Summary
ゼノバイオティック流出ポンプは造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)において非常に活性であり、ミトコンドリア膜電位蛍光色素であるTMRMの押し出しを引き起こす。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルの存在下でTMRMによるHSPCにおけるミトコンドリア膜電位を正確に測定するプロトコルを提示する。
Abstract
細胞代謝は造血幹細胞(HSC)自己再生の重要な調節剤であるため、造血恒常性恒常性におけるミトコンドリアが果たした様々な役割は、HSCの研究者によって広範囲に研究されている。ミトコンドリア活性レベルは、膜電位(Δμm)に反映され、TMRM(テトラメチルロダミン、メチルエステル)などの細胞透過性カチオン染料によって測定することができる。しかし、これらの染料を細胞から押し出す流出ポンプの能力は、その有用性を制限することができます。結果として得られる測定バイアスは、XCを評価する際に特に重要であり、異種生物輸送体は分化細胞よりもHSCにおいて高いレベルの発現および活性を示す。ここでは、流出ポンプ阻害剤であるベラパミルを利用して、複数の骨髄集団にわたってΔを正確に測定するプロトコルについて述べる。ポンプ活性の結果生じる阻害は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるTMRM強度を増加させ、成熟分画では比較的変化しないままにすることが示されている。これは、Δm依存染料を使用する際に必要な色素流出活性に細心の注意を払っており、書き込みと視覚化に従って、このプロトコルを使用して、骨髄内の異なる集団または同じ集団を正確に比較するために使用できます。異なる実験モデル間で。
Introduction
造血幹細胞(HSC)は、自己更新、多能性、および血液1、2のすべての細胞を生み出すことができる。細胞代謝は、転写因子、固有シグナルおよび微小環境3、4、5と共に、HSC維持の主要な調節因子である。したがって、ミトコンドリアの機能と品質の適切な制御は、HSCメンテナンス6、7に不可欠です。
ミトコンドリア膜電位(Δ)は、ミトコンドリアの機能性を直接反映するミトコンドリアの評価において重要なパラメータであり、電子輸送鎖におけるプロトンポンプ活性の平衡とFを通るプロトン流量に由来する。1/FO ATP シンタゼス。これらはいずれも、ATP8,9に対するADPの酸素依存性リン酸化に対して(遺伝子発現および基質の利用可能性に応じて)必要である。ミトコンドリアコンパートメントの電子化を利用して、Δを測定するために様々なポテンショメトリック染料が開発されました。そのうちの一つは、テトラメチルロダミン過塩素酸メチルエステル(TMRM)であり、造血幹細胞および前駆細胞11を含む様々な細胞10におけるフローサイトメトリーによるΔμmの測定に広く用いられている。
ミトコンドリア染料は、しかし、これらの細胞の異種生体流出ポンプの高い活性が色素押出12をもたらす可能性があるため、HSCでいくつかの注意を払って使用する必要があります。実際、ローダミン123のようなミトコンドリア染料の押し出しは、研究者がHSC13を分離したり、染料のホエシュトブルーとホーチストレッド14の差動押出を利用してHSCの「側集団」を同定することを可能にしました。15.ATP結合カセットサブファミリーG部材2(ABCG2)トランスポーターの特定ブミグレジンCは、HSPC16におけるMitoTrackerの染色パターンに影響を与えないことも示されている。これらの結果の公表後、異種生物性流出ポンプ阻害剤が存在しない場合にミトコンドリア染料を用いて複数の研究を行い、HSCは低Δμm16のミトコンドリアの数が少ないという印象を広めました。,17歳,18.
しかし最近、流出ポンプの広いスペクトル阻害剤であるベラパミルが、ミトコンドリア染料MitoTracker Green19の染色パターンを有意に改変することが実証された。この不一致は、フミモルジンCがAbcg2に対して非常に選択的であるという事実に起因する可能性が高く、HSCはまた、Abcb1a(フミモルジンCに弱く敏感である)19などの他のトランスポーターを発現する。また、TMRM、ノニルアクリジンオレンジ、ミトトラッカーオレンジ(MTO)などの他のミトコンドリア染料は、ミトトラッカーグリーンと同じパターンを示しています。さらに重要なことは、HSPCの流れサイトメトリックパターンがミトコンドリア質量11に加えてΔを反映していることを観察した。
TMRM色素の摂取量は、ミトコンドリアの負電荷に厳密に依存するが、結果として生じる色素の蓄積は、流出ポンプ20によるその摂取量とクリアランスとの間で一定のバランスにある。HSCと成熟細胞集団との間の異性生物性流出ポンプ発現の違いは、このバランスに影響を与え、偏った結果につながる可能性があります。ベラパミルなどの専用阻害剤の使用は、強力な染料によるΔmの分析において考慮されるべきである。ここでは、専用阻害剤を用いて異種生物生トランスポーター活性を補正するTMRMベースのフローサイトメトリーによる正確なΔm測定のための改変プロトコルについて説明する。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、アルバート・アインシュタイン医科大学の機関動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. ソリューションの準備
- 染色バッファー(リン酸緩衝生理食塩基質(PBS)+2%胎児ウシ血清(FBS)):無菌PBS溶液の500mLにFBSの10 mLを追加します。
注:この溶液は、無菌状態で少なくとも1ヶ月間4°Cで保存することができる。次の手順を開始する前に、この溶液のアリコート(50 mL)を氷の上に置きます。 - ACK(塩化アンモニウム-カリウム)のライシングバッファー:手順を開始する前に、氷上にACKライシングバッファー(1 mL)のアリコートを置きます。
注:同じ非市販バッファーを調製するには、NH4Cl の 8.02 g、KhCO3の 1 g、および Na2EDTA の 37.2 mg を H2O の 1 L で溶解し、pH を 7.2-7.4 に調整します。室温で最大6ヶ月間保管してください。 - 培養培地:造血細胞の培養および増殖のための無血清培地に50 ng/mL幹細胞因子(SCF)および50 ng/mLトロンボポエチン(TPO)を添加する(市販培地推奨材料表参照)。
- TMRMストック溶液:エタノールの10 mLにTMRM粉末の5 μgを溶解することにより、TMRM(1 μM)溶液を調出します。この溶液は、光から保護された-20 °Cで保存します。
- ベラパミルストック溶液:エタノールの1mLでベラパミルの24mgを希釈することにより、ベラパミル(50mM)溶液を調調します。この溶液を-20°Cに保存します。
- FCCPストック溶液:エタノールの1mLで254mgを溶解することにより、炭酸シアン化物p-トリフルロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)(1M)溶液を調製する。この溶液は、光から保護された-20 °Cで保存します。
2. 骨髄分離
- 制度ガイドラインに従ってCO2吸入によりマウスを安楽死させ、70%エタノールでマウスにスプレーする。
注:このステップは実験結果を損なうことなく目的の細胞の汚染を防ぐ。 - 鉗子と鋭いはさみを使用して、マウスの腹部の皮膚に小さなスニップを作り、皮膚を伸ばします。
- 大腿骨と脛骨を抽出し、骨髄細胞を大量に含む大腿骨の頭部を外さないように注意してください。取り除いた骨を1.5 mLの染色バッファーで満たされた6ウェルプレートに入れます。
注:このプロシージャは生殖不能区域を要求しない。 - 骨から筋肉を取り除き、骨の両端を切り取り、骨髄の出口を可能にする(図1A)。洗浄された骨を1.5mLの染色バッファーで新しい井戸に入れなさい。
注:筋肉や他の組織は、次のステップで注射器の詰まりを避けるために慎重に除去する必要があります。 - 25Gの針で3 mL注射器を使用して骨髄を洗い流します。
注:骨が白くなるまで骨髄を洗い流し続けます(図1B)。 - 1.5 mLチューブ内のすべての細胞を集め、180 x gで5分間遠心分離機を回収し、上清を廃棄する(図1C)。
- 300μLの氷冷ACKライシングバッファーでペレットを再懸濁し、1mLの染色バッファーを添加して氷上に1分間置き、直ちに不活性なライシスを加える。180 x gで5分間遠心分離機。
注:細胞ペレットは白く見えます(図1D)。単離された細胞の総数は約2-4 x 107である。 - セルストレーナーキャップ(12 x 75 mm 2、5 mL)を用いて1mLの染色バッファーとフィルターでペレットを再ステージングし、35μmナイロンメッシュを組み込んで単核細胞を得た。ブロッキング後、サンプルを氷の上に保管します。
3. HSC検出のための免疫染色
- リネージュ(リン)カクテルを準備します。染色バッファーの400μLで、CD3eに対して以下のビオチニル化抗体の4μLを加え、CD4、CD8、B220、CD11b、Gr1、Ter19、CD19、Nk1.1、IgMおよびIl7Raを最終希釈1:100を得る。
- 蛍煙素共役抗体(Abs)を調製する。染色バッファーの400μLで、以下のAbsの4μLを加えて最終希釈1:100を得る。ストレプトアビジンパシフィックブルー、Sca1-PE/Cy7、c-kit-APC/Cy7、CD48-APC、CD150-PerCP/Cy5.5およびCD34-FITC。光から守り、氷の中に入れなさい。
- 180 x gで5分間サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットに400μLのリンカクテル溶液を添加する。CD135-ビオチニレートされたAb.Vortexの4 μLを素早く加え、氷の中で30分間混合し、インキュベートします。
- 染色バッファーの3 mLを加えてサンプルを洗浄し、180 x gで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。
- Abs溶液の400 μLを追加します。渦は、氷の上で30分間混合し、インキュベートするために迅速に。
- 3 mLの染色バッファーでサンプルを洗浄し、180 x gで5分間スピンダウンし、上清を廃棄します。
4. TMRM染色
- TMRM染色液を調出す。TMRMストック溶液の2.2 μLとベラパミルの1.1 μL(それぞれ最終濃度として2nMおよび50 μM)を、培養および血清細胞の膨張のための無血清培地の1.1 mLにTPOを加える(市販培地推奨材料表参照)と SCF。
注:これはプロトコルの最も重要な手順です。ベラパミル添加は、HSCで高度に発現し、TMRMを押し出すことができる流出ポンプをブロックするために必要です。 - TMRM染色溶液の1mLで骨髄を再中断し、ボルテックスを迅速に、37°Cで1時間インキュベートする。
注:TMRM染色は洗い流してはならない。PE専用補償制御もTMRM染色溶液の100μLで再懸濁し、迅速な渦後37°Cで1時間インキュベーションを行った。 - フローサイトメーターの目詰まりを避けるために組み込まれた35 μmナイロンメッシュを使用して、セルストレーナーキャップ(12 x 75 mm 2、5 mL)を使用してサンプルをフィルタリングします。
注:TMRM染色は、試料中の詰まり形成の可能性を増加させる。流れアッセイの直前のサンプルの濾過をお勧めします。 - 4',6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)の1 μLを加え、フローサイトメトリーによって死細胞を排除する。
5. フローサイトメーターによる取得
- 骨髄サンプルを実行し、少なくとも 1 x 106 イベントを取得します。
-
異なる人工集団を識別するためにゲーティング戦略を設定します (図2)。
- 生きた骨髄単核細胞(BM-MNC)、DAPI−画分、CD135−リン−(Lin−)およびLin+画分を同定するための太平洋青色のプロットで表示する。
- プロットリン- APC/Cy7(c-kit)対PE/Cy7(Sca-1)の分数をプロットし、多能性前駆子(MPP)画分をc-kit+およびSca-1+として識別する。
- APC (CD48) 対 PerCP/Cy5.5 (CD150) の MPP 分率をプロットして、HSC 分数を CD150+および CD48-として識別します。
- CD34-HSC と CD34+-HSC を分割するには、FITC (CD34) の HSC 分数を表示します。
- 各母集団で TMRM 強度(PE チャネル)を取得します。
- 得後、1mMの最終濃度を得るためにFCCPのサンプル1 μLを加え、37°Cで5分間インキュベートし、1 x 106イベントを取得します。
注:FCCPは、Δを散逸するために使用されるミトコンドリアアンカプラーです。TMRM染色が正しく機能することを確認するための実験制御として使用されます。FCCPの投与後、TMRM強度を大幅に低下する必要があります(図3A)。 - すべての BM-MNC の PE の強度によって各母集団の PE の平均強度を正規化するデータを分析します。
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Representative Results
上記のプロトコルは、マウスモデルからBM-MNCを容易に分離することを可能にする。図1は、骨分離、骨髄の洗い流し、赤血球溶解、抗体染色、それに続くTMRM染色をまとめ、特定の血清集団におけるミトコンドリア膜電位を測定する。.
BM-MNC には、HSC を含む複数のセル母集団が含まれています。このプロトコルで使用される抗体カクテルは、HSC(CD34−およびCD34+)、多能性前駆細胞(MMP)、Lin−ならびにLin+細胞、それぞれ21の精製において十分に確立されている。 これらの分数を分離するためのゲーティング戦略を図 2に示します。
対象の集団を同定した後、明るい信号として現れるはずのTMRM強度を評価した。血清フリー膨張媒(SFEM)におけるTMRM染色は、PBS +2%FBS(図3A)で染色を行うと、HSPCのTMRMプロファイルが変化する可能性があるため、強く推奨されます。
図3Cは、BM-MNCの強度によって正規化された各集団の平均強度を示す。ベラパミル(図3B、C)の存在下で変更されました。同様の結果は、シクロスポリンH(図3C)などの他の阻害剤によって得られた。従って、ΔmによるミトコンドリアにロードされたTMRMの正確な量は、ベラパミルまたはシクロスポリンH(図3C)による流出ポンプの阻害後に測定することができる。
最後に、FCCPを使用してTMRM染色の精度を確認することができます。FCCPはミトコンドリアを脱分極し、TMRM強度の低下をもたらす(図3D)。このアプローチは、染色の背景強度や負のコントロールとしても使用できます。
図 1: プロトコル フローチャート。BM-MNCを分離および染色する手順のグラフィカル要約を作成し、Δを決定する。重要なステップは、画像インサート(A-D)によって強調表示されます。成体C57BL/6マウス由来の大腿骨および脛骨を単離し、その両端を除去した(A)。洗い流した後のAのように長い骨(B)。(C)の前と後(D)ACKリシスの前に分離されたBM-MNC。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ゲーティングの設定。CD34--HSCおよびCD34+-HSC、MPP、リン−およびリン+細胞を含む異なる血行系集団を同定するためのゲーティング戦略の概略表現。パネルはボノラから変更された M. ら11.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ミトコンドリア膜電位のフローサイトメトリー解析(A) PBS+2%FBS(緑)または無血清膨張媒(SFEM)(赤色)でTMRMで染色されたHSCにおけるΔμmの代表的な分布。(B, C)CD34におけるΔの代表的な分布--HSCおよびLin-細胞(B)およびCD34におけるΔの定量化−-HSC、CD34+-HSC、MPP、リン-およびリン+細胞(C)が存在するTMRMで染色されたまたは流出ポンプ阻害剤の不在。各集団のTMRM強度は、自身のBM-MNCのTMRM強度によって正規化された(ボノーラ、M.ら11から改変)。(D) FCCP添加前(ピンク)及び後(水色)のHCにおけるTMRM強度分布の代表ヒストグラム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ミトコンドリア膜電位測定は、細胞の代謝状態に重要なミトコンドリアの分析と評価の基礎である。ここでは、TMRM染色によるΔの分析のためのプロトコルについて説明する。TMRMは、Δに起因する活性ミトコンドリアに蓄積する細胞透過性蛍光色素であり、そのそれぞれのレベルは、細胞外、細胞質およびミトコンドリア区画10の間の平衡状態のままである。このプロトコルは、テトラメチルロダミン、エチルエステル(TMRE)およびJC-1を含む様々な染料に適合させることができる。適切な染色条件は、正確な結果を達成するために重要です。これらには、光暴露からの保護、適切なインキュベーション時間、一定温度(37°C)および細胞外濃度の維持が含まれます。TMRM色素レベルがまだ完全な平衡に達していない場合、フローサイトメトリープロセスにおけるデータ取得中に染色強度の予期しない変化を検出することができます。したがって、TMRMの推奨染色期間は30分ではなく1時間です(1つのTMRMメーカーのプロトコルで述べたように)。また、色素の安定性を比較するために、サンプルを5分以内に少なくとも2回取得する必要があることも示唆される。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、抗体と色素間の効率的な色の一致の設定です。ヘマトポエティック集団は、確立された表面マーカー21を用いたフローサイトメトリーによって検出することができる。ここで説明するゲーティング戦略(図2)は、TMRM染色と互換性があり、異なる分化段階での強度の測定を同時に可能にします。TMRMはPEチャネルと一致するが、その強度は通常、PEと結合した抗体の強度よりもはるかに弱い(データは示されていない)。これは色補償に影響を与え、一部の集団のスペクトルに予期しないシフトを引き起こす可能性がありますので、TMRM染色を持つサンプルはPEチャネルの補正制御として使用する必要があります。
現在のプロトコルの主な利点は、TMRM色素の効率的な押出が血漿膜全体の平衡とミトコンドリア蓄積の両方を修飾する異種生物性流出ポンプの効果の除去を可能にすることです。これは、色素吸収によるHSCミトコンドリア機能の正確な評価における重要なステップである。HSCがコミット細胞19よりも活性流出ポンプを発現するにつれて、ベラパミルまたはシクロスポリンH、Ca2+-無依存多剤耐性阻害剤22(図3B-C)などのベラパミルまたは類似の薬物は、より正確にミトコンドリア活性のレベルを評価するためにHSCのための染色手順。この重大な問題は、最近11、19に指摘され、まだ議論23であるので、このレポートの主な目的は、手順を標準化するのに役立つ簡単で詳細なプロトコルを提供することです再現可能なデータを取得し、異なる研究グループの結果間の明らかな不一致を減らします。ここで説明するプロトコルは、用量、タイミングおよび特定の媒体を含む各ステップを詳細に示す。たとえば、HSPC の TMRM プロファイルは、その媒体によって異なる場合があります (図 3A)。関連するメカニズムの詳細な分析は、さらなる探索が必要ですが、無血清膨張培地(SFEM)はHSC培養のための確立された方法であるため、HSC用TMRM染色を行う際には、PBSではなくSFEMが強く推奨されます。さらに、流出ポンプの阻害を通じてここで実証されたミトコンドリア膜電位の正確な評価は、ベラパミルおよび他の染料(例えば、MitoTracker、MitoSOX)の将来の応用の可能性を強調する。HSC
重要なことに、フローサイトメトリーによって示されるTMRM強度は、ミトコンドリア体積を正確に反映しない場合がある。フローサイトメトリーは細胞当たりの総蛍光強度を測定しますが、ミトコンドリアへのミトコンドリア色素の分布はΔmに依存します。したがって、TMRM 読み取りへの重要な寄与が Δ のボリューム 11 またはミトコンドリア ボリューム11に由来するかどうかを識別することは困難です。ミトコンドリア質量の測定に最も頻繁に使用される染料の1つであるMTOがΔmと流出ポンプ活性の両方の影響を受けることを確認しました。我々はまた、ベラパミルがHSPC集団におけるMTOの強度プロファイルを変化させるが、MTO強度とミトコンドリア体積11との間に相関関係を見出していないことも観察した。ミトコンドリア体積とΔμmを組み合わせてデータを正規化し、膜電位の影響を排除し、ミトコンドリア含有量のさらなる探索はΔに依存しない技術を用いて行うべきである。
このような技術には、蛍光マーカー(例えば、ミトコンドリアタンパク質の免疫染色)、電子顕微鏡検査11、およびミトコンドリア/核DNA比の定量に基づく3D体積分析が含まれる。流出系阻害剤と組み合わせたミトコンドリア染料(すなわち、TMRM)の使用は、フローサイトメトリーを通じたミトコンドリア生物学の解明に大きな利益をもたらすことは間違いありません。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、伊藤研究室、特に伊藤健・佐藤H、アインシュタイン幹細胞研究所のコメントとアインシュタイン流動細胞法および分析イメージングコア施設(国立がん研究所助成金P30 CA013330)の全メンバーに感謝します。実験を行うのを助ける。K.I.は、国立衛生研究所(R01DK98263、R01DK115577、R01DK100689)およびアインシュタイン単一細胞ゲノミクス/エピゲノミクス(C029154)のコアディレクターとしてニューヨーク州保健省からの助成金によってサポートされています。伊藤さんは白血病・リンパ腫学会の研究員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
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