Summary
Här beskriver vi en metod för att inducera meningokockmeningit genom en intracisternal infektionsväg hos vuxna möss. Vi presenterar ett steg för steg-protokoll för meningokockinfektion från beredningen av inokulum till intracisternal infektion; registrera sedan djurens överlevnad och utvärdera bakterie laster i murina vävnader.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningokocker) är ett smalt-värd-spänner mikroorganism, globalt igenkänd som den främsta orsaka av bakteriell hjärnhinneinflammation. Meningokocker är en övergående kolonisatör av humant nasofarynx av cirka 10% av friska försöks. Under särskilda omständigheter förvärvar det en invasiv förmåga att tränga in i slemhinnan och invaderar blodomloppet som orsakar septikemi. I det senaste fallet, fulminant sepsis kan uppstå även utan den åtföljande utvecklingen av hjärnhinneinflammation. Omvänt, bakterier kan dåligt multiplicera i blodomloppet, korsa blod-hjärnbarriären, nå det centralanervsystemet, vilket leder till fulminant hjärnhinneinflammation. Den murina modeller av Bakteriell meningit utgör ett användbart verktyg för att undersöka värd-patogenen interaktioner och att analysera de patogenetiska mekanismer som ansvarar för denna dödliga sjukdom. Även om flera experimentella modellsystem har utvärderats under de senaste decennierna, kunde ingen av dessa reproducera de karakteristiska patologiska händelserna vid meningokocksjukdom. I detta experimentella protokoll beskriver vi ett detaljerat förfarande för induktion av meningokockmeningit i en musmodell baserad på intracisternal inympning av bakterier. De egendomliga tecknen på mänsklig meningit registrerades i murinvärden genom bedömning av kliniska parametrar (t. ex. temperatur, kroppsvikt), utvärdering av överlevnadsfrekvens, mikrobiologisk analys och Histologisk undersökning av hjärnskada. När du använder intracisternal (i. Cist.) inoculum, meningokocker fullständig leverans direkt till Cisterna magna, vilket leder till en mycket effektiv meningokockreplikering i hjärnvävnaden. En 1 000-faldig ökning av livskraftiga räkna av bakterier observeras i ca 18 h. Dessutom, meningokocker finns också i mjälten, och levern av infekterade möss, vilket tyder på att levern kan representera ett mål organ för meningokocker replikering.
Introduction
Neisseria meningitidis är en gramnegativ β-proteobacterium begränsad till den mänskliga värden, välkänd för att vara en av de vanligaste orsakerna till hjärnhinneinflammation och sepsis i den mänskliga populationen över hela världen. Det koloniserar de övre luftvägarna (näsa och svalg) av friska och asymtomatiska bärare (2-30% av befolkningen), men bakterien ibland undviker olika värden immunförsvar och sprider sig från blodomloppet till hjärnan orsakar en okontrollerad lokal inflammation, känd som meningokockmeningit. En kombination av värden och bakteriella faktorer verkar bidra till övergången från kommensaler till invasiva beteende1.
N. meningitidis är specialiserat uteslutande på mänsklig kolonisering och infektion. Det har en smal värd sortiment och, därför, har begränsad in vivo patogenes studier på grund av avsaknaden av lämpliga djurmodeller som återger den mänskliga meningokocksjukdom. Som ett resultat, det hade lett till grundläggande luckor i förståelsen om patogenesen av septikemi och hjärnhinneinflammation orsakad av meningokocker. Under de senaste decennierna, utvecklingen av många in vitro-system tillät identifiering av flera meningokocker virulensfaktorer2,3,4. Även om dessa värdefulla studier gav viktiga insikter för att förstå betydelsen av dessa faktorer för en lyckad meningokockinfektion, har dessa modeller inte gjort det möjligt att bedöma konsekvenserna av bakteriella interaktioner med den humorala och cellulära immunsystemet och ännu mindre med hela vävnaden. In vivo djurmodeller av infektion är av stor betydelse samt för utvärdering av skyddsgraden som ges av vaccin formuleringar. Som en human-Tropic patogen, meningokocker besitter lämpliga bestämningsfaktorer som krävs för en lyckad infektion såsom ytstrukturer (dvs, typ IV Pili och opacitet proteiner) och järn upptagningar system för mänskliga receptorer och transportproteiner (dvs., transferrin och lactoferrin)5,6,7 för att korrekt följa, överleva och invadera den mänskliga värden. Slutligen, den genetiska variationen förmågor patogen att kringgå och/eller blockera människans immunsvar ytterligare bidra till den höga arten tropism8,9. Därför, avsaknaden av specifika värd faktorer, inblandade i interaktionen, kan blockera steg av patogenens livscykel, fastställa betydande svårigheter i utvecklingen av små djurmodeller som sammanfattar meningokocker livscykel.
Under de senaste decennierna har flera metoder utvecklats för att förbättra vår förståelse av meningokockinfektion infektiös cykel. Infektioner av två djurmodeller, mus och råtta, antingen intraperitonealt (i.p.) eller intranasalt (i.n.), utvecklades för att reproducera meningokocksjukdom10,11,12,13,14 ,15,16,17. Laboratoriet mus är förmodligen en av de mer mångsidiga djur för att inducera experimentell meningokockinfektion.
Emellertid, den i.p. infektions sättet leder till utvecklingen av svår sepsis även om det inte efterlikna den naturliga infektions vägen, medan i.n. Infektionsväg var användbar för att utvärdera meningokockpatogenes, även om det kan framkalla lunginfektion före sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
I.p. Mouse-modellen bidrog till att bedöma skyddet mot meningokockutmaningen10,11,12. Musmodellen för meningokockkolonisering baserad på i.n. Infektionsväg har utvecklats med spädbarn möss, eftersom de är mer mottagliga för meningokocker, att reproducera en invasiv infektion imitera loppet av meningokocksjukdom hos människor 13,14,15,16,17. För att främja meningokockreplikation i murinvärden tillämpades dessutom ett växande antal tekniska strategier, inklusive administrering av järn till djuren för att förbättra infektionen, användningen av hög bakteriell inokulum, mus-passaged bakteriell stam samt anställning av spädbarn eller immunsupprimerade djur värdar10,13,15,18,19. Uttryck för specifika mänskliga faktorer som CD4620 eller transferrin21 har ökat känsligheten hos möss till denna Human-Tropic bakterie; anställningen av den mänskliga huden xenograft modell av infektion har också varit till nytta för att utvärdera vidhäftning förmåga meningokocker till humant endotel22,23. Kollektivt, den senaste utvecklingen av humaniserade transgena möss har förbättrat förståelsen av meningokocker patogenes och dess värd interaktioner.
Tidigare har vi utvecklat en murinmodell av meningokockmeningit där inympningen av bakterier utfördes i Cisterna magna hos vuxna möss med mus-förpassade bakterier24. Kliniska parametrar och överlevnaden av infekterade möss visade inrättandet av hjärnhinneinflammation med egenskaper jämförbara med dem som setts i den mänskliga värden, liksom, de mikrobiologiska och histologiska analyser av hjärnan. Från dessa infekterade möss, var bakterier, också, återvinns från blod, lever, och mjälte, och bakterie laster från perifera organ korrelerade med den smittsamma dosen. I synnerhet användes denna modell för att utvärdera virulens hos en ISOGEN Mutant stam som var defekt i L-glutamattransportören GltT24. Nyligen, med hjälp av vår musmodell meningokockmeningit hjärnhinneinflammation baserad på i. Cist. linje med serogrupp C-stam 93/42862,24 och en ISOGEN Mutant defekt i CSSA gen kodning för UDP-N-acetylglukosamin 2-epimerase25, har vi analyserat rollen av exponerad sialic syra i etableringen av sjukdom hos möss.
I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att inducera experimentell meningokockmeningit baserad på i. Cist. infektionsväg i Balb/c vuxna möss. Denna metod är särskilt användbar för karakterisering av meningokockinfektion i en murinvärd, samt för bedömning av virulens mellan vilda typ referensstammar och isogena mutanter. Den intracisternal infektions vägen garanterar fullständig leverans av meningokocker direkt i Cisterna magna, vilket i sin tur underlättar bakteriell replikation i cerebrospinalvätskan (CSF) och inducerar meningit med funktioner som efterliknar dessa närvarande i människa2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll genomfördes för att minimera djurens lidande och minska antalet möss i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG). In vivo-experiment som rapporterats i denna studie godkändes av kommittén för etisk djurvård och användning (prot. nummer 2, 14 december 2012) och det italienska hälsoministeriet (prot. Number 0000094-A-03/01/2013). Alla procedurer bör utföras inne i Biosäkerhets skåpet 2 (BSC2) i ett BSL2 rum, och det potentiella smittade avfallet bör bortskaffas i särskilda behållare.
1. infektion av möss med N. meningitidis serogrupp C-stam
Försiktighet: N. meningitidis är potentiellt en skadlig patogen och alla nödvändiga försiktighetsåtgärder måste vidtas vid hantering av denna mikroorganism. Hela experiment kräver biosäkerhet nivå 2 (BSL2) inneslutning. Den forskare som deltar i djurstudier bör använda personlig skyddsutrustning för engångsbruk under experimentets varaktighet.
- Beredning av bakterier för in vivo infektions studier
- Välj en enda koloni från en fräsch Neisseria meningitidis kultur på GC (Gonococcal) agar plattan kompletterad med 1% (VOL/VOL) Polyvitox tillägg och Inokulera i 10 ml GC buljong.
- Odla bakterierna vid 37 ° c i en orbital shaker inkubator med en hastighet av 220 RPM. Håll koll på utsidan av kulturen med en spektrofotometer. Odla kulturen tills den tidiga exponentiella fasen vid en optisk densitet OD600Nm av 0,7, motsvarande ≈ 7 x 108 CFU/ml.
- När önskad ytterdiameter erhålls, gör frysta lager genom att tillsätta 10% glycerol. Fördela 1 mL av kulturen i kryovialerna. Förvara injektionsflaskorna vid-80 ° c tills de används.
Anmärkning: Även om det är bättre att använda färsk bakterieodling, frysta lager användes för att förenkla och standardisera in vivo experimentet. Vanligtvis har de frysta lagren varit sysselsatta inom cirka 6 månader från beredningen. - Före infektionen, Tina frysta bakterier vid rumstemperatur.
- Skörda bakteriecellerna genom centrifugering i 15 min vid 1 500 x g och Omsuspendera i 1 ml färsk GC-buljong som innehåller järndextran (5 mg/kg).
Anmärkning: GC buljong är beredd med tillsats av järndextran (5 mg/kg) för att gynna replikering av meningokocker i värd vävnaden14,18,27. - Före användning, utföra livskraftiga antal bakterier för att bestämma det exakta antalet CFU för infektion. För att göra detta, plocka upp 10 μL av bakteriell suspension och fortsätt med seriella utspädningar och fördela varje utspädning på GC-agar plattor och inkubera vid 37 ° c med 5% CO2, för 18-24 h.
- Intracisternal injektion av möss
Observera:Hela proceduren utförs i laminärt flödes skåp för att bibehålla aseptiska förhållanden.- Husets laboratoriemöss (8 veckor gamla, kvinnliga Balb/c) under särskilda patogenfria förhållanden. Ge mat pellets och vatten AD libitum.
- Bosätta djuren i den nya miljön för 1 vecka innan försöket påbörjas.
- Innan försöket påbörjas, väga och utvärdera deras kroppstemperatur.
Anmärkning: De inavlade Balb/c honmöss av åtta veckor gamla väger i genomsnitt ca 19 g. Medeltemperaturen hos laboratoriemöss fysiologiskt varierande från 36-38 ° c24. - Scruff djuret från halsen, rengör buken området med 70% etanol och injicera i.p. Iron dextran (upplöst i 1% fosfat saltlösning buffert, 250 mg/kg) i nedre högra kvadranten av murina buken med hjälp av en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm , cirka 2-3 h före infektionen.
Anmärkning: Den intraperitoneala injektionen utfördes i nedre högra kvadranten av murina buken för att undvika skadliga buk organ såsom urinblåsa, blindtarmen, etc. Administrationen av exogent järn källa, i form av järndextran, till djur före infektionen gynnar bakteriell multiplikation i värd14,18,27. - Efter 2-3 h, utföra djur anestesi med ketamin (50 mg/kg) och xylazin (3 mg/kg) och oftalmologiska smörjmedel.
- Kontrollera om djupet av anestesi genom att säkerställa frånvaron av smärt svar vid nypa tå.
- Placera musen i sternala Decubitus och försiktigt sträcka armar och ben och halsryggen för att hålla kotpelaren i en rak position.
- Blanda försiktigt bakteriesuspensionen för att bibehålla en konsekvent suspension innan du laddar en spruta med 30 G nål x 8 mm.
Anmärkning: Bered bakteriesuspensionen så nära injektionstiden som möjligt. under tiden, förvara den i rumstemperatur. - Baserat på post upptining bakteriell titer (CFU/mL), Fortsätt med beräkningen av den totala CFU som skall användas, med avseende på det totala antalet djur som skall smittas (CFU-bakteriell dos per antal djur). Fortsätt med beräkningen av den exakta volymen som ska tas från injektionsflaskan för att erhålla den totala CFU-tillämpningen av en proportion mellan posten upptining av bakteriell titer (CFU/mL) och den totala CFU som är användbar för infektion av n möss (efter upptining bakteriell titer CFU : ml = totalt CFU: x). fastställa den slutliga volymen med avseende på det totala antalet djur som skall smittas.
Anmärkning: I dessa experiment användes ett brett spektrum av titer från 104 till 109 per djur. - Rengör det kirurgiska området med 70% etanol.
- Identifiera injektionsstället med hjälp av en nål och injicera den etablerade CFU av meningokocker (vild typ stam och ISOGEN Mutant stam), eller GC buljong kompletterad med järndextran (5 mg/kg) som kontroll, i en total volym av 10 μL i Cisterna magna av möss genom ett nackhål med en 30 G nål x 8 mm.
- Utför cisternal inokulum genom att placera nålen vid kraniocervikala korsningen, särskilt i den dorsala subaraknoidalrummet. Ventroflex huvudet för att göra detta utrymme tillgänglig28.
- Kort, placera djuret i sidled recumbency, håll öronen ur vägen och Flex halsen måttligt (90 till 100 °). Se till att mittlinjen av halsen och huvudet (från näsan till occiput) är i perfekt parallell position till bordsskivan.
- Vidrör Atlas vingarna och se till att de överlappar varandra, vilket eliminerar axiell rotation. En naturlig indrag kan oftast vidröras på mittlinjen där nålen är mest sannolikt att komma in i occipital hålet.
- Kassera sprutan och nålen säkert efter injektion av möss med Neisseria.
- Placera djuret i buren och vänta på uppvaknandet och fullständig återhämtning av rörelse.
- Förvara burarna med infekterade möss under ett laminärt flödes skåp.
- Övervaka möss, 24 h post infektion, för kliniska tecken på koma enligt koma skala29. Koma fjäll: 1 = koma, 2 = står inte upprätt, efter att ha vänt på baksidaen, 3 = stativ upprätt inom 30 s, 4 = stativ upprätt inom 5 s, minimala ambulatory aktiviteter, 5 = det normala.
Anmärkning: När hos djur registrerades smärta, analgesi med meloxikam (5 mg/kg i.p. för studiens varaktighet) administrerades. - Fortsätt med analysen av djurens överlevnad eller CFU-räkning på de infekterade djuren enligt anvisningarna i steg 2.
- Utför eutanasi av möss med en poäng på 2 genom cervikal dislokation och rekord som död för statistisk analys.
2. djurens överlevnad och CFU-antal
-
Djurens överlevnad
- Förbered bakteriell inokulat vid olika doser (mellan 104 till 109 CFU per mus) för att infektera djur av i. Cist. rutten (se steg 1,2).
- Inokulera kontroll möss med GC-buljong, kompletterad med järndextran (5 mg/kg), på samma sätt.
- Övervaka djur för kliniska symtom: volang päls, böjd utseende, hypotermi, viktminskning, letargi, eller döende24,25,26,30, varje dag i hela experimentet för 168 h (7 dagar) minst två gånger om dagen under experimentets varaktighet.
- Mät kroppsvikt och temperatur genom att använda en digital balans och en rektaltermometer, respektive varje dag.
- Registrera överlevnaden av möss för en vecka.
Anmärkning: Spela in den naturliga döden av Animal post infektion medan de djur som når koma värdet 2 eller som överlever över 168 h observation kommer att euthanized. - Söva möss med koma värdet 2 eller som överlever över observationstiden med ketamin (50 mg/kg) och xylazin (3 mg/kg) och tillämpa oftalmisk salva.
- Kontrollera att smärtan svaret är frånvarande genom tå nypa.
- Utför eutanasi av möss genom cervikal dislokation och rekord som död för statistisk analys.
-
Utvärdering av kolonibildande enheter (CFU) räknas i perifera organ
- Använd en sub-Lethal bakteriell dos (5 x 105CFU/möss) på grundval av djur överlevnad resultat att Inokulera djur av i. Cist. (se underavsnitt 1,2).
- Övervaka den rektala temperaturen varje dag under infektionen och utföra anestesi av djur på 48 h post infektion som nämns i steg 2.
- Fortsätt med 70% etanol desinfektion av bröstet och dra upp 600-700 μL blod genom hjärt punktering av brösthålan med hjälp av en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm.
- Samla in blodet i ett rör som innehåller 3,8% natriumcitrat och förvara vid-80 ° c för de senare livskraftiga bakteriella cell räkningar.
- Utföra livmoderhalscancer dislokation att offra djuren. Bekräfta döden inspelning frånvaron av hjärtslag, efter att offra musen enligt alla relevanta institutionella och etiska riktlinjer.
- Lägg musen i ryggläge och använda saxar och pinjenötter att gå vidare med snittet av pälsen längs sagittal planet av kroppen. Fixera huden med pälsen på sidorna av kroppen med stift.
- Skär av peritonealmembranet med vassa saxar. Använd sax och engångstång till punktskatter organ (t. ex., mjälte och lever) och sätta var och en i steril petriskål med 1 mL GC buljong kompletterad med 10% (VOL/VOL) glycerol.
- Kassera mus kroppen på ett säkert sätt enligt IACUC-riktlinjerna.
- Homogenisera organen mekaniskt vid rumstemperatur med kolven på en 5 mL spruta i ca 2-3 min tills en encellig suspension bildas och överför den i ett rör.
- Sätt röret med homogeniserade vävnadsprovet omedelbart på torris.
Anmärkning: Proverna kan förvaras vid-80 ° c i ett 2 mL sterilt rör för att utföra den livskraftiga bakterie cells räkning utvärderingen vid senare tidpunkter. - Gör GC agar plattor med antibiotika när det behövs. Torka plattorna före användning av förinkuberingen vid 37 ° c i 2-3 h.
- Förbered 10-faldigt seriella utspädningar av proverna i GC buljong från varje homogeniserad vävnad och platta på GC agar plattor. Inkubera över natten vid 37 ° c med 5% CO2.
3. beredning av hjärnvävnad för CFU-räkning
- Använd en sub-Lethal bakteriell dos (5 x 105 CFU/möss) på grundval av djur överlevnad resultat att Inokulera djur av i. Cist. (se underavsnitt 1,2).
- Utför anestesi av djur vid etablerad infektions tid som nämns i steg 2.
- Utför eutanasi av djur genom cervikal dislokation.
- Rengör det kirurgiska området med 70% etanol.
- Klipp av mus huvudet med en stor sax.
- Resect pälsen och huden med hjälp av små kirurgiska saxar och en fin tippad ståltång, fortsätter mot toppen av skallen för att tydligt kunna se suturer och att vägleda öppnandet av kraniet.
- Sätt spetsen på en liten sax genom foramen magnum för att öppna skallen.
- Skär mot mitten av kraniet och över mittlinjen av parietalbenet till motsatt sida av skallen. Skär försiktigt längs den laterala kanten av lambdoid suturen.
- Lyft kraniet start från den bakre parietala hörnet och dra den diagonalt uppåt för att upptäcka hjärnan, genom att använda fina tippade pintippar.
- Var noga med att hjärnvävnaden inte är knuten till något ben i huvudet, när skallen lyfts.
- Använd engångstång för att ta bort bindväv mellan skallen och hjärnan, för att säkerställa att hjärnvävnaden avlägsnas tillsammans med skallen.
- Låt inte hjärnvävnaden torka ut för mycket. Placera hjärnan, med hjälp av engångspinvor, i en petriskål med 1 mL GC buljong kompletterad med 10% (VOL/VOL) glycerol.
- Homogenisera hjärnan mekaniskt med kolven på en 5 mL spruta (se steg 2.2.9). Överför proverna till ett 2 mL sterilt rör och förvara-80 ° c för den senare livsdugliga utvärderingen av bakterieceller enligt beskrivningen i steg 2,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnad av möss infekterade med N. meningitidis vildtyp och isogena Mutant stammar.
De Neisseria meningitidis -stammar som används i dessa representativa resultat är referens stammen av serogrupp C 93/4286 (ET-37) och dess isogena Mutant 93/4286ΩCSSA som erhålls genom insertioniaktivering av CSSA -genen, kodning för den UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, det kartlägger in kapsel syntes Locus25. För att bedöma virulens grad av CSSA-defekt stam i den nuvarande murina modellen, den dödliga dosen kunna fastställa död 50% av infekterade djur (LD50) utvärderades. Till detta ämna tre grupper av djur var infekterade intracisternally med doser som spänner från 104 till 106 CFU av den Wild typ stammen 93/4286 och med doser av Mutant stam 93/4286ΩCSSA mellan 107 till 109 CFU . Generellt, minskningen av kliniska parametrar (t. ex. kroppsvikt och temperatur) och den ökande dödligheten inträffade inom den första 72 h efter infektionen. LD50 för den vilda typen av stam motsvarade meningokockutmaningen av 104 CFU, medan dödligheten med dosen 105 CFU var lika med 83,4% och med 106 CFU på 100% (figur 1a). Omvänt, för att erhålla LD50 för Mutant stammen 93/4286ΩCSSA, det har varit nödvändigt en dos av 108 CFU (figur 1b), en mängd 10 000 veck högre jämfört med vild typ stam.
Utvärdering av N. meningitidis LIVSKRAFTIGA CFU i musen hjärnvävnader.
För att följa kinetiken av infektionen i hjärnvävnaden hos infekterade djur, utfördes en tids kurs analys med Wild Type eller CSSA Mutant Strain25. Efter i. Cist. injektion med 5x105 CFU av 93/4286 eller 93/4286ΩCSSA -stammar, det fanns en snabb ökning av vilda typ bakterier i hjärnvävnaden når de högsta siffrorna vid cirka 24 h post infektion (figur 2A); omvänt i hjärnan hos möss som utmanats med den isogena CSSA-defekta Mutant sjönk de livskraftiga räkningarna progressivt över tiden till 2,026 log CFU ± 1,774 72 h post infektion (figur 2A). Experimentet har visat att 33,3% av de muterade möss som utmanats visade bakteriell clearance från infektionsområdet, medan infektion med vild typ stam aldrig utrotades från hjärnan hos djur.
Utvärdering av meningokockbelastning i mjälte och lever 48h efter Challenge.
Detta experiment utfördes för att utvärdera clearance av bakterier från infekterade möss 48 h post-Challenge i perifera organ. Till detta syfte, två grupper av möss var infekterade med 5 x 105 CFU av antingen 93/4286 eller 93/4286ΩCSSA stammar, och bakteriella livskraftiga räknas utvärderades i mjälten och levern av infekterade möss25 (figur 2b). Efter 48 h från meningokockinjektion, var CSSA-defekt Mutant helt rensas i mjälte och lever, medan de djur infekterade med vild typ stam uppvisade en ihållande systemisk infektion ram. Medelvärdena för CFU efter 48 h var faktiskt fortfarande 3,212 log CFU ± 3,354 och 6,949 log CFU ± 1,37 i mjälten och levern, respektive. Skillnaden i bakterie laster i levern vävnad av två djurgrupper var statistiskt signifikant (med en P < 0,001).
Figur 1: överlevnad av möss infekterade med 93/4286 vildtyp eller CSSA-defekta N. meningitidis stammar. (A) tre grupper av Balb/c-möss (n = 6/dos) var infekterade i. Cist. med 104, 105och 106 CFU/mus av den vildtyp stammen 93/4286 och (B) med 107, 108och 109 CFU/mus av den isogena CSSA-defekta Mutant. Möss övervakades i en vecka och överlevnad registrerades. Resultaten uttrycks som procent överlevnad vid olika doser över tid, log rank p-värdet var < 0,05 för möss infekterade med den vilda typen stam. Denna siffra har modifierats från Colicchio et al.25. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av bakterie laster över tid hos möss som inokulerats med stammarna 93/4286 eller 93/4286ΩCSSA . A) tidsförlopp för bakterie laster i hjärn vävnaderna efter i. Cist. Infektion. Två grupper av Balb/c-möss (n = 20/grupp) var infekterade av i. Cist. Route med 5 x 105 CFU av antingen den vilda typen stam 93/4286 eller CSSA-defekt Mutant. Djuren offrades 4, 24, 48 och 72 h efter infektion. Hjärnor skördades, mekaniskt homogeniseras i GC medium, och livskraftiga räknas bestämdes. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SD log CFU-nummer per organ vid olika tidpunkter efter inympning. Asterisker indikerar statistisk signifikans (* *, P < 0,01). B) bakterie laster över tid i mjälte och lever. Två grupper av Balb/c möss (n = 5/grupp) var infekterade i. Cist. med 5 x 105 CFU av antingen den vilda typen stam 93/4286 eller CSSA-defekt Mutant. Djuren var euthanized 48 h efter infektion. Spleens och lever var skördade, mekaniskt homogeniserade, och livskraftiga räknas bestämdes. Resultaten uttrycks som log CFU-nummer per organ. Horisontella staplar indikerar genomsnittliga stockar av bakterie-titrar. Asterisker indikerar statistisk signifikans (* * *, P < 0,001). Denna siffra har modifierats från Colicchio et al.25. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskriver vi ett experimentellt protokoll för att inducera meningokockmeningit hos vuxna möss av i. Cist. inympning av meningokockbakterier. Enligt vår kännedom har ingen annan modell av meningokockmeningit utvecklats i laboratoriemöss infekterade av i. Cist. Route i det förflutna, detta sätt har utforskats för att ge modeller av meningokocker meningit i både råtta31 och kanin32. Det är välkänt att den högsta graden av meningokocksjukdom finns mellan små barn, ungdomar och unga vuxna33,34,35; av denna anledning, i vår meningit musmodell, i stället för att fokusera på neonatal eller spädbarn djur, 8 veckor gamla immunokompetenta djur anställdes.
I vår experiment modell bestämde vi oss för att använda i. Cist. inokulum eftersom det garanterar frisläppande av meningokocker direkt i Cisterna magna så underlättar bakteriell replikering i CSF. Denna väg inympning är fysiologiskt mer tillgänglig28 och mindre traumatisk än den intrakraniella subarachnoidal rutten, som redan används för utveckling av hjärnhinneinflammation på grund av Streptococcus spp. 36,37. Även om det inte utgör det naturliga sättet för infektion av meningokocker, var injektion av bakterier i detta område avgörande för induktion av meningokockhjärnhinne inflammation, som visas av mus överlevnad, bakterier laster, kliniska parametrar, och även av histologisk analys24,25,26. Intressant, referensstam 93/4286 inducerad hjärnhinneinflammation med histopatologiska funktioner imitera de som observerats i mänskliga sjukdomar24,25,26.
För att etablera en standardiserad murin infektion och för att garantera säkerheten för forskare, det var att föredra att utgå från en titrerad fryst lager av bakterier i stället för en ny bakterietillväxt24,25,30, 38, dessutom bestämde vi oss för att använda en sub-Lethal dos av levande meningokocker i syfte att begränsa en snabb dödlig utgång och möjliggöra utveckling av hjärnskador2,24,25,26. För att fastställa en lämplig infektiös dos för olika stammar måste dock preliminära experiment utföras. I den aktuella studien testade vi en serogrupp C referensstam 93/4286 och en ISOGEN Mutant stam 93/4286ΩCSSA med en dos av 5 x 105 CFU/möss.
Även om denna modell inte härma de inledande faserna av kolonisering och invasion av meningokocker, växer bakterieisolatet väl inte bara i CSF, men det är också kunna stanna kvar i mjälte och levern fack. Under den hypoferremic fasen av neisserial infektion, de flesta av heme-härledda Järn förblir kombinerat med leverferritin. Som ferritin kan användas meningokocker att få järn39, levern utgör ett mål organ för bakteriell replikering.
I detta experimentella förfarande, inavlade Balb/c mus stam användes för att ersätta den utavlade CD-1 stam som ursprungligen användes för att utveckla meningokockmeningit hjärnhinneinflammation modell24. Utavlade möss kännetecknades av en bred genetisk variation som kan vara lämpligare för att avslöja flera effekter i en variabel kohort som befolkningsgrupp40,41. Denna variation behöver dock en högre urvalsstorlek för att få tillräcklig statistisk signifikans och kan störa standardiseringen av förfaranden och riktade studier.
Trots den smala värd utbud av meningokocker, för att säkerställa replikation av bakterier i murina värd och förbättra virulens av meningokocker, järn dextran administrerades till djur före infektionen6,14. Slutligen, jämfört med andra experimentella modell av hjärnhinneinflammation, djur behandlades inte med någon antibiotika, att inte påverka sjukdomsförloppet och/eller profil av den inflammatoriska reaktionen26.
Hittills har våra studier visat att i. Cist. modellen är funktionell att inducera både hjärnhinneinflammation och invasiv meningokocksjukdom jämfört med i.p. eller i.n. modeller av infektion, som kännetecknas av förekomsten av sepsis och bakteriemi innan hjärnhinneinflammation är etablerad10,11 ,12,13,14,15,16,17. Därför, denna infektion modell baserad på induktion av hjärnhinneinflammation i murina värd, kan vara till nytta inte bara för att utvärdera innovativ terapeutisk strategi för att förhindra bakteriell replikering direkt till CSF men också att analysera effekten av eventuella passiva immun behandling mot humana patogener.
Men meningokockinfektion är en i flera steg process, som omfattar nasofarynx kolonisering, tillgång till blodomloppet, passage av blod-hjärnbarriären och slutligen okontrollerad spridning i CSF, vår modell endast återger vissa aspekter av meningokockinfektion, för att undergräva delvis dessa begränsningar transgena djur modellen kan vara användbar för att efterlikna den mänskliga patogenesen av meningokocksjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studierna stöddes delvis av PRIN 2012 [Grant Number 2012WJSX8K]: "värd-Microbe interaktion modeller i slemhinnor infektioner: utveckling av nya terapeutiska strategier" och genom PRIN 2017 [2017SFBFER]: "en integrerad strategi för att hantera samspelet mellan anpassning, stressiga förhållanden och antimikrobiell resistens hos utmanande patogener ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al.
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
