Summary
Her beskriver vi en metode til at inducere meningokokmeningitis gennem en intracisternal infektions rute hos voksne mus. Vi præsenterer en trinvis protokol af meningokokinfektion fra fremstilling af inokulum til intracisternal infektion; derefter registrere dyrets overlevelse og evaluere de bakterielle belastninger i murine væv.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningococcus) er en smal-vært-Range mikroorganisme, globalt anerkendt som den førende årsag til bakteriel meningitis. Meningococcus er en forbigående kolonist af humant nasopharynx på ca. 10% af raske forsøgs mennesker. Under særlige omstændigheder, det erhverver en invasiv evne til at trænge ind i slimhinderne barriere og invaderer blodbanen forårsager septikæmi. I det seneste tilfælde, fulminant sepsis kunne opstå selv uden den deraf følgende udvikling af meningitis. Omvendt, bakterier kunne dårligt formere sig i blodbanen, krydse blod-hjerne barrieren, nå det centrale nervesystem, fører til fulminant meningitis. Murine modeller af bakteriel meningitis repræsenterer et nyttigt redskab til at undersøge værten-patogen interaktioner og til at analysere patogengenetiske mekanismer, der er ansvarlige for denne dødelige sygdom. Selv om flere eksperimentelle modelsystemer er blevet evalueret i løbet af de seneste årtier, ingen af disse var i stand til at reproducere de karakteristiske patologiske hændelser af meningokoksygdom. I denne forsøgsprotokol beskriver vi en detaljeret procedure for induktion af meningokokmeningitis i en musemodel, der er baseret på bakteriernes intracisternal inokulation. De særlige tegn på menneskelig meningitis blev registreret i murine vært gennem vurdering af kliniske parametre (f. eks temperatur, kropsvægt), evaluering af overlevelsesraten, mikrobiologiske analyse og histologisk undersøgelse af hjerneskade. Ved brug af intracisternal (i. cist.) inokulum, meningokokker komplet levering direkte til Cisterna Magna, hvilket fører til en meget effektiv meningokokreplikation i hjernevæv. En 1.000-fold stigning af levedygtige optælling af bakterier er observeret i omkring 18 h. Desuden, meningokokker findes også i milten, og leveren af inficerede mus, tyder på, at leveren kan repræsentere et målorgan for meningokokreplikation.
Introduction
Neisseria meningitidis er et gram negativt β-proteobakterium begrænset til den menneskelige vært, kendt for at være en af de mest almindelige årsager til meningitis og sepsis i den menneskelige befolkning i hele verden. Det koloniserer de øvre luftveje (næse og hals) af sunde og asymptomatiske bærere (2-30% af befolkningen), men bakterien undertiden undlades forskellige vært immunforsvar og spredes fra blodbanen til hjernen forårsager en ukontrolleret lokal betændelse, kendt som meningokokmeningitis. En kombination af vært og bakterielle faktorer synes at bidrage til overgangen fra kommensal til invasiv adfærd1.
N. meningitidis er specialiseret udelukkende i menneskelig kolonisering og infektion. Det har en smal vært rækkevidde og derfor har begrænset in vivo patogenesen undersøgelser på grund af manglen på egnede dyremodeller, der gengiver den menneskelige meningokok sygdom. Som følge heraf havde det ført til grundlæggende huller i forståelsen vedrørende patogenesen af septikæmi og meningitis forårsaget af meningococcus. I de seneste årtier har udviklingen af mange in vitro-systemer gjort det muligt at identificere flere meningokokvirulens faktorer2,3,4. Selv om disse værdifulde undersøgelser gav vigtig indsigt for at forstå disse faktorers rolle for en vellykket meningokokinfektion, tillod disse modeller ikke vurdering af følgerne af bakterielle interaktioner med humorale og cellulære immunsystemet og endnu mindre med hele vævet. In vivo dyremodeller af infektion er af stor relevans samt for vurderingen af beskyttelsesgrad, der er knyttet til vaccine formuleringer. Som et humant-tropisk patogen besidder meningokok passende determinanter, der er nødvendige for en vellykket infektion, såsom overfladestrukturer (dvs. type IV-Pili og uigennemsigtige proteiner) og jern optagelses systemer til humane receptorer og transportproteiner (dvs. transferrin og lactoferrin)5,6,7 til korrekt overholdelse, overleve og invadere den menneskelige vært. Endelig, de genetiske variation evner af patogenet at unddrage sig og/eller blokere den menneskelige immunrespons yderligere bidrage til den høje art tropisme8,9. Derfor kan fraværet af specifikke værts faktorer, der er involveret i interaktionen, blokere skridt i patogenens livscyklus, hvilket skaber betydelige vanskeligheder i udviklingen af små dyremodeller, der opsummerer meningokok-livscyklussen.
I løbet af de seneste årtier er flere tilgange blevet udviklet for at forbedre vores forståelse af meningokok infektiøs cyklus. Infektioner i to dyremodeller, mus og rotter, enten intraperitonealt (IP) eller intranasalt (i.n.), blev udviklet til at gengive meningokoksygdom10,11,12,13,14 ,15,16,17. Laboratoriet mus er formentlig en af de mere alsidige dyr til inducerende eksperimentel meningokokinfektion.
Hvordan end, den IP måde i infektion fører hen til den udvikling i svær sepsis selv om sig gør ikke efterligne den naturlig vej i infektion, medens den i.n. vej i infektion var nyttig hen til vurdere meningokok patogenese, selv om sig må fremkalde Lungeinfektion før sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
Den IP-musemodel var medvirkende til at vurdere beskyttelsen mod meningokok-udfordringen10,11,12. Musemodellen for meningokokkolonisation baseret på i.n.-infektions vejen er blevet udviklet med spædbarn-mus, da de er mere modtagelige for meningokokker, til at reproducere en invasiv infektion, der efterligner forløbet af meningokoksygdom hos mennesker 13,14,15,16,17. Desuden, at fremme meningokokreplikation i murine vært, et stigende antal tekniske strategier blev også anvendt, herunder administration af jern til dyrene til at forbedre infektionen, brugen af høj bakteriel inokulum, mus-passaged bakteriel stamme samt ansættelse af spædbarn eller immunkompromitterede dyr værter10,13,15,18,19. Udtryk for specifikke menneskelige faktorer som CD4620 eller transferrin21 har øget følsomheden af mus til denne menneskelige-Tropic bakterie; ansættelse af den menneskelige hud xenograft model af infektion har også været nyttigt at evaluere vedhæftningsevne af meningokokker til humant endotelet22,23. Kollektivt har den seneste udvikling af humaniserede Transgene mus forbedret forståelsen af meningokok patogenesen og dens vært interaktioner.
Tidligere udviklede vi en murine model af meningokokmeningitis, hvor inokulering af bakterier blev udført i Cisterna Magna af voksne mus med mus-passaged bakterier24. Kliniske parametre og overlevelsesraten for inficerede mus viste etableringen af meningitis med egenskaber svarende til dem, der ses i den menneskelige vært, samt de mikrobiologiske og histologiske analyser af hjernen. Fra disse inficerede mus, bakterier var, også, genvundet fra blod, leveren, og milt, og bakterielle belastninger fra perifere organer korreleret med den smitsomme dosis. Denne model blev især anvendt til at evaluere virulens af en isogene mutant stamme, som er defekt i L-glutamat-transporter GltT24. For nylig, ved hjælp af vores musemodel af meningokok meningitis baseret på i. cist. rute med serogruppe C stamme 93/42862,24 og en isogene mutant defekt i CSSA -genkodning for UDP-N-acetylglucosamin 2-epimerase25, har vi analyseret rollen af eksponeret sialsyre i virksomheden af sygdom i mus.
I denne protokol beskriver vi en enkel metode til at fremkalde eksperimentel meningokokmeningitis baseret på i. cist. smitte vejen i Balb/c voksne mus. Denne metode er især nyttig til karakterisering af meningokokinfektion i en murine vært, samt til vurdering af virulens mellem vilde type reference stammer og isogene mutanter. Den intra-cisternal infektions rute sikrer fuldstændig levering af meningokokker direkte til Cisterna Magna, hvilket igen letter bakterie replikation i cerebrospinalvæsken (CSF) og inducerer meningitis med funktioner, der efterligner dem til stede i mennesker2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev gennemført for at minimere dyrenes lidelser og reducere antallet af mus i overensstemmelse med Rådets direktiv fra november 24, 1986 (86/609/EØF). In vivo forsøg rapporteret i dette studie blev godkendt af Udvalget for etisk dyrepasning og-anvendelse (prot. nummer 2, 14. december 2012) og det italienske sundhedsministerium (prot. Number 0000094-A-03/01/2013). Alle procedurer skal udføres inde i Biosafety kabinet 2 (BSC2) i et BSL2 rum, og det potentielt inficerede affald bør bortskaffes i dedikerede beholdere.
1. infektion af mus med N. meningitidis Serogruppe C stamme
Forsigtig: N. meningitidis er potentielt et skadeligt patogen, og der skal træffes alle nødvendige forholdsregler ved håndtering af denne mikroorganisme. Hele eksperimenterne kræver biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) indeslutning. Forskeren, der er involveret i dyreforsøg, bør anvende det personlige beskyttelsesudstyr (PV) til engangsbrug i hele forsøgsperioden.
- Fremstilling af bakterier til in vivo-infektions undersøgelser
- Vælg en enkelt koloni fra en frisk Neisseria meningitidis kultur på GC (gonokok) agar plade suppleret med 1% (Vol/Vol) Polyvitox supplement og inokulere i 10 ml GC bouillon.
- Dyrk bakterierne ved 37 °C i en orbital shaker inkubator med en hastighed på 220 rpm. Fortsæt med at kontrollere kulturens OD med et spektrofotometer. Dyrke kulturen indtil den tidlige eksponentielle fase ved en optisk tæthed OD600Nm af 0,7, svarende til ≈ 7 x 108 CFU/ml.
- Når den påkrævede OD er opnået, skal du lave frosne bestande ved at tilføje 10% glycerol. 1 mL af kulturen i kryovialerne. Opbevar hætteglassene ved-80 °C indtil brug.
Bemærk: Selv om det er bedre at bruge frisk bakteriel kultur, frosne bestande blev brugt til at forenkle og standardisere in vivo eksperiment. Normalt er de frosne bestande blevet anvendt inden for ca. 6 måneder fra tilberedningen. - Før infektionen, Tø frosne bakterier ved stuetemperatur.
- Bakteriecellerne høstes ved centrifugering i 15 minutter ved 1.500 x g og gensuspension i 1 ml frisk GC-bouillon indeholdende jern dextran (5 mg/kg).
Bemærk: GC bouillon er tilberedt med tilsætning af jern dextran (5 mg/kg) for at favorisere replikation af meningokokker i værts vævet14,18,27. - Før du bruger, udføre levedygtige optællinger af bakterier til at bestemme det nøjagtige antal CFU for infektion. For at gøre dette, afhente 10 μL bakteriel suspension og fortsætte med serielle fortyndinger og sprede hver fortynding på GC agar plader og inkubere ved 37 °C med 5% CO2, for 18-24 h.
- Intracisternal injektion af mus
Bemærk:Hele proceduren udføres i laminar flow kabinettet for at opretholde aseptiske forhold.- House laboratorie mus (8 uger gamle, kvindelige Balb/c) under specifikke patogenfrie forhold. Giv mad pellets og vand ad libitum.
- Udlign dyrene i det nye miljø i 1 uge, før eksperimentet påbegyndes.
- Før forsøget påbegyndes, vejes og evalueres deres kropstemperatur.
Bemærk: Den indavlede Balb/c hunmus af otte-ugers-gamle vejer et gennemsnit på omkring 19 g. Den gennemsnitlige temperatur af laboratorie mus fysiologisk spænder fra 36-38 °C24. - Scruff dyret fra halsen, rense maven område med 70% ethanol og injicere IP jern dextran (opløst i 1% fosfat saltvands buffer, 250 mg/kg) i nederste højre kvadrant af murine maven ved hjælp af en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm , ca. 2-3 h før infektionen.
Bemærk: Intraperitoneal injektion blev udført i nederste højre kvadrant af murine maven for at undgå at beskadige abdominale organer såsom urinblære, cecum osv. Administrationen af eksogene jern kilde, i form af jern dextran, til dyr forud for infektionen favoriserer bakterie multiplikation i værten14,18,27. - Efter 2-3 h, udføre dyrs anæstesi med ketamin (50 mg/kg) og xylazin (3 mg/kg) og oftalmologiske smøremiddel.
- Kontroller dybden af anæstesi ved at sikre fravær af smerte respons ved klemning af tåen.
- Placer musen i brystbenet decubitus og stræk forsigtigt lemmerne og den cervikale rygsøjle for at holde rygsøjlen i en lige position.
- Bland forsigtigt den bakterielle suspension for at opretholde en konsekvent suspension, før du lægger en sprøjte på 30 G nål x 8 mm.
Bemærk: Forbered den bakterielle suspension så tæt som muligt på injektionstiden; i mellemtiden, opbevare det ved stuetemperatur. - Baseret på den efter optøning af bakteriel titer (CFU/mL), fortsættes beregningen af den samlede CFU, der skal anvendes, med hensyn til det samlede antal dyr, der skal være inficeret (CFU bakteriel dosis pr. antal dyr). Fortsæt med beregningen af den nøjagtige mængde, der skal tages fra hætteglasset for at opnå den totale CFU, der anvender en andel mellem den efter optøende bakterielle titer (CFU/mL) og den totale CFU, der er nyttig til infektion af n-mus (efter optøning af bakteriel titer CFU : ml = total CFU: x). fastsætte det endelige volumen med hensyn til det samlede antal dyr, der skal inficeret.
Bemærk: I disse eksperimenter blev der anvendt en lang række titer fra 104 til 109 pr. dyr. - Rengør operationsområdet med 70% ethanol.
- Identificér injektions punktet ved hjælp af en nål, og Injicer den etablerede CFU for meningokokker (vildtype stamme og isogene mutant stamme), eller GC bouillon suppleret med jern dextran (5 mg/kg) som kontrol, i et samlet volumen på 10 μL i Cisterna Magna af mus gennem et occipital Burr-hul ved hjælp af en 30 G nål x 8 mm.
- Udfør cisternal inokulum ved at placere nålen ved kraniocervikal krydset, specielt i dorsalen subarachnoiderum. Ventroflex hovedet for at gøre denne plads tilgængelig28.
- Kortvarigt, Placer dyret i lateral recumbency, hold ørerne ude af vejen og Flex halsen moderat (90 til 100 °). Sørg for, at midterlinjen i halsen og hovedet (fra næsen til occiput) er i perfekt parallel position til bordpladen.
- Røre Atlas vinger og sørg for, at de overlapper, eliminere aksial rotation. En naturlig indrykning kan normalt blive rørt på midterlinjen, hvor nålen er mest tilbøjelige til at komme ind i occipital hullet.
- Kassér sprøjten og nålen sikkert efter injektion af mus med Neisseria.
- Placer dyret i buret og vente på opvågning og fuld inddrivelse af bevægelse.
- Opbevar bure med inficerede mus under et laminar flow kabinet.
- Overvåg mus, 24 timer efter infektion, for kliniske tegn på koma i henhold til koma skala29. Koma skala: 1 = koma, 2 = ikke står oprejst efter at være vendt på bagsiden, 3 = står oprejst inden for 30 s, 4 = står oprejst inden for 5 s, minimal ambulante aktiviteter, 5 = normal.
Bemærk: Når dyrene blev registreret smerte, blev analgesi med meloxicam (5 mg/kg IP for studiets varighed) administreret. - Fortsæt for dyrets overlevelse eller CFU tæller assay på de inficerede dyr som beskrevet i trin 2.
- Udfør eutanasi af mus med en score på 2 ved livmoderhals dislokation og Optag som døde for statistisk analyse.
2. dyrs overlevelse og CFU tæller
-
Dyrs overlevelse
- Forbered bakteriel inocula i forskellige doser (fra 104 til 109 CFU pr. mus) til at inficere dyr af i. cist. rute (Se trin 1,2).
- Inokulere kontrolmus med GC bouillon, suppleret med jern dextran (5 mg/kg), på samme måde.
- Overvåge dyr for kliniske symptomer: pjusket pels, krumrygget udseende, hypotermi, vægttab, sløvhed, eller døende24,25,26,30, hver dag i hele eksperimentet for 168 h (7 dage) mindst to gange om dagen i forsøgsperioden.
- Mål kropsvægt og temperatur ved hjælp af en digital balance og et rektal termometer, henholdsvis hver dag.
- Optag overlevelsen af mus i en uge.
Bemærk: Registrere den naturlige død af dyr efter infektion, mens de dyr, der når en koma værdi på 2 eller at overleve mere end 168 h observation vil blive euthanized. - Anæstetize mus med en koma værdi på 2 eller at overleve i observationstiden med ketamin (50 mg/kg) og xylazin (3 mg/kg) og anvende oftalmologiske salve.
- Kontroller, at smerten respons er fraværende af tå knivspids.
- Udfør eutanasi af mus ved livmoderhals dislokation og Optag som døde for statistisk analyse.
-
Evaluering af kolonidannende enheder (CFU) tæller i perifere organer
- Brug en subletal bakteriel dosis (5 x 105CFU/mus) på grundlag af resultaterne af dyrenes overlevelse til at inokulere dyr ved hjælp af i. cist. rute (Se under afsnit 1,2).
- Overvåge rektal temperatur hver dag under infektionen og udføre anæstesi af dyr på 48 h post infektion som nævnt i trin 2.
- Fortsæt med 70% ethanol desinfektion af brystet og trække 600-700 μL af blod ved hjertets punktering af brysthulen ved hjælp af en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm.
- Blodet opsamles i et rør, der indeholder 3,8% natriumcitrat og opbevares ved-80 °C for de senere levedygtige bakterie celletal.
- Udfør livmoderhals dislokation for at ofre dyrene. Bekræft død registrering fraværet af hjerteslag, efter at have ofret musen i henhold til alle relevante institutionelle og etiske retningslinjer.
- Læg musen i liggende position og bruge saks og pincet til at gå videre med snittet af pels langs sagittale plane af kroppen. Fastgør huden med pels på siderne af kroppen med stifter.
- Skær den peritoneale membran af med skarp saks. Brug sakse og engangs tang til at punktafgifts behandle organerne (f. eks. milt og leveren) og Anbring hver enkelt i steril Petri skål med 1 mL GC bouillon suppleret med 10% (Vol/Vol) glycerol.
- Sikkert kassere muse legemet som pr IACUC retningslinjer.
- Organerne homogeniseres mekanisk ved stuetemperatur med stemplet på en 5 mL sprøjte i ca. 2-3 min., indtil der dannes en enkelt cellesuspension, som overføres i et rør.
- Sæt røret med den homogeniserede vævsprøve straks på den tørre is.
Bemærk: Prøver kan opbevares ved-80 °C i et 2 mL sterilt rør for at udføre den levedygtige bakteriecelle tælling evaluering på senere punkter. - Lav GC agar plader med antibiotika, når det er nødvendigt. Pladerne tørres før brug før inkubning ved 37 °C i 2-3 h.
- 10-fold serielle fortyndinger af prøverne forberedes i GC bouillon fra hvert homogeniseret væv og plade på GC-agarpladerne. Inkuber natten over ved 37 °C med 5% CO2.
3. forberedelse af hjernevæv til CFU-tælling
- Brug en subletal bakteriel dosis (5 x 105 CFU/mus) på grundlag af resultaterne af dyrenes overlevelse til at inokulere dyr ved hjælp af i. cist. rute (Se under afsnit 1,2).
- Udføre anæstesi af dyr på etablerede infektion tid som nævnt i trin 2.
- Udføre eutanasi af dyr ved livmoderhals dislokation.
- Rengør operationsområdet med 70% ethanol.
- Skær hovedet af musen ved hjælp af en stor saks.
- Resect pels og hud ved hjælp af små kirurgiske saks og en fin tippet stål tang, fortsætter mod toppen af kraniet for at være i stand til klart at se suturerne og til at guide åbningen af kraniet.
- Indsæt spidsen af en lille saks gennem foramen magnum for at åbne kraniet.
- Skær mod midten af kranium og på tværs af midterlinjen af parietal knogle til den modsatte side af kraniet. Skær forsigtigt langs den laterale kant af lambdoid suturen.
- Løft kraniet med start fra det bageste parietal hjørne og træk det diagonalt opad for at opdage hjernen, ved hjælp af fine tippet pincet.
- Vær sikker på, at hjernevæv ikke er fastgjort til nogen knogler i hovedet, når kraniet løftes.
- Brug engangs tang til at fjerne eventuelle bindevæv mellem kraniet og hjernen, for at sikre, at hjernevæv fjernes sammen med kraniet.
- Lad ikke hjernevæv tørre ud for meget. Placer hjernen ved hjælp af engangs Tang i en Petri skål med 1 mL GC bouillon suppleret med 10% (Vol/Vol) glycerol.
- Hjernen homogeniseres mekanisk med stemplet på en 5 mL sprøjte (Se trin 2.2.9). Prøverne overføres til et 2 mL sterilt rør og opbevares-80 °C for den senere levedygtige bakteriecelle tælling som beskrevet i trin 2,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse af mus inficeret med N. meningitidis vildtype og isogene mutant stammer.
De Neisseria meningitidis -stammer, der anvendes i disse repræsentative resultater, er Serogruppe C-reference stammen 93/4286 (ET-37) og dens isogene mutant 93/4286ΩCSSA opnået ved indsættelse af inaktivering af CSSA -genet, der koder for UDP-N-acetylglucosamin 2-epimerase, der kort i kapsel syntese locus25. For at vurdere virulens graden af CSSA-defekt stamme i den nuværende murine model, den dødelige dosis i stand til at bestemme død af 50% af inficerede dyr (LD50) blev evalueret. Til dette formål blev tre grupper af dyr inficeret intracisterende med doser fra 104 til 106 CFU af vildtype stamme 93/4286 og med doser af mutant stamme 93/4286ΩCSSA mellem 107 til 109 CFU . Generelt er reduktionen af kliniske parametre (f. eks. legemsvægt og temperatur) og den stigende dødelighed sket inden for den første 72 h efter infektionen. LD50 for Wild type stammen svarede til meningokokudfordringen på 104 CFU, hvorimod dødeligheden med en dosis på 105 CFU var lig med 83,4% og med 106 CFU på 100% (figur 1a). Omvendt, for at opnå LD50 for den mutante stamme 93/4286ΩCSSA, har det været nødvendigt en dosis på 108 CFU (figur 1b), et beløb på 10.000 folder højere sammenlignet med vilde type stamme.
Evaluering af N. meningitidis LEVEDYGTIG CFU i mus hjernevæv.
For at følge kinetikken af infektion i hjernevæv af inficerede dyr, en tid kursus assay blev udført med vildtype eller CSSA mutant stamme25. Efter den i. cist. injektion med 5x105 CFU af 93/4286 eller 93/4286ΩCSSA stammer, der var en hurtig stigning af vilde type bakterier i hjernevæv nå det højeste tal på omkring 24 h post infektion (figur 2a); omvendt i hjernen hos mus, som blev udfordret af den isogene CSSA-defekte mutant, faldt de levedygtige tal progressivt over tid indtil 2,026 log CFU ± 1,774 72 h efter infektion (figur 2a). Eksperimentet har vist, at 33,3% af de mutante udfordrede mus viste bakteriel clearance fra infektionsstedet, hvorimod infektion med vildtype stamme aldrig blev udryddet fra dyrenes hjerne.
Vurdering af meningokokbelastning i milt og lever 48h post-Challenge.
Dette eksperiment blev udført for at evaluere clearance af bakterier fra inficerede mus 48 h post-Challenge i perifere organer. Til dette formål blev to grupper af mus inficeret med 5 x 105 CFU af enten 93/4286 eller 93/4286ΩCSSA stammer, og bakterielle levedygtige tæller blev evalueret i milten og leveren af inficerede mus25 (figur 2b). Efter 48 h fra meningokokinjektion blev den CSSA-defekte mutant fuldstændig ryddet i milten og leveren, mens dyrene inficeret med vildtype stamme udviste en vedvarende systemisk infektions ramme. De gennemsnitlige værdier af CFU efter 48 h var faktisk stadig 3,212 log CFU ± 3,354 og 6,949 log CFU ± 1,37 i henholdsvis milten og leveren. Forskellen i bakterie belastninger i levervævet i to dyregrupper var statistisk signifikant (med en P < 0,001).
Figur 1: overlevelse af mus inficeret med 93/4286 vildtype eller CSSA-defekte N. meningitidis stammer. A) tre grupper af Balb/c-mus (n = 6/dosis) var inficeret i. cist. med 104, 105og 106 CFU/mus af Wild type Strain 93/4286 og (B) med 107, 108og 109 CFU/mus af den isogene CSSA-defekte mutant. Mus blev overvåget i en uge, og overlevelse blev indspillet. Resultater udtrykkes som procent overlevelse ved forskellige doser over tid, logrank p-værdien var < 0,05 for mus inficeret med Wild type stamme. Dette tal er blevet ændret fra Colicchio et al.25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af bakterie belastninger over tid hos mus, som er inokuleret med 93/4286-eller 93/4286ΩCSSA -stammerne. (A) tidsforløb af bakterielle belastninger i hjernens væv efter i. cist. Infektion. To grupper af Balb/c-mus (n = 20/gruppe) blev inficeret af i. cist. rute med 5 x 105 CFU af enten Wild type Strain 93/4286 eller CSSA-defekt mutant. Dyr blev ofret 4, 24, 48 og 72 h efter infektion. Hjerner blev høstet, mekanisk homogeniseret i GC medium, og levedygtige tæller blev bestemt. Resultaterne udtrykkes som middel ± SD-log over CFU-numre pr. organ på forskellige tidspunkter efter inokulering. Asterisks indikerer Statistisk signifikans (* *, P < 0,01). B) bakterie belastninger over tid i milt og lever. To grupper af Balb/c-mus (n = 5/gruppe) var inficeret i. cist. med 5 x 105 CFU af enten Wild type Strain 93/4286 eller CSSA-defekt mutant. Dyr blev aflives 48 h efter infektion. Spleens og lever blev høstet, mekanisk homogeniseret, og levedygtige tæller blev bestemt. Resultaterne udtrykkes som log CFU-tal pr. organ. Vandrette søjler indikerer gennemsnitlige logs af bakterielle titre. Asterisks indikerer Statistisk signifikans (* * *, P < 0,001). Dette tal er blevet ændret fra Colicchio et al.25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskriver vi en forsøgsprotokol til at inducere meningokokmeningitis i voksne mus af i. cist. inokulering af meningokokbakterier. Til vores viden, ingen anden model af meningokokmeningitis er blevet udviklet i laboratorie mus inficeret af i. cist. rute tidligere er denne måde blevet udforsket for at give modeller af meningokokmeningitis i både rotte31 og kanin32. Det er velkendt, at den højeste sats af meningokoksygdom er fundet mellem små børn, unge og unge voksne33,34,35; af denne grund, i vores meningitis musemodel, i stedet for at fokusere på neonatal eller spædbørn dyr, 8 uger gamle immunkompetente dyr blev ansat.
I vores eksperimentelle model, besluttede vi at bruge i. cist. inokulum, da det sikrer, at meningokokker frigives direkte til Cisterna Magna , så bakteriel REPLIKERING i CSF fremmes. Denne inokulationsvej er fysiologisk mere tilgængelig28 og mindre traumatisk end den intrakraniale Sah rute, der allerede anvendes til udvikling af meningitis på grund af Streptococcus spp. 36af37. Selv om det ikke repræsenterer den naturlige måde for infektion af meningococcus, injektion af bakterier i dette område var medvirkende til induktion af meningokokmeningitis, som vist ved mus overlevelse, bakterier belastninger, kliniske parametre, og også ved Histologisk analyse24,25,26. Interessant, referencestamme 93/4286 induceret meningitis med histopatologiske funktioner efterligne dem observeret i sygdomme hos mennesker24,25,26.
For at etablere en standardiseret murine infektion og for at garantere forskernes sikkerhed, blev det foretrukket at starte fra en titreret frosset bestand af bakterier i stedet for en frisk bakterievækst24,25,30, 38, desuden, vi besluttede at bruge en sub-dødelig dosis af levende meningokokker med det formål at begrænse en hurtig dødelig udgang og tillade udvikling af hjerneskade2,24,25,26. For at bestemme en passende infektiøs dosis for forskellige stammer, skal der dog udføres indledende forsøg. I denne undersøgelse testede vi en serogruppe C referencestamme 93/4286 og en isogene mutant stamme 93/4286ΩCSSA med en dosis på 5 x 105 CFU/mus.
Selv om denne model ikke efterligner de indledende faser af kolonisering og invasion af meningococcus, den bakterielle isolat vokser godt ikke kun i CSF, men det er også i stand til at forblive i milten og leveren rum. Under hypoferremic fase af neisserial infektion, de fleste af heme-afledte jern forbliver kombineret med leveren ferritin. Da ferritin kan anvendes meningokokker til at opnå jern39, leveren udgør et målorgan for bakteriel replikation.
I denne forsøgsprocedure blev den indavlede Balb/c-musestamme anvendt til udskiftning af den outavlede CD-1-stamme, der oprindeligt var ansat til at udvikle meningokokmeningitis-modellen24. Udavlede mus var karakteriseret ved en bred genetisk variation, der kan være mere hensigtsmæssig til at afsløre flere effekter i en variabel kohorte, såsom den menneskelige befolkning40,41. Denne variabilitet kræver imidlertid en højere stikprøvestørrelse for at opnå tilstrækkelig Statistisk signifikans og kan forstyrre standardiseringen af procedurer og målrettede undersøgelser.
På trods af den smalle vært vifte af meningococcus, at sikre replikation af bakterier i murine vært og øge virulens af meningokokker, jern dextran blev administreret til dyr før infektionen6,14. Endelig, sammenlignet med andre eksperimentelle model af meningitis, dyr blev ikke behandlet med nogen antibiotika, for ikke at påvirke sygdomsforløbet og/eller profilen af den inflammatoriske respons26.
Til dato har vores undersøgelser fremhævet, at i. cist. model er funktionel til at inducere både meningitis og invasiv meningokoksygdom sammenlignet med IP-eller i.n.-modeller af infektion, som er karakteriseret ved forekomsten af sepsis og bakteriæmi før meningitis er etableret10,11 ,12,13,14,15,16,17. Derfor, denne infektion model baseret på induktion af meningitis i murine vært, kunne være nyttigt ikke kun at evaluere innovativ terapeutisk strategi for at forhindre bakteriel replikering direkte i CSF, men også til at analysere effekten af mulige passive immun behandling mod humane patogener.
Men meningokok infektion er en flertrinsproces, der omfatter nasopharynx kolonisering, adgang til blodbanen, passage af blod-hjerne barrieren og endelig ukontrolleret spredning i CSF, vores model kun gengiver nogle aspekter af meningokokinfektion, med henblik på at undergrave disse begrænsninger i en transgene dyremodel kan være nyttige til at efterligne den humane patogenese af meningokoksygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelserne blev delvis støttet af PRIN 2012 [tilskudsnummer 2012WJSX8K]: "Host-Microbe-interaktionsmodeller i slimhinde infektioner: udvikling af nye terapeutiske strategier" og af PRIN 2017 [2017SFBFER]: "en integreret tilgang til at tackle samspillet mellem klimatilpasning, stressende forhold og antimikrobiel resistens hos udfordrende patogener ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
