung 1A). Umgekehrt war es notwendig, um die LD50 für den mutierten Stamm 93/4286"cssAzu erhalten, eine Dosis von 108 KBE (Abbildung 1B), eine Menge von 10.000 Mal höher im Vergleich zu Wild-Typ-Stamm.
Bewertung von N. meningitidis lebensfähige KBE in der Maus Gehirngewebe.
Um der Kinetik der Infektion im Hirngewebe infizierter Tiere zu folgen, wurde ein Zeitverlaufstest mit Wildtyp oder cssA-Mutantenstamm 25durchgeführt. Nach dem i.cist. Injektion mit 5x105 KBE von 93/4286 oder 93/4286 "cssA-Stämmen, gab es eine schnelle Zunahme von Wild-Typ-Bakterien im Gehirngewebe erreichen die höchsten Zahlen bei etwa 24 h nach der Infektion (Abbildung 2A); Umgekehrt sanken die lebensfähigen Zahlen im Gehirn von Mäusen, die mit der isogenen cssA-defektenMutante herausgefordert wurden, im Laufe der Zeit schrittweise bis zu 2.026 Log CFU bei 1,774 72 h nach einer Infektion (Abbildung 2A). Das Experiment hat gezeigt, dass 33,3% der mutierten herausgeforderten Mäuse eine bakterielle Clearance von der Infektionsstelle zeigten, während eine Infektion mit Wildstämmen nie aus dem Gehirn von Tieren ausgerottet wurde.
Bewertung der Meningokokkenbelastung in Milz und Leber 48h nach der Herausforderung.
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Clearance von Bakterien von infizierten Mäusen 48 h nach der Herausforderung in peripheren Organen zu bewerten. Zu diesem Ziel wurden zwei Gruppen von Mäusen mit 5 x 105 KBE von 93/4286 oder 93/4286"cssA-Stämmen infiziert, und bakterielle lebensfähige Zahlen wurden in der Milz und Leber infizierter Mäuse25 (Abbildung 2B) ausgewertet. Nach 48 h von der Meningokokken-Injektion wurde die cssA-defekteMutante vollständig in Milz und Leber gelöscht, während die mit Wildstämmen infizierten Tiere einen anhaltenden systemischen Infektionsrahmen aufwiesen. Die Mittelwerte der KBE nach 48 h lagen in der Tat immer noch bei 3,212 Holz KBE bei 3,354 bzw. 6,949 Holz-KBE bei 1,37 in milden bzw. Leber. Der Unterschied in den bakteriellen Belastungen im Lebergewebe zweier Tiergruppen war statistisch signifikant (mit einem P < 0,001).
Abbildung 1: Überleben von Mäusen, die mit 93/4286 Wildtyp- oder cssA-defekten N. Meningitidis-Stämmen infiziert sind. (A) Drei Gruppen von Balb/c-Mäusen (n= 6/Dosis) wurden i.cist infiziert. mit 104, 105und 106 KBE/Maus des Wildstamms 93/4286 und (B) mit 107, 108und 109 KBE/Maus des isogenen cssA-defektenMutanten. Mäuse wurden eine Woche lang überwacht und das Überleben aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden als prozentuales Überleben in verschiedenen Dosen im Laufe der Zeit ausgedrückt, der Log-Rang p-Wert war < 0,05 für Mäuse, die mit dem Wildtyp-Stamm infiziert sind. Diese Zahl wurde von Colicchio et al.25geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der bakteriellen Belastungen im Zeitverlauf bei Mäusen, die mit den Stämmen 93/4286 oder 93/4286 "cssA geimpft wurden. (A) Zeitverlauf der bakteriellen Belastungen im Hirngewebe nach i.cist. ansteckung. Zwei Gruppen von Balb/c-Mäusen (n = 20/Gruppe) wurden von der i.cist infiziert. Mit 5 x 105 CFU entweder der Wildstammstamm 93/4286 oder der cssA-defekten Mutante. Tiere wurden 4, 24, 48 und 72 h nach einer Infektion geopfert. Gehirne wurden geerntet, mechanisch homogenisiert in GC-Medium, und lebensfähige Zählungen wurden bestimmt. Die Ergebnisse werden als mittleres SD-Protokoll der KBE-Zahlen pro Organ zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Impfung ausgedrückt. Sternchen geben eine statistische Signifikanz an (**, P < 0,01). (B) Bakterielle Belastungen im Laufe der Zeit in Milz und Leber. Zwei Gruppen von Balb/c-Mäusen (n = 5/Gruppe) wurden i.cist infiziert. mit 5 x 105 KBE entweder der Wildstamm-Sorte 93/4286 oder der cssA-defektenMutante. Tiere wurden 48 h nach einer Infektion eingeschläfert. Milz und Leber wurden geerntet, mechanisch homogenisiert und lebensfähige Zählungen ermittelt. Die Ergebnisse werden als Log-CFU-Zahlen pro Organ ausgedrückt. Horizontale Balken zeigen mittlere Stämme von bakteriellen Tittern an. Sternchen geben eine statistische Signifikanz an (***, P < 0,001). Diese Zahl wurde von Colicchio et al.25geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie beschreiben wir ein experimentelles Protokoll, um Meningokokken-Meningitis bei erwachsenen Mäusen durch i.cist zu induzieren. Impfung von Meningokokkenbakterien. Unserer Kenntnis nach wurde kein anderes Modell der Meningokokken-Meningitis bei Labormäusen entwickelt, die mit i.cist infiziert sind. Route; in der Vergangenheit wurde dieser Weg erforscht, um Modelle der Meningokokken-Meningitis bei Ratte31 und Kaninchen32zu liefern. Es ist bekannt, dass die höchste Rate von Meningokokken-Erkrankungen zwischen kleinen Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen33,34,35gefunden wird; Aus diesem Grund wurden in unserem Meningitis-Mausmodell, anstatt sich auf Neonatal- oder Säuglingstiere zu konzentrieren, 8 Wochen alte immunkompetente Tiere eingesetzt.
In unserem experimentellen Modell haben wir uns für i.cist entschieden. inoculum, da es die Freisetzung der Meningokokken direkt in Cisterna magna sicherstellt, was die bakterielle Replikation im CSF erleichtert. Dieser Weg der Impfung ist physiologisch leichter zugänglich28 und weniger traumatisch als die intrakranielle subarachnoidale Route, die bereits für die Entwicklung von Meningitis aufgrund von Streptococcus spp verwendet wurde. 36,37. Obwohl es nicht die natürliche Art der Infektion von Meningokokken darstellt, war die Injektion von Bakterien in diesem Bereich entscheidend für die Induktion von Meningokokken-Meningitis, wie durch das Überleben der Maus, Bakterienlasten, klinische Parameter und auch durch histologische Analyse24,25,26. Interessanterweise, Referenzstamm 93/4286 induzierte Meningitis mit histopathologischen Merkmalen imitiert diejenigen bei menschlichen Erkrankungen beobachtet24,25,26.
Um eine standardisierte murine Infektion zu etablieren und die Sicherheit der Forscher zu gewährleisten, wurde es vorgezogen, von einem titrierten gefrorenen Bestand von Bakterien zu beginnen, anstatt ein frisches bakterielles Wachstum24,25,30, 38, außerdem haben wir beschlossen, eine subtödliche Dosis von lebenden Meningokokken mit dem Ziel zu verwenden, ein schnelles tödliches Ergebnis zu begrenzen und die Entwicklung von Hirnschäden2,24,25,26zu ermöglichen. Um jedoch eine geeignete infektiöse Dosis für verschiedene Stämme zu bestimmen, müssen Vorversuche durchgeführt werden. In der vorliegenden Studie haben wir einen Serogruppen-C-Referenzstamm 93/4286 und einen isogenen Mutantenstamm 93/4286"cssA mit einer Dosis von 5 x 105 KBE/Mäusen getestet.
Obwohl dieses Modell nicht die Anfangsphasen der Besiedlung und Invasion von Meningokokken imitiert, wächst das bakterielle Isolat nicht nur im CSF gut, sondern kann auch in den Milz- und Leberfächern bleiben. Während der hypoferremischen Phase der neisserialen Infektion, die meisten häm-abgeleiteten Eisenreste mit Leberferritin kombiniert. Da Ferritin Meningokokken verwendet werden kann, um Eisen zu erhalten39, stellt die Leber ein Zielorgan für die bakterielle Replikation dar.
In diesem experimentellen Verfahren wurde der inzuchtige Balb/c-Mausstamm als Ersatz für den ausgezüchteten CD-1-Stamm verwendet, der ursprünglich zur Entwicklung des Meningokokken-Meningitismodells24verwendet wurde. Ausgezüchtete Mäuse waren durch eine große genetische Variabilität gekennzeichnet, die besser geeignet sein kann, mehrere Effekte in einer variablen Kohorte wie der menschlichen Population40,41zu offenbaren. Diese Variabilität erfordert jedoch eine höhere Stichprobengröße, um eine ausreichende statistische Signifikanz zu erhalten, und kann die Standardisierung von Verfahren und gezielten Studien beeinträchtigen.
Trotz des engen Wirtsbereichs von Meningokokken, um die Replikation von Bakterien in murinen Wirt zu gewährleisten und die Virulenz von Meningokokken zu verbessern, wurde Eisendextran den Tieren vor der Infektion verabreicht6,14. Schließlich wurden die Tiere im Vergleich zu anderen experimentellen Modell der Meningitis nicht mit Antibiotika behandelt, um den Krankheitsverlauf und/oder das Profil der Entzündungsreaktion nicht zu beeinflussen26.
Bis heute haben unsere Studien gezeigt, dass die i.cist. Modell ist funktionell, um sowohl Meningitis und invasive Meningokokken-Krankheit im Vergleich zu i.p. oder i.n. Modelle der Infektion zu induzieren, die durch das Auftreten von Sepsis und Bakteriämie gekennzeichnet sind, bevor Meningitis etabliert ist10,11 ,12,13,14,15,16,17. Daher könnte dieses Infektionsmodell, das auf der Induktion von Meningitis bei murinen Wirts basiert, nicht nur nützlich sein, um innovative therapeutische Strategien zu bewerten, um eine bakterielle Replikation direkt in CSF zu verhindern, sondern auch um die Wirksamkeit möglicher passiver Therapie gegen menschliche Krankheitserreger.
Jedoch Meningokokken-Infektion ist ein mehrstufiger Prozess, der Nasopharynx-Kolonisation, Zugang zur Blutbahn, Kreuzung der Blut-Hirn-Schranke und schließlich unkontrollierte Proliferation in der CSF umfasst, reproduziert unser Modell nur einige Aspekte der Meningokokken-Infektion, um zum Teil diese Einschränkungen transgene Tiermodell zu untergraben kann nützlich sein, um die menschliche Pathogenese der Meningokokken-Krankheit nachzuahmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Studien wurden zum Teil von PRIN 2012 [Grant-Nummer 2012WJSX8K] unterstützt: "Host-Mikroben-Interaktionsmodelle bei Schleimhautinfektionen: Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien" und prIN 2017 [2017SFBFER]: "Ein integrierter Ansatz zur Bewältigung des Zusammenspiels zwischen Anpassung, stressbelastete Bedingungen und antimikrobielle Resistenz von anspruchsvollen Krankheitserregern".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
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