Denne protokollen bruker G6PI blandede peptider for å konstruere revmatoid artritt modeller som er nærmere den av menneskelig revmatoid artritt i CD4+ T celler og cytokiner. Høy renhet invariant naturlige killer T celler (hovedsakelig iNKT2) med spesifikke fenotyper og funksjoner ble oppnådd ved in vivo induksjon og in vitro rensing for adoptivimmunterapi.
Revmatoid artritt (RA) er en kompleks kronisk inflammatorisk autoimmun sykdom. Sykdomspatogenesen er relatert til invariant naturlige killer T (iNKT) celler. Pasienter med aktiv RA presenterer færre iNKT-celler, defekt cellefunksjon og overdreven polarisering av Th1. I denne studien ble det etablert en RA-dyremodell ved hjelp av en blanding av hGPI325-339 og hGPI469-483 peptider. INKT-cellene ble oppnådd ved in vivo induksjon og in vitrorensing, etterfulgt av infusjon i RA-mus for adoptivimmunterapi. In vivo bildesystem (IVIS) sporing viste at iNKT celler ble hovedsakelig distribuert i milt og lever. På dag 12 etter cellebehandling bremset sykdomsprogresjonen betydelig, de kliniske symptomene ble lindret, overflodav iNKT-celler i thymus økte, andelen iNKT1 i thymus redusert, og nivåene av TNF-α, IFN-γ og IL-6 i serumet redusert. Adoptivimmunterapi av iNKT-celler gjenopprettet balansen mellom immunceller og korrigert ei overdreven betennelse i kroppen.
Revmatoid artritt (RA) er en autoimmun sykdom preget av kronisk, progressiv invasivhet med 0,5–1 % insidens1,2. Den underliggende patogenesen tilskrives unormal spredning av autoreaktive CD4+ og CD8+ T-celler, manifestert av en økning i andelen CD4+IFN-γ+ og CD4+IL-17A+ T-celler, og redusert antall CD4+IL-4+ og CD4+CD25+FoxP3+ T-celler. Derfor øker sekresjonen av inflammatoriske cytokiner, og en overdreven inflammatorisk reaksjon ødelegger den innfødte balansen og toleransefunksjonen til kroppens immunsystem. Videre hjelperen T lymfocytter (Th) 1 celler som trenger inn i leddet forverre inflammatorisk respons og leddskade. Derfor er hemming av overdreven inflammatorisk respons og restaurering av immuntoleranse og immunbalanse nøkkelen til behandling av RA3,4.
INKT-cellene har både NK-celle- og T-cellefunksjoner og egenskaper. INKT-cellene har en distinkt, invariant T cellereseptor (TCR) α-kjede med begrenset TCR β-kjede repertoar5 og gjenkjenner glykolipidantigenet presentert av det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) klasse I molekyl CD1d på overflaten av antigenpresenterende celler. Mitsuo et al.6 oppdaget et stort antall iNKT-celler og funksjonsfeil i mange autoimmune sykdommer, inkludert RA. Aurore et al.7 viste at iNKT-celler har en positiv effekt på å opprettholde autoimmun toleranse, og at når antall et tall og funksjon av iNKT-celler gjenopprettes, lindres sykdommen. I tillegg fant Miellot-Gafsou et al.8 at iNKT-celler ikke bare avskaffet sykdommen, men også økte sykdomsprogresjonen. Disse motstridende resultatene tyder på at iNKT-celler er heterogene T-celler, og funksjonen til forskjellige undergrupper kan reverseres. I en klinisk studie av RA korrelerte hyppigheten av iNKT-celler med poengsummen av sykdomsaktiviteten9. Resultatene bekreftet også at frekvensen av iNKT ble redusert hos RA-pasienter, antall CD4+IFN-γ+ T celleundergrupper økte, og sekretoriske nivåer av inflammatoriske cytokiner IFN-γ og TNF-α økte10,11. I tillegg undersøkte Sharif et al.12 type 1 diabetes (T1D) og fant at selektiv infusjon av iNKT-celler oppregulerte uttrykket av inflammatorisk cytokin IL-4, opprettholdt immuntoleranse og forhindret utviklingen av type 1 diabetes. Derfor øker adoptivinfusjon av spesifikke iNKT-celler eller målrettet aktivering av iNKT-celler nivået av iNKT-celler hos RA-pasienter, noe som kan være et gjennombrudd i RA-behandling.
Cellulær immunterapi er for tiden av stor interesse og har blitt mye brukt i kreftbehandling. INKT-celler er imidlertid sjeldne, heterogene immunregulatoriske celler (bare 0,3% av det totale antallet PBMCer)13, som begrenser potensielle kliniske applikasjoner. Disse cellene er hovedsakelig delt inn i tre underpopulasjoner: 1) iNKT1 celler, som har et høyt uttrykk for promyelocytisk leukemi sink-finger protein (PLZF) og T-boks transkripsjonfaktor (T-bet); 2) iNKT2 celler med mellomliggende uttrykk for PLZF og GATA bindende protein 3 (GATA3); 3) iNKT17 celler med lavt uttrykk for PLZF og retinoid-relaterte foreldreløse kjernefysiskreseptor (ROR)-γt som skiller IFN-γ, IL-4, og IL-1714. Aktiverte iNKT-celler skiller ut Th1, Th2 og Th17-lignende cytokiner, som bestemmer de forskjellige immunmodulatoriske effektene av iNKT-celler15. Immunmodulerende og immunterapeutiske effekter av spesifikk aktivering av ulike underpopulasjoner av iNKT-celler er forskjellige. Derfor kan valg av spesifikke fenotyper av iNKT-celler (hovedsakelig iNKT2) med antiinflammatoriske funksjoner for å regulere immunresponsen i kroppen korrigere immunubalansen og immunsykdommer i RA.
Etableringen av en ideell dyremodell er av stor betydning for behandling og studier av RA patogenese. For tiden inkluderer de mest brukte og modne dyremodellene kollagenindusert artritt, adjuvant artritt, zymosan-indusert artritt og polysakkaridindusert artritt16–17. Det er imidlertid ingen modell som fullt ut kan simulere alle funksjonene i menneskelig RA. Type II kollagen-indusert artritt (CIA) er en klassisk leddgikt modell. CIA induseres av immunisering av mus med type II kollagenspesifikke monoklonale antistoffer, noe som gjenspeiler antistoffavhengigheten til denne sykdomsmodellen. Benurs et al. beskrev en modell med systemisk immunrespons mot glukose-6-fosfat isomerase (G6PI), som induserer perifer symmetrisk polyartritt hos mottakelige musestammer18,19. I denne modellen avhenger utviklingen av leddgikt på T-celler, B-celler og medfødt immunitet18,19,20. Horikoshi21 fant at RA-modeller som følge av immunisering av DBA/1 mus med G6PI polypeptidfragmenter er mer lik menneskelig RA når det gjelder CD4+ T-celler og cytokiner (dvs. IL-6 og TNF-α) enn CIA-modellene. For å øke den stimulerende effekten på TCR-gjenkjenningsstedet, ble de blandede polypeptidfragmentene av G6PI (hGPI325-339 og hGPI469-483) brukt til å immunisere DBA/1 mus for å konstruere RA-musemodellen. Suksessraten for denne tilnærmingen kan høy fordi hGPI325-339 og hGPI469-483 er immundominerende for I-A q-begrenset T celle respons. Derfor kan denne modellen simulere overproliferation av CD4+ T-celler og iNKT celledefekter hos RA-pasienter22. Den grunnleggende forskningen på RA immunopathology la grunnlaget for vår videre grundige undersøkelse.
iNKT-celler er spesielle T-celler som bygger bro medfødte og adaptive immunitet og er hovedsakelig utviklet fra CD4++/CD8+ tyteocytter. iNKT-celler har ulike immunregulatoriske funksjoner og samhandler med andre immunceller ved direkte kontakt og sekresjon av forskjellige cytokiner23,som påvirker dendrittiske celler (DCer), makrofager, nøytrofiler, B-celler, T-celler og NK-celledifferensiering og utvikling24…
The authors have nothing to disclose.
Vår studie ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Høyskoler og universitetets vitenskaps- og teknologiviktige forskningsprosjekt i Hebei-provinsen (ZD2017009) og Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Vi er takknemlige for deres støtte.
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
Columns | Miltenyi | MS | Germany |
Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |