Summary
异种生物排泄泵在造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中高度活跃,并导致TMRM(线粒体膜潜在荧光染料)的挤出。在这里,我们提出了一个协议,以准确测量线粒体膜电位在HSPC与TMRM的存在,Verapamil,一个排泄泵抑制剂。
Abstract
由于细胞代谢是造血干细胞(HSC)自我更新的关键调节剂,因此HSC研究人员对线粒体在造血平衡中所起的各种作用进行了广泛的研究。线粒体活性水平反映在其膜电位 (μm) 中,可以通过细胞渗透阳离子染料(如 TMRM(四甲基二甲胺、甲基酯)进行测量。然而,排流泵从细胞中挤出这些染料的能力会限制其效用。在评估 HSC 时,由此产生的测量偏差尤为重要,因为异种生物转运剂在 HSC 中表现出比分化细胞更高的表达和活性水平。在这里,我们描述了一个利用Verapamil(一种排泄泵抑制剂)来精确测量多个骨髓群的μm的协议。由此产生的泵活性抑制表明,增加造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的TMRM强度,同时在成熟馏分中保持相对不变。这突出表明,在使用_m依赖染料时,需要密切注意染料-排泄物活性,并且根据编写和可视化,此协议可用于准确比较骨髓内的不同种群或同一种群跨越不同的实验模型。
Introduction
造血干细胞(HSCs)是自我更新的,多能的,能够产生血液1,2的所有细胞。细胞代谢是HSC维持的关键调节器,与转录因子、内在信号和微环境3、4、5一起。因此,正确控制线粒体功能和质量对HSC维护至关重要。
线粒体膜电位(μm)是线粒体评估的关键参数,因为它直接反映了线粒体的功能,它来自电子传输链中的质子泵送活性平衡和通过F的质子流1/FO ATP 合成酶。这两者都是ADP至ATP8、9氧依赖磷酸化所必需的(取决于基因表达和基质可用性)。利用线粒体室的电子性,开发了各种电位染料来测量μm。其中之一是四甲胺甲基酯高氯酸盐(TMRM),已被广泛用于测量+m通过流动细胞测定在各种细胞10,包括造血干细胞和祖细胞11。
线粒体染料在HSC中必须谨慎使用,但是,因为这些细胞的异种生物排泄泵的高活性可能导致染料挤出12。事实上,线粒体染料(如罗达明123)的挤出已经使研究人员能够分离HSCs13,或者通过利用染料Hoechst Blue和Hoechst Red14的差分挤出来识别HSC"侧群"。15.还表明,Fumitremorgin C,ATP绑定盒式子家族G成员2(ABCG2)传输器的特定阻滞剂,不影响HSPCs16中MitoTracker的染色模式。这些结果公布后,在没有异种生物体排泄泵抑制剂的情况下,使用线粒体染料进行了多项研究,导致人们普遍的印象是,HSC只有少量线粒体,低μm16,17,18.
然而,最近,它证明,Verapamil,一个宽谱抑制剂的排泄泵,显著改变了线粒体染料MitoTracker绿色19的染色模式。这种差异可能是由于Fumitremorgin C对Abcg2具有高度选择性,而HSCs也表示其他运输工具,如Abcb1a(它只对富米震金C敏感度弱)19。我们还报告说,其他线粒体染料,如TMRM、诺尼阿克里丁橙和米托斯特橙(MTO)表现出与Mitotracker Green相同的图案。更重要的是,我们观察到,除了线粒体质量11之外,HSPC的流细胞学模式也反映了它们的μm。
TMRM染料的摄入量严格取决于线粒体的负电荷,但染料的积累在摄入和排空泵20间隙之间保持恒定平衡。HSC和成熟细胞群之间异种生物排泄泵表达的差异会影响这种平衡,并可能导致有偏差的结果。在分析电位染料时,应考虑使用专用抑制剂,如Verapamil。在这里,我们描述了一个改进的协议,用于通过基于TMRM的流式细胞测定进行精确μm测量,该该协议通过使用专用抑制剂纠正异种生物运输者活性。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
1. 准备解决方案
- 染色缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)= 2%胎儿牛血清(FBS):在无菌PBS溶液的500mL中加入10mL的FBS。
注:此溶液可在4°C下在无菌条件下储存至少一个月。在开始以下步骤之前,将此溶液的等分 (50 mL) 放在冰上。 - ACK(氯化铵-钾)溶化缓冲液:在开始手术前在冰上放置一个ACK溶化缓冲液(1 mL)的等分。
注:为了准备相同的非商业缓冲液,在H2O的1 L中溶解8.02克NH4Cl、1g KHCO3和37.2mg Na2EDTA。将pH-调节为7.2-7.4。在室温下储存长达6个月。 - 培养基:在无血清培养基因中加入50纳克/mL干细胞因子(SCF)和50纳克/mL血栓形成素(TPO),用于造血细胞的培养和扩张(见推荐商用培养基物质表)。
- TMRM库存溶液:通过在10 mL乙醇中溶解5μgTMRM粉末制备TMRM(1μM)溶液。将此解决方案存放在-20°C,防止光线照射。
- Verapamil 库存溶液:通过在 1 mL 乙醇中稀释 24 毫克的 Verapamil 溶液来制备 Verapamil (50 mM) 溶液。此解决方案存储在 -20°C。
- FCCP库存溶液:通过在1mL乙醇中溶解254毫克,制备碳化氰化物p-三氟化苯甲酰乙酰乙酮(FCCP)(1M)溶液。将此解决方案存放在-20°C,防止光线照射。
2. 骨髓隔离
- 按照机构指南,通过CO2吸入使小鼠安乐死,并喷洒70%乙醇。
注:此步骤可防止感兴趣的细胞受到污染,同时不影响实验结果。 - 使用一对钳子和锋利的剪刀,在鼠标的腹腔皮肤做一个小剪子,并伸展皮肤。
- 提取股骨和头骨,同时注意不要移开股骨的头部,因为它们含有大量的骨髓细胞。将取出的骨头放入装有 1.5 mL 染色缓冲液的 6 孔板中。
注:此过程不需要无菌区域。 - 从骨骼中取出肌肉,切下骨骼的末端,允许骨髓排出(图1A)。将清洁的骨头放入带有 1.5 mL 染色缓冲液的新井中。
注:下一步必须小心去除肌肉和其他组织,以避免注射器堵塞。 - 使用 3 mL 注射器用 25 G 针头冲洗骨髓。
注:继续冲洗骨髓,直到骨骼变白(图1B)。 - 将所有细胞收集到1.5 mL管中,在180 x g下离心5分钟,然后丢弃上清液(图1C)。
- 在300 μL的冰冷ACK赖清缓冲液中重新悬浮颗粒,在冰上放置1分钟,通过添加1 mL染色缓冲液立即停止进行赖清。在180 x g下离心5分钟。
注:细胞颗粒呈白色 (图 1D)。分离的细胞总数约为2-4 x 107。 - 使用细胞滤网帽(12 x 75 mm2,5 mL 的容量)将颗粒重新悬浮在 1 mL 的染色缓冲液中,并使用 35 μm 尼龙网进行过滤,以获得单核细胞。堵住后,将样品保存在冰上。
3. 用于HSC检测的免疫染色
- 准备血统(林)鸡尾酒。在400μL染色缓冲液中,对CD3e、CD4、CD8、B220、CD11b、Gr1、Ter119、CD19、Nk1.1、IgM和Il7Ra添加4μL以下生物镀金抗体,以获得1:100的最终稀释。
- 制备荧光荧光合结抗体(Abs)。在400μL的染色缓冲液中,加入4μL的以下Abs,以获得1:100的最终稀释。链球菌-太平洋蓝、Sca1-PE/Cy7、c-套件-APC/Cy7、CD48-APC、CD150-PerCP/Cy5.5和CD34-FITC。保存在冰中,防止光线照射。
- 在180 x g下将样品离心5分钟,然后丢弃上清液。
- 在细胞颗粒中加入400μL的林鸡尾酒溶液。加入4μL的CD135-生物镀锡Ab.Vortex快速混合和孵育30分钟的冰。
- 清洗样品加入3 mL的染色缓冲液,在180 x g下旋转5分钟,然后丢弃上清液。
- 加入400μL的Abs溶液。涡旋快速混合和孵育30分钟的冰上。
- 用3 mL的染色缓冲液清洗样品,在180 x g下旋转5分钟,然后丢弃上清液。
4. TMRM 染色
- 准备TMRM染色溶液。使用TPO在1.1 mL的无血清培养基培养和扩张造血细胞(参见推荐商用介质的材料表)中加入2.2 μL的TMRM库存溶液和1.1μL的Verapamil(分别为2 nM和50μM作为最终浓度)和 SCF。
注:这是协议最重要的一步。需要添加 Verapamil 来阻挡在 HSC 中高度表达的排流泵,并可以挤出 TMRM。 - 在1mL的TMRM染色溶液中重新悬浮骨髓,快速涡旋,在37°C下孵育1小时。
注:TMRM 染色不能洗掉。PE专用补偿控制也重新悬浮在100μL的TMRM染色溶液中,并在快速涡流后在37°C下孵育1小时。 - 使用细胞滤帽(12 x 75 mm 2,容量为 5 mL)过滤样品,并采用 35 μm 尼龙网,以避免流量细胞仪堵塞。
注:TMRM 染色增加了样品中堵塞形成的可能性。建议在流量检测前过滤样品。 - 加入1 μL的4',6-二酰胺-2-苯林多尔(DAPI),以流动细胞测定排除死细胞。
5. 流量摄位仪的采集
- 运行骨髓样本并获取至少 1 x 106事件。
-
设置浇注策略,以确定不同的造血种群(图2)。
- 显示活骨髓单核细胞 (BM-MNIC),DAPI=分数,在图中为太平洋蓝识别 CD135+Lin+ (Lin=) 和 Lin=分数。
- 绘制 Lin= APC/Cy7 (c-kit) 与 PE/Cy7 (Sca-1) 的分数,以识别多能祖细胞 (MPP) 分数,作为 c-工具包+和 Sca-1=。
- 绘制 APC (CD48) 与 PerCP/Cy5.5 (CD150) 的 MPP 分数图,以识别 HSC 分数,为 CD150+和 CD48=。
- 显示 FITC (CD34) 的 HSC 分数,以划分 CD34+-HSC 和 CD34+-HSC。
- 获取每个总体中的 TMRM 强度 (PE 通道)。
- 采集后,加入FCCP的样品1μL,获得1mM的最终浓度,并在37°C孵育5分钟,然后获得1 x 106事件。
注:FCCP 是一种线粒体解耦合器,用于消散 μm。它用作实验控制,以确认TMRM染色工作正常。FCCP使用后,TMRM强度应大幅降低(图3A)。 - 分析数据,根据所有BM-MNC的PE强度,对每个人群的PE平均强度进行规范化。
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Representative Results
上述协议使 BM-MNC 易于从鼠标模型隔离。图1总结了该方案的主要步骤:骨分离、冲出骨髓、红细胞裂解和抗体染色,然后是TMRM染色,以测量特定造血人群的线粒体膜电位.
BM-MNIC包含若干细胞群,包括HC。该协议中使用的抗体鸡尾酒在HSCs(CD34+和CD34+)、多能祖细胞(MPPs)、Lin+以及Lin+细胞的纯化方面已经成熟,分别为21。 隔离这些分数的浇注策略如图2所示。
在确定感兴趣的人群后,评估了TMRM强度,这应作为一个明亮的信号出现。强烈建议在无血清扩张介质 (SFEM) 中进行 TMRM 染色,因为当在 PBS +2% FBS 中进行染色时,HSPC 中的 TMRM 型材可能会发生改动(图 3A)。
图3C显示了每个种群的平均强度,这是由BM-MNCs的强度归一化。 HC表示,能够挤出TMRM染料20的异种生物排泄泵的活动水平很高,事实上,我们在HSPC中找到了TMRM型材在Verapamil的存在下改变了(图3B,C)。其他抑制剂如环孢菌素H(图3C)也获得了类似的结果。因此,在Verapamil或CyclosporinH抑制efflux泵后,可以测量在线粒体中加载的TMRM的准确量(图3C)。
最后,FCCP可用于验证TMRM染色的准确性。FCCP去极化线粒体,导致TMRM强度降低(图3D)。此方法还可用于确定染色的背景强度和/或作为负控制。
图 1:协议流程图。隔离和染色 BM-MNC 以确定 μm 的过程的图形摘要。关键步骤通过图片插入 (A-D) 突出显示。分离出成年C57BL/6小鼠的食鼠和头骨,并去除其末端(A)。长骨像在A后冲出 (B).(C) 和之后分离的 BM-MDC (D) ACK 莱沙.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:浇注设置。门控策略的原理表示,以识别不同的造血种群,包括 CD34+-HSC 和 CD34=-HSC、MPP、林+和林+细胞。这些小组是从博纳拉,M.等人11。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:线粒体膜电位流细胞学分析。(A) 在 PBS+2%FBS(绿色)或无血清扩张介质(SFEM)(红色)中沾染 TMRM 的 HSC 中 ,μm 的代表性分布。(B, C)在 CD34+-HSC 和林+细胞(B) 中 ,μm 的代表性分布和 CD34 中的 μm 定量--HSC、CD34=-HSC、MPP、Lin+和 Lin+细胞 (C) 在存在时沾染了 TMRM或没有排泄泵抑制剂。每个种群的TMRM强度通过自己的BM-MDC的TMRM强度(从博奥拉、M.等人11修改)进行标准化。(D) 在(粉红色)和后(浅蓝色)FCCP添加之前,在HSC中代表TMRM强度分布的直方图。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
线粒体膜电位测量是线粒体分析和评估的基石,线粒体对细胞的代谢状态至关重要。在这里,我们描述了一个通过TMRM染色分析μm的协议。TMRM是一种细胞渗透荧光染料,由于μm在活性线粒体中积累,其各自的水平在细胞外、细胞质和线粒体室之间保持平衡。该协议适用于各种染料,包括四甲胺、乙酯(TMRE)和JC-1。适当的染色条件对于获得准确结果至关重要。这些措施包括:防止光线照射、适当的孵育时间、保持恒定温度(37°C)和细胞外浓度。当TMRM染料水平尚未达到完美平衡时,在流式细胞测定过程中的数据采集过程中,可以检测到染色强度的意外变化。因此,TMRM 的推荐染色期为 1 小时而不是 30 分钟(如一个 TMRM 制造商的协议中所述)。还建议在5分钟内至少采集两次样品,以比较染料的稳定性。
该协议的另一个关键步骤是在抗体和染料之间建立有效的颜色匹配。血泊种群可以通过流式细胞测定,使用成熟的表面标记21。此处描述的浇注策略(图 2) 与 TMRM 染色兼容,并允许在不同分化阶段同时测量其强度。TMRM与PE通道匹配,但其强度通常比与PE结合的抗体强度弱得多(未显示数据)。由于这会影响颜色补偿,导致某些总体的光谱发生意外变化,因此具有 TMRM 染色的样品应用作 PE 通道的补偿控制。
当前协议的主要优点是,它能够去除异种生物排流泵的作用,其 TMRM 染料的有效挤出可改变其在等离子膜和线粒体积累的平衡。这是通过染料吸收准确评估HSC线粒体功能的关键步骤。由于HSC表示比承诺细胞19更活跃的排泄泵,Verapamil或类似药物,如环孢菌素H,一个Ca2+独立的多药阻抗抑制剂22(图3B-C),应用于HSC 的染色程序,以更准确地评估线粒体活性水平。由于这个关键问题是最近才指出的,23日仍在讨论之中,本报告的主要目的是提供一个简单和详细的协议,这将有助于使获得可重复的数据,减少不同研究组结果之间的明显差异。此处描述的协议详细介绍了每个步骤,包括剂量、时间和特定介质。例如,HSPC 中的 TMRM 配置文件可能因介质而异(图 3A)。对所涉及的机制进行详细分析需要进一步探索,但由于无血清扩张介质 (SFEM) 是 HSC 培养的成熟方法,因此强烈建议在为 HSC 执行 TMRM 染色时采用 SFEM 而不是 PBS。此外,通过抑制排流泵,这里证明了对线粒体膜潜力的准确评估,这突出表明了Verapamil以及其他染料(如MitoTracker、MitoSOX)在HSC。
重要的是,流式细胞测量显示的TMRM强度可能无法精确反映线粒体体积。流式细胞测定测量每个细胞的总荧光强度,但线粒体染料对线粒体的分布取决于μm。因此,很难辨别对TMRM读数的重要贡献是否来自[m]或线粒体卷11。我们已经确认MTO是最常用于测量线粒体质量的染料之一,它同时受到μm和efflux泵活性的影响。我们还观察到,Verapamil改变了HSPC人群中MTO的强度分布,但没有发现MTO强度与线粒体体积11之间的相关性。线粒体体积和μm的组合测量应用于数据标准化,消除膜电位的影响,并应采用μm独立技术进一步探索线粒体含量。
这些技术将包括基于荧光标记的三维体积分析(例如线粒体蛋白的免疫染色)、电子显微镜11和线粒体/核DNA比率的定量。线粒体染料(即TMRM)与排泄系统抑制剂结合使用,无疑将证明通过流式细胞测定线粒体生物学的巨大益处。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢伊托实验室的所有成员,特别是伊都和H Sato,以及爱因斯坦干细胞研究所的评论和爱因斯坦流细胞测定和分析成像核心设施(由美国国家癌症研究所资助P30 CA013330)为帮助进行实验。K.I. 由美国国家卫生研究院(R01DK98263、R01DK115577和R01DK100689)和纽约州卫生局资助,担任爱因斯坦单细胞基因组学/基因组学(C029154)的核心主任。伊托是白血病和淋巴瘤学会的研究学者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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