Summary
مضخات efflux Xenobiotic نشطة للغاية في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) وتسبب قذف TMRM، صبغة الفلورسنت غشاء الميتوكوندريا المحتملة. هنا، نقدم بروتوكول لقياس بدقة إمكانات غشاء الميتوكوندريا في HSPCs من قبل TMRM في وجود فيراباميل، مثبط مضخة efflux.
Abstract
كما التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) التجديد الذاتي، وقد درست الأدوار المختلفة التي لعبتها الميتوكوندريا في التوازن المكونة للدم على نطاق واسع من قبل الباحثين HSC. وتنعكس مستويات نشاط الميتوكوندريا في إمكانات الغشاء (ΔM)، والتي يمكن قياسها بالأصباغ الموجبة المفترضة بالخلايا مثل TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). قدرة مضخات efflux لقذف هذه الأصباغ من الخلايا يمكن أن تحد من فائدتها، ومع ذلك. ويتسم تحيز القياس الناتج عن ذلك بأهمية بالغة عند تقييم مركبات HSCs، حيث أن الناقلين الزنيوبيين يظهرون مستويات أعلى من التعبير والنشاط في هذه المراكز مقارنة بالخلايا المتمايزة. هنا، ونحن نصف بروتوكول باستخدام فيراباميل، مثبط مضخة efflux، لقياس بدقة ΔM عبر مجموعات نخاع العظام متعددة. وتبين أن تثبيط نشاط المضخة الناتج عن ذلك يزيد من كثافة TMRM في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs)، مع تركها دون تغيير نسبي في الكسور الناضجة. وهذا يسلط الضوء على الاهتمام الوثيق بنشاط صبغ efflux المطلوب عند استخدام الأصباغ المعتمدة على ΔM، وكما هو مكتوب وتصور، يمكن استخدام هذا البروتوكول لمقارنة بدقة إما مجموعات مختلفة داخل نخاع العظام، أو نفس السكان عبر نماذج تجريبية مختلفة.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي تجديد ذاتي، متعددة القوة، وقادرة على أن تؤدي إلى جميع خلايا الدم1،2. التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي لصيانة HSC، جنبا إلىجنب مع العوامل النسخية، والإشارات الجوهرية والبيئة الدقيقة 3،4،5. وبالتالي فإن السيطرة السليمة على وظيفة الميتوكوندريا والجودة أمر بالغ الأهمية لصيانة HSC6،7.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔM) هي معلمة رئيسية في تقييم الميتوكوندريا لأنها تعكس مباشرة وظائفها، والتي تستمد من توازن نشاط ضخ البروتون في سلسلة نقل الإلكترون وتدفق البروتون من خلال F 1/ Fيا ATP synthase. هذه مطلوبة على حد سواء (اعتمادا على التعبير الجيني وتوافر الركيزة) للفسفورية المعتمدة على الأكسجين من ADP إلى ATP8،9. الاستفادة من الإلكترونات من مقصورة الميتوكوندريا، وقد وضعت الأصباغ الفعالة المختلفة لقياس ΔM. واحد منهم هو رباعي ميثيل رودادومين ميثيل استر بيركلورات (TMRM)، والتي استخدمت على نطاق واسع لقياس ΔM عن طريق قياس التدفق في مجموعة متنوعة من الخلايا10، بما في ذلك الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف11.
يجب استخدام الأصباغ الميتوكوندريا مع بعض الحذر في HSCs، ومع ذلك، لأن النشاط العالي لمضخات efflux xenobiotic من هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى النتوء صبغ12. في الواقع، وقد سمح قذف الأصباغ الميتوكوندريا مثل رودامين 123 للباحثين لعزل HSCs13 أو تحديد HSC "السكان الجانب" من خلال استغلال قذف تفاضلي من الأصباغ Hoechst الأزرق وهويشت الأحمر14، 15.وقد تبين أيضا أن Fumitremorgin C، مانع محددة من ATP ملزمة كاسيت الفرعية الأسرة G عضو 2 (ABCG2) الناقل، لا يؤثر على نمط تلطيخ MitoTracker في HSPCs16. بعد نشر هذه النتائج، أجريت دراسات متعددة باستخدام الأصباغ الميتوكوندريا في غياب مثبطات مضخة efflux xenobiotic، مما أدى إلى انطباع واسع النطاق أن HSCs لديها سوى عدد قليل من الميتوكوندريا مع ΔM منخفضة16 , 17 سنة , 18.
في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، ثبت أن فيراباميل، وهو مثبط طيف واسع من مضخات efflux، يعدل بشكل كبير نمط تلطيخ صبغ الميتوكوندريا ميتوتراكر الأخضر19. هذا التباين من المرجح أن يرجع إلى حقيقة أن Fumitremorgin C انتقائية للغاية لAbcg2، في حين أن HSCs أيضا التعبير عن ناقلات أخرى مثل Abcb1a (الذي هو حساسة ضعيفة فقط لFumitremorgin C)19. وقد أبلغنا أيضا أن الأصباغ الميتوكوندريا الأخرى، مثل TMRM، نونيل أكريدين البرتقال، وميتوتراكر أورانج (MTO) تظهر نفس أنماط ميتوتراكر الأخضر. والأهم من ذلك، لاحظنا أن أنماط تدفق السيتومتري من HSPCs تعكس ΔM الخاصة بهم بالإضافة إلى كتلة الميتوكوندريا11.
يعتمد تناول صبغTMRM بشكل صارم على الشحنة السلبية من الميتوكوندريا، ولكن تراكم الصبغة الناتج عن ذلك هو في توازن ثابت بين تناولها والتخليص بواسطة مضخات efflux20. الفرق في التعبير مضخة efflux xenobiotic بين HSCs وخلايا ناضجة السكان يؤثر على هذا التوازن ويمكن أن يؤدي إلى نتائج متحيزة. وينبغي النظر في استخدام مثبطات مخصصة مثل فيراباميل في تحليل ΔM بواسطة الأصباغ الجهد. هنا نقوم بوصف بروتوكول معدل لقياس ΔM دقيقة من قبل قياس التدفق القائم على TMRM الذي يصحح لنشاط الناقل xenobiotic من خلال استخدام مثبطات مخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. إعداد الحلول
- تلطيخ العازلة (الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) + 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS)): إضافة 10 مل من FBS في 500 مل من محلول PBS معقمة.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل في حالة معقمة. قبل البدء في الإجراءات التالية، وضع aliquot من هذا الحل (50 مل) على الجليد. - ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) اللعنالعازلة: وضع aliquot من ACK lysing العازلة (1 مل) على الجليد قبل بدء الإجراء.
ملاحظة: لإعداد نفس العازلة غير التجارية، حل 8.02 غرام من NH4Cl، 1 غرام من KHCO3 و 37.2 ملغ من Na2EDTA في 1 لتر من H2O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. يُحفظ لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة. - وسط الثقافة: إضافة 50 نانوغرام/مل عامل الخلايا الجذعية (SCF) و 50 نانوغرام /مل تجلط الدم (TPO) إلى وسط المصل خالية من الثقافة وتوسيع الخلايا المكونة للدم (انظر جدول المواد للوسط التجاري الموصى به).
- TMRM حل الأسهم: إعداد TMRM (1 μM) الحل عن طريق حل 5 ميكروغرام من مسحوق TMRM في 10 مل من الإيثانول. تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية محمية من الضوء.
- محلول مخزون فيراباميل: إعداد فيراباميل (50 مل) الحل عن طريق تخفيف 24 ملغ من فيراباميل في 1 مل من الإيثانول. تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية.
- حل المخزون FCCP: إعداد كاربونيلسيانيد ف-تريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازون (FCCP) (1 M) الحل عن طريق حل 254 ملغ في 1 مل من الإيثانول. تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية محمية من الضوء.
2. عزل نخاع العظام
- قتل الفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بعد المبادئ التوجيهية المؤسسية ورذاذ الفئران مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: هذه الخطوة يمنع تلوث الخلايا ذات الأهمية دون المساس بالنتائج التجريبية. - باستخدام زوج من الملقط ومقص حاد، وجعل القصاصة الصغيرة في الجلد البطني للماوس وتمتد الجلد.
- استخراج عظم الفخذ والساق مع الحرص على عدم خلع رؤوس عظم الفخذ لأنها تحتوي على كمية كبيرة من خلايا نخاع العظام. ضع العظام التي تمت إزالتها في لوحة من 6 آبار مليئة بـ 1.5 مل من البقعة التلطيخية.
ملاحظة: هذا الإجراء لا يتطلب منطقة معقمة. - إزالة العضلات من العظام وقطع نهايات العظام مما يسمح للخروج من نخاع العظام (الشكل1A). وضع العظام تنظيفها في آبار جديدة مع 1.5 مل من العازلة تلطيخ.
ملاحظة: يجب إزالة العضلات والأنسجة الأخرى بعناية لتجنب انسداد الحقنة في الخطوة التالية. - طرد نخاع العظام باستخدام حقنة 3 مل مع إبرة 25 G.
ملاحظة: الاستمرار في مسح نخاع العظام حتى تصبح العظام بيضاء (الشكل1B). - جمع جميع الخلايا في أنبوب 1.5 مل، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 180 × ز ثم تجاهل supernatant (الشكل1C).
- إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من الجليد الباردACK lysing العازلة بعناية فائقة، وضعت على الجليد لمدة 1 دقيقة وlysis غير نشط على الفور عن طريق إضافة 1 مل من العازلة تلطيخ. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 180 × ز.
ملاحظة: تظهر خلايا بيليه بيضاء (الشكل1D). العدد الإجمالي للخلايا المعزولة حوالي 2-4 × 107. - إعادة تعليق الكريات في 1 مل من البقعة تلطيخ ومرشح باستخدام غطاء مصفاة الخلية (12 × 75 مم2، 5 مل من القدرة) مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر أدرجت للحصول على الخلايا أحادية النووية. بعد حجب، والحفاظ على العينة على الجليد.
3. التلطيخ المناعي للكشف عن HSC
- إعداد السلالة (لين) كوكتيل. في 400 μL من المخزن المؤقت تلطيخ، إضافة 4 μL من الأجسام المضادة biotinilated التالية ضد CD3e، CD4، CD8، B220، CD11b، Gr1، Ter119، CD19، Nk1.1، IgM وIl7Ra للحصول على تخفيف النهائي 1:100.
- إعداد الأجسام المضادة المترافقة فلوروفورس (عبس). في 400 درجة مئوية من المخزن المؤقت تلطيخ، إضافة 4 ميكرولتر من Abs التالية للحصول على تخفيف النهائي 1:100. Streptavidin-Pacific الأزرق، Sca1-PE/Cy7، ج-كيت-APC/Cy7، CD48-APC، CD150-PerCP/Cy5.5 وCD34-FITC. يُحفظ في الثلج، محمياً من الضوء.
- الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 180 × ز، ثم تجاهل supernatant.
- إضافة 400 درجة مئوية من محلول كوكتيل لين إلى بيليه الخلايا. إضافة 4 ميكرولتر من CD135-biotinilated Ab. دوامة بسرعة لخلط وحضانة لمدة 30 دقيقة في الجليد.
- غسل العينة إضافة 3 مل من العازلة تلطيخ، تدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 180 × ز وتجاهل supernatant.
- إضافة 400 درجة مئوية من حل Abs. دوامة بسرعة لخلط وحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- غسل العينات مع 3 مل من العازلة تلطيخ، تدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 180 × ز وتجاهل supernatant.
4. TMRM تلطيخ
- إعداد TMRM حل تلطيخ. إضافة 2.2 ميكرولتر من محلول مخزون TMRM و1.1 ميكرولتر من فيراباميل (2 nM و 50 درجة مئوية كتركيز نهائي، على التوالي) في 1.1 مل من الوسط الخالي من المصل للثقافة وتوسيع الخلايا المكونة للدم (انظر جدول المواد للوسط التجاري الموصى به) مع TPO وSCF.
ملاحظة: وهذه هي أهم خطوة في البروتوكول. إضافة فيراباميل ضروري لمنع مضخات efflux التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في HSCs ويمكن قذف TMRM. - إعادة تعليق نخاع العظام في 1 مل من TMRM تلطيخ الحل، دوامة بسرعة وحضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب عدم غسل تلطيخ TMRM. كما يتم إعادة تعليق مراقبة التعويض المخصصة لـ PE في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ TMRM، وتخضع للحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية بعد دوامة سريعة. - تصفية العينة باستخدام غطاء مصفاة الخلية (12 × 75 مم2، 5 مل من السعة) مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر أدرجت لتجنب انسداد تدفق مقياس الخلايا.
ملاحظة: TMRM تلطيخ يزيد من إمكانية تشكيل تسد في العينة. ينصح بالترشيح للعينة قبل تدفق الاختبارات. - إضافة 1 ميكرولتر من 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لاستبعاد الخلايا الميتة عن طريق قياس التدفق.
5. الاستحواذ عن طريق مقياس التدفق
- تشغيل عينة نخاع العظام والحصول على ما لا يقل عن 1 × 106 الأحداث.
-
وضع استراتيجية التجشّز لتحديد مختلف السكان المكونةللدم (الشكل 2).
- عرض خلايا أحادية نووية حية نخاع العظم (BM-MNCs)، DAPI- كسر، في مؤامرة لالمحيط الهادئ الأزرق لتحديد CD135-لين- (لين-) ولين+ كسور.
- مؤامرة لين- كسر لAPC / Cy7 (ج كيت) مقابل PE / Cy7 (Sca-1) لتحديد الوفرة متعددة القوى (MPP) كسر، كما ج كيت+ وSca-1+ .
- رسم جزء MPP للناقلة (CD48) مقابل PerCP/Cy5.5 (CD150) لتحديد كسر HSC، كCD150+ و CD48- .
- عرض كسر HSC لـ FITC (CD34) لتقسيم CD34--HSC وCD34+-HSC.
- الحصول على كثافة TMRM (قناة PE) في كل مجموعة من السكان.
- بعد الاكتساب، أضف إلى العينة 1 ميكرولتر من FCCP للحصول على التركيز النهائي من 1 mM والحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم الحصول على 1 × 106 الأحداث.
ملاحظة: FCCP هو uncoupler الميتوكوندريا الذي يستخدم لتبديد ΔM. يتم استخدامه كتحكم تجريبي للتأكد من أن تلطيخ TMRM يعمل بشكل صحيح. بعد إدارة FCCP، ينبغي أن تنخفض كثافة TMRM بشكل كبير (الشكل3A). - تحليل البيانات التي تطبيع متوسط كثافة PE من كل السكان من خلال كثافة PE من جميع BM-MNCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح البروتوكول الموضح أعلاه العزل السهل للمركبات المتعددة الجنسيات من طراز M-MNCs من طراز الماوس. يلخص الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول: عزل العظام، وطرد نخاع العظام، وملطات خلايا الدم الحمراء، وتلطيخ الأجسام المضادة متبوعاً بتلطيخ TMRM لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في مجموعة محددة من الدم .
تحتوي الشركات المتعددة الجنسيات BM على العديد من مجموعات الخلايا، بما في ذلك مركبات HSCs. الكوكتيلات المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول راسخة في تنقية HSCs (CD34- وCD34+)، خلايا الذرية متعددة القوى (MPPs)، لين- وكذلك لين+ الخلايا، على التوالي 21. وترد استراتيجية التغرير لعزل هذه الكسور في الشكل 2.
وبعد تحديد السكان الذين تهمهم، جرى تقييم كثافة الحركة، التي ينبغي أن تظهر كإشارة مشرقة. TMRM تلطيخ في المصل خالية من التوسع المتوسطة (SFEM) ينصح بشدة، كما ملامح TMRM في HSPCs يمكن أن تخضع للتغيير عند تنفيذ تلطيخ في PBS +2٪ FBS (الشكل3A).
ويبين الشكل 3C متوسط كثافة كل مجموعة من السكان، وهو ما يتم تطبيعه بكثافة مركبات الكربون المتعددة الجنسيات. تم تغييرها في وجود فيراباميل (الشكل3B،C). تم الحصول على نتائج مماثلة من قبل مثبطات أخرى مثل السيكلوسبورين H (الشكل3C). وهكذا، يمكن قياس الكمية الدقيقة من TMRM المحملة في الميتوكوندريا من قبل ΔM بعد تثبيط مضخات efflux من قبل Verapamil أو Cyclosporin H (الشكل3C).
وأخيرا، يمكن استخدام FCCP للتحقق من دقة تلطيخ TMRM. FCCP إزالة الاستقطاب الميتوكوندريا، مما أدى إلى انخفاض في كثافة TMRM (الشكل3D). ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لتحديد كثافة الخلفية للتلطيخ و / أو كتحكم سلبي.
الشكل 1: المخطط الانسيابي للبروتوكول. ملخص رسومي لإجراء عزل ووصمة عار BM-MNCs لتحديد ΔM. يتم تمييز الخطوات الهامة بواسطة إدراج الصور(A-D). تم عزل عظم الفخذ والساق من الفئران C57BL/6الكبار وإزالة نهاياتها (A). العظام الطويلة كما هوالحال في A بعد طرد (B). معزولBM-MNCs قبل(C) وبعد (D) ACK lysis. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد التجشّع. التمثيل التخطيطي لاستراتيجية التجشائية لتحديد مختلف السكان المكونة للدم، بما في ذلك CD34-HSC وCD34+-HSC، MPP، لين- ولين+ الخلايا. تم تعديل اللوحات من بونورا، M. وآخرون11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل قياس التدفق للغشاء الميتوكوندريا المحتمل. (أ) التوزيع التمثيلي لΔM في HSCs ملطخة TMRM في PBS + 2٪ FBS (الأخضر) أو في المصل خالية من التوسع المتوسطة (SFEM) (الأحمر). (باء،جيم) التوزيع التمثيلي لΔM في CD34--HSC وLin- الخلايا (B) والتحديد الكمي لΔM في CD34--HSC، CD34+-HSC، MPP، Lin- وLin+ الخلايا (C)ملطخة TMRM في الوجود أو عدم وجود مثبطات مضخة efflux. وجرى تطبيع كثافة هذه التجمعات لكل من السكان بسبب كثافة الحركة من الناقلات المتعددة الجنسيات الخاصة بها (المعدلة من بونورا وM. وآخرون11). (د) الرسم البياني التمثيلي لتوزيع كثافة TMRM في HSCs قبل (الوردي) وبعد (الأزرق الفاتح) إضافة FCCP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قياس غشاء الميتوكوندريا المحتملة هو حجر الزاوية في تحليل وتقييم الميتوكوندريا، والتي هي حاسمة للحالة الأيضية للخلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتحليل ΔM من قبل TMRM تلطيخ. TMRM هو صبغة فلورية خلية permeant التي تتراكم في الميتوكوندريا النشطة بسبب ΔM، ومستويات كل منها لا تزال في التوازن بين المقصورات خارج الخلية، السيتوبلازمية والميتوكوندريا10. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع الأصباغ المختلفة، بما في ذلك رباعي ميثيل رودادومين، إستر الإيثيلي (TMRE) وJC-1. ظروف تلطيخ مناسبة حاسمة لتحقيق نتائج دقيقة. وتشمل هذه: الحماية من التعرض للضوء، والوقت المناسب للحضانة، والحفاظ على درجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) والتركيز خارج الخلية. عندما لم تصل مستويات صبغ TMRM بعد إلى توازن مثالي، يمكن الكشف عن تغييرات غير متوقعة في كثافة تلطيخ أثناء الحصول على البيانات في عملية قياس التدفق. ولذلك فإن فترة تلطيخ الموصى بها لTMRM هي 1 ساعة بدلاً من 30 دقيقة (كما هو مذكور في بروتوكول الشركة المصنعة TMRM واحد). ويقترح أيضا أن يتم الحصول على العينة مرتين على الأقل في غضون 5 دقائق من أجل مقارنة استقرار الصبغة.
خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول هو إعداد تطابق اللون فعالة بين الأجسام المضادة وصبغ. يمكن الكشف عن السكان المكونة للدم عن طريق قياس التدفق باستخدام علامات سطح راسخة21. استراتيجية التجمع الموصوفة هنا (الشكل2)متوافقة مع تلطيخ TMRM، ويسمح لقياس شدتها في مراحل التمايز المختلفة في وقت واحد. TMRM يطابق قناة PE، ولكن شدتها عادة ما تكون أضعف بكثير من تلك التي من الأجسام المضادة المترافقة مع PE (البيانات غير تظهر). وبما أن ذلك يمكن أن يؤثر على تعويض اللون، مما يسبب تحولات غير متوقعة في أطياف بعض السكان، ينبغي استخدام العينة التي تحتوي على تلطيخ TMRM كمراقبة تعويض لقناة PE.
والميزة الرئيسية للبروتوكول الحالي هي أنه يتيح إزالة تأثير مضخات الفعالة الزينوبيوتيك، التي يؤدي قذفها بكفاءة صبغTMRM إلى تعديل توازنها عبر غشاء البلازما وتراكم الميتوكوندريا. هذه خطوة حاسمة في التقييم الدقيق لوظيفة الميتوكوندريا HSC عن طريق امتصاص الصبغة. كما HSCs التعبير عن مضخات efflux أكثر نشاطا من الخلايا الملتزمة19، فيراباميل أو أدوية مماثلة ، مثل السيكلوسبورين H ، وCa2 +مستقلة مثبطات المقاومة للأدوية المتعددة22 (الشكل 3B-C)، ينبغي أن تستخدم في إجراء تلطيخ لHSCs لتقييم مستويات النشاط الميتوكوندريا بشكل أكثر دقة. لأن هذه المسألة الحرجة لم يتم الإشارة إليها إلا مؤخرا11،19 ولا تزال قيد المناقشة23،والهدف الرئيسي من هذا التقرير هو توفير بروتوكول سهل ومفصل من شأنها أن تساعد على توحيد إجراءات الحصول على بيانات قابلة للاستنساخ والحد من الاختلافات الظاهرة بين نتائج مجموعات البحوث المختلفة. يظهر البروتوكول هنا الموضح بالتفصيل كل خطوة، بما في ذلك الجرعات والتوقيت ووسائل الإعلام المحددة. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف ملامح TMRM في HSPCs تبعاً لوسطها (الشكل3A). وسيتطلب التحليل المفصل للآليات المعنية المزيد من الاستكشاف، ولكن بما أن وسيلة التوسع الخالية من المصل (SFEM) هي طريقة راسخة لثقافة HSC، يوصى بشدة بـ SFEM بدلاً من PBS عند إجراء تلطيخ TMRM للمركبات المنخفضة الدخل. وعلاوة على ذلك، فإن التقييم الدقيق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا الذي تجلى هنا من خلال تثبيط مضخات الفعالة يسلط الضوء على التطبيقات المستقبلية المحتملة لفيراباميل، فضلا عن الأصباغ الأخرى (مثل ميتوتراكر، ميتوسوكس)، في التحقيق في HSCs.
الأهم من ذلك، كثافة TMRM كما هو مبين من قبل قياس التدفق cytometry قد لا تعكس على وجه التحديد حجم الميتوكوندريا. يقيس قياس التدفق الخلوي كثافة الفلورة الكلية لكل خلية، ولكن توزيع الأصباغ الميتوكوندريا على الميتوكوندريا يعتمد على ΔM. ولذلك من الصعب تمييز ما إذا كانت المساهمة الحاسمة في قراءة TMRM مستمدة من ΔM أو حجم الميتوكوندريا11. وقد أكدنا أن MTO، واحدة من الأصباغ الأكثر استخداما لقياس كتلة الميتوكوندريا، يتأثر كل من ΔM ونشاط مضخة efflux. وقد لاحظنا أيضا أن فيراباميل يغير من كثافة MTO في مجموعات HSPC، ولكن لم تجد أي ارتباط بين كثافة MTO وحجم الميتوكوندريا11. وينبغي استخدام القياس المشترك لحجم الميتوكوندريا وΔM لتطبيع البيانات والقضاء على آثار إمكانات الغشاء، وينبغي إجراء المزيد من استكشاف محتوى الميتوكوندريا باستخدام تقنيات ΔM المستقلة.
وتشمل هذه التقنيات تحليل حجم 3D على أساس علامات الفلورسنت (على سبيل المثال، تلطيخ المناعة من البروتينات الميتوكوندريا)، المجهر الإلكتروني11،وكمية نسب الحمض النووي الميتوكوندريا / النووية. استخدام الأصباغ الميتوكوندريا (أي TMRM) في تركيبة مع مثبطات نظام efflux سوف يثبت بلا شك فائدة كبيرة في توضيح البيولوجيا الميتوكوندريا من خلال قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبر آيتو، ولا سيما K Ito وH Sato، ومعهد أينشتاين للخلايا الجذعية على التعليقات ومرافق قياس التدفق الخلوي والتصوير التحليلي (الممولة من المعهد الوطني للسرطان منحة P30 CA013330) ل المساعدة في إجراء التجارب. ويدعم K.I. من قبل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK98263, R01DK115577, و R01DK100689) ووزارة الصحة في ولاية نيويورك كمدير أساسي لعلم الجينوم أحادي الخلية /Epigenomics (C029154). K.I. Ito هو باحث في جمعية سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
