Summary
Xenobiotiske effluks pumper er meget aktive i hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc'er) og forårsage ekstrudering af tmrm, en mitokondriel membran potentielle fluorescerende farvestof. Her præsenterer vi en protokol til præcist at måle mitokondrie membran potentiale i hspcs af tmrm i nærværelse af verapamil, en effluks pumpe hæmmer.
Abstract
Da cellulær metabolisme er en central regulator af hæmatopoietisk stamcelle (HSC) selvfornyelse, er de forskellige roller, der spilles af mitokondrierne i hæmatopoietisk homøostase, blevet grundigt undersøgt af HSC-forskere. Mitokondrie aktivitetsniveauer afspejles i deres membran potentialer (ΔΨm), som kan måles ved celle-permente kationiske farvestoffer såsom TMRM (tetramethylrhodamin, methylester). Effluks-pumpernes evne til at ekstrudere disse farvestoffer fra celler kan dog begrænse deres anvendelighed. Den resulterende måle skævhed er særlig kritisk ved vurdering af HSCs, da xenobiotiske transportører udviser højere udtryks-og aktivitetsniveauer i HSCs end i differentierede celler. Her beskriver vi en protokol, der udnytter verapamil, en effluks-pumpe hæmmer, til nøjagtigt at måle ΔΨm på tværs af flere knoglemarvs populationer. Den resulterende hæmning af pumpe aktivitet viser sig at øge TMRM-intensiteten i hæmatopoietisk stamceller og progenitorcellerne (Hspc'er), samtidig med at den forbliver relativt uændret i modne fraktioner. Dette fremhæver den tætte opmærksomhed på Dye-efflux aktivitet, der er nødvendig, når ΔΨm-afhængige farvestoffer anvendes, og som skrevet og visualiseret, denne protokol kan bruges til præcist at sammenligne enten forskellige populationer i knoglemarven, eller den samme population på tværs af forskellige eksperimentelle modeller.
Introduction
Hæmatopoietiske stamceller (hscs) er selvfornyende, multi-potent, og i stand til at give anledning til alle cellerne i blodet1,2. Cellulære metabolisme er en central regulator af HSC vedligeholdelse, sammen med transkriptionelle faktorer, iboende signaler og mikromiljø3,4,5. Korrekt kontrol af mitokondrie funktion og kvalitet er derfor afgørende for HSC vedligeholdelse6,7.
Mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) er en nøgleparameter i vurderingen af mitokondrier, da det direkte afspejler deres funktionalitet, som stammer fra balancen i protonpumpe aktivitet i elektrontransportkæden og proton strømmen gennem F 1/FO ATP syntase. Disse er begge påkrævet (afhængigt af genekspression og substrat tilgængelighed) for den iltafhængige fosforylering af ADP til ATP8,9. Ved at drage fordel af det mitokondriske rums elektron, er der udviklet forskellige potentiometriske farvestoffer til måling af ΔΨm. En af dem er tetramethylrhodamin methylester perchlorat (TMRM), som er blevet flittigt anvendt til at måle ΔΨm ved flow cytometri i en række celler10, herunder hæmatopoietisk stilk og stamceller11.
Mitokondrie farvestoffer skal anvendes med en vis forsigtighed i hscs, men fordi den høje aktivitet af xenobiotiske effluks pumper af disse celler kan resultere i Dye ekstrudering12. Faktisk har ekstrudering af mitokondrie farvestoffer som Rhodamine 123 gjort det muligt for forskerne at isolere HSCs13 eller identificere HSC "side populationer" ved at udnytte differentialekstrudering af farvestofferne Hoechst Blue og Hoechst Red14, 15. det er også blevet påvist, at Fumitremorgin C, der er en specifik blokker af ATP-bindings kassetten under familie G member 2 (ABCG2), ikke påvirker farvnings mønsteret for MitoTracker i HSPCs16. Efter offentliggørelsen af disse resultater blev der udført flere undersøgelser ved hjælp af mitokondrie farvestoffer i fravær af xenobiotiske effluks-pumpe hæmmere, hvilket førte til det udbredte indtryk, at hscs kun har et lille antal mitokondrier med lav ΔΨm16 , 17 , 18.
For nylig blev det påvist, at verapamil, en bredspektret hæmmer af effluks pumper, væsentligt ændrer farvning mønster af mitokondrie farvestof mitotracker grøn19. Denne afvigelse skyldes sandsynligvis, at Fumitremorgin C er yderst selektiv for Abcg2, mens HSCs også udtrykker andre transportører såsom Abcb1a (som kun er svagt følsom over for Fumitremorgin C)19. Vi har også rapporteret, at andre mitokondrie farvestoffer, såsom tmrm, nonyl acridin orange, og mitotracker orange (MTO) udviser de samme mønstre som mitotracker Green. Endnu vigtigere, vi har observeret, at strømnings cytometriske mønstre af Hspc'er afspejle deres ΔΨm ud over mitokondrie masse11.
Indtagelse af tmrm farvestof strengt afhænger af den negative ladning af mitokondrier, men den resulterende ophobning af farvestof er i konstant balance mellem dets indtag og clearance af effluks pumper20. Forskellen i xenobiotiske effluks pumpe udtryk mellem hscs og modne cellepopulationer påvirker denne balance og kan føre til partiske resultater. Brugen af dedikerede hæmmere såsom verapamil bør overvejes i analysen af ΔΨm af potentiometriske farvestoffer. Her beskriver vi en modificeret protokol for nøjagtig ΔΨm måling af tmrm-baseret flow cytometri, som korrigerer for xenobiotiske transporter aktivitet gennem brug af dedikerede hæmmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) for Albert Einstein College of Medicine.
1. forberedelse af løsninger
- Farvnings buffer (fosfat-bufferet saltvand (PBS) + 2% føtal bovint serum (FBS)): Tilsæt 10 mL FB'ER i 500 mL steril PBS-opløsning.
Bemærk: Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i mindst en måned i steril tilstand. Før følgende procedurer påbegyndes, sættes en alikvot af denne opløsning (50 mL) på is. - ACK (ammonium-chlorid-kalium) lyserende buffer: Anbring en alikvot lyserende-buffer (1 ml) på isen, før du påbegynder proceduren.
Bemærk: For at tilberede den samme ikke-kommercielle buffer, opløses 8,02 g NH4CL, 1 g KHCO3 og 37,2 mg na2EDTA i 1 L af H2O. Justér pH-værdien til 7,2-7,4. Opbevares i op til 6 måneder ved stuetemperatur. - Dyrkningsmedium: Tilsæt 50 ng/mL stamcellefaktor (SCF) og 50 ng/mL trombopoietin (TPO) til serumfrit medium for kultur og udvidelse af hæmatopoietiske celler (Se tabel over materiale til kommercielt medium anbefales).
- TMRM stamopløsning: klargør TMRM (1 μM) opløsning ved at opløse 5 μg TMRM pulver i 10 mL ethanol. Denne opløsning opbevares ved-20 °C beskyttet mod lys.
- Verapamil stamopløsning: Forbered verapamil (50 mM) opløsning ved fortynding af 24 mg verapamil i 1 mL ethanol. Denne opløsning opbevares ved-20 °C.
- FCCP stamopløsning: Forbered carbonilcyanid p-triflouromethoxyphenylhydrazon (FCCP) (1 M) opløsning ved at opløse 254 mg i 1 mL ethanol. Denne opløsning opbevares ved-20 °C beskyttet mod lys.
2. knoglemarvs isolation
- Euthanize musen ved CO2 indånding efter institutionelle retningslinjer og spray musene med 70% ethanol.
Bemærk: Dette trin forhindrer kontaminering af de celler af interesse uden at kompromittere eksperimentelle resultater. - Brug et par pincet og skarp saks, lav en lille klip i den ventrale hud af musen og strække huden.
- Uddrag femur og skinneben, mens du tager sig ikke at fjerne lederne af femur, da de indeholder en stor mængde af knoglemarvsceller. Placer de fjernede knogler i en 6-brønd plade fyldt med 1,5 mL farvnings buffer.
Bemærk: Denne procedure kræver ikke sterile område. - Fjern musklerne fra knoglerne og skær enderne af knoglerne tillader udgang af knoglemarven (figur 1a). Placer de rengjorte knogler i nye brønde med 1,5 mL farvnings buffer.
Bemærk: Muskler og andet væv skal fjernes omhyggeligt for at undgå sprøjte tilstopning i næste trin. - Skyl knoglemarven ved hjælp af en 3 mL sprøjte med en 25 G nål.
Bemærk: Fortsæt med at skylle knoglemarven, indtil knoglen bliver hvid (figur 1b). - Saml alle cellerne i et 1,5 mL rør, centrifuge i 5 min ved 180 x g , og kassér supernatanten (figur 1c).
- Resuspension af pellet i 300 μl iskold ACK-lyserende-buffer meget forsigtigt, sat på is i 1 min og umiddelbart inaktiv lysis ved tilsætning af 1 ml farvnings buffer. Centrifuger i 5 minutter ved 180 x g.
Bemærk: Cellerne pellet vises hvidt (figur 1d). Det samlede antal isolerede celler er ca. 2-4 x 107. - Træpiller opslæmmes i 1 mL farvnings buffer og filtreres ved hjælp af en celle-Strainer hætte (12 x 75 mm2,5ml kapacitet) med en 35 μm nylon mesh indarbejdet for at opnå mononukleare celler. Efter blokering skal prøven opbevares på is.
3. immun farvning til påvisning af HSC
- Forbered Lineage (Lin) cocktail. I 400 μL farvnings buffer tilsættes 4 μL af følgende biotinilerede antistoffer mod CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM og Il7Ra for at opnå en endelig fortynding 1:100.
- Forbered fluorophorer konjugeret-antistoffer (ABS). I 400 μL farvnings buffer tilsættes 4 μL af følgende ABS for at opnå en endelig fortynding 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/CY 5.5 og CD34-FITC. Opbevares i is, beskyttet mod lys.
- Prøven centrifugeres i 5 minutter ved 180 x g, hvorefter supernatanten kasseres.
- Tilsæt 400 μL Lin cocktail opløsning til cellerne pellet. Tilsæt 4 μL CD135-biotinileret AB. vortex hurtigt at blande og inkubere i 30 min i is.
- Prøven vaskes med 3 mL farvnings buffer, spin ned i 5 min ved 180 x g og kassér supernatanten.
- Tilsæt 400 μL ABS opløsning. Vortex hurtigt at blande og inkubere i 30 min på is.
- Prøverne vaskes med 3 mL farvnings buffer, Centrifugér i 5 minutter ved 180 x g , og supernatanten kasseres.
4. TMRM-farvning
- Klargør TMRM-Farvningsopløsningen. Tilsæt 2,2 μL TMRM stamopløsning og 1,1 μL verapamil (henholdsvis 2 nM og 50 μM som endelig koncentration) i 1,1 mL serumfrit medium for kultur og udvidelse af hæmatopoietiske celler (Se tabel over materiale til kommercielt medium anbefales) med TPO og SCF.
Bemærk: Dette er det vigtigste skridt i protokollen. Verapamil tilsætning er nødvendig for at blokere effluks pumper, som er stærkt udtrykt i hscs og kan Extrude tmrm. - Resuspension af knoglemarven i 1 mL TMRM-farvningsopløsning, vortex hurtigt og Inkuber i 1 time ved 37 °C.
Bemærk: TMRM-farvning må ikke vaskes ud. PE-dedikeret kompensations kontrol er også resuspenderet i 100 μL TMRM farvningsopløsning og underkastes inkubation i 1 time ved 37 °C efter hurtig vortex. - Prøven filtreres ved hjælp af en celle-Strainer hætte (12 x 75 mm2,5ml kapacitet) med en 35 μm nylon mesh indarbejdet for at undgå tilstopning af strømnings cytometer.
Bemærk: Tmrm farvning øger muligheden for tilstoppe dannelse i prøven. Filtrering af prøven lige før flow assays anbefales. - Tilsæt 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for at udelukke døde celler ved flow cytometri.
5. erhvervelse af flow cytometer
- Køre knoglemarv prøve og erhverve mindst 1 x 106 begivenheder.
-
Udarbejde en gating-strategi for at identificere de forskellige hæmatopoietiske populationer (figur 2).
- Vis levende knoglemarv mono-nukleare celler (BM-MNCs), DAPI− fraktion, i plot for Pacific Blue til at identificere CD135−Lin− (Lin−) og Lin+ fraktioner.
- Plot Lin− FRAKTION for APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) for at identificere Multipotente progenitorer (MPP) fraktion, som c-kit+ og SCA-1+.
- Afbild MPP-fraktion for APC (CD48) versus PerCP/CY 5.5 (CD150) for at identificere HSC-fraktion som CD150+ og CD48−.
- Vis HSC-fraktion for FITC (CD34) for at opdele CD34−HSC og CD34+-HSC.
- Få TMRM-intensiteten (PE-kanalen) i hver population.
- Efter erhvervelse tilsættes til prøven 1 μL FCCP for at opnå den endelige koncentration på 1 mM og Inkubér ved 37 °C i 5 min, og derefter erhverve 1 x 106 hændelser.
Bemærk: Fccp er en mitokondrie af, som bruges til at sprede ΔΨm. Det bruges som eksperimentel kontrol for at bekræfte, at TMRM farvning fungerer korrekt. Efter administration af FCCP bør TMRM-intensiteten nedsættes drastisk (figur 3a). - Analysér data normaliserer den gennemsnitlige intensitet af PE for hver population ved intensiteten af PE af alle BM-multinationale selskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokol gør det nemt at isolere BM-multinationale selskaber fra en musemodel. Figur 1 opsummerer de vigtigste trin i protokollen: knogle isolation, rødmen ud af knoglemarven, røde blodlegemer og antistof farvning efterfulgt af TMRM-farvning for at måle mitokondriel membranpotentialet i en specifik hæmatopoietisk population .
BM-multinationale selskaber indeholder flere cellepopulationer, herunder HSCs. De antistof-cocktails, der anvendes i denne protokol, er veletablerede i rensningen af HSCs (CD34− og CD34+), Multipotente stamceller (mpps), Lin− samt Lin+ celler, henholdsvis 21. Den gating strategi for isolering af disse fraktioner er vist i figur 2.
Efter identifikationen af interesse populationer blev TMRM-intensiteten, som skulle fremstå som et klart signal, vurderet. TMRM-farvning i serumfrit ekspansions medium (SFEM) anbefales stærkt, da TMRM-profiler i Hspc'er kan ændres, når farvning udføres i PBS + 2% FBS (figur 3a).
Figur 3c viser den gennemsnitlige intensitet af hver population, som er normaliseret af intensiteten af BM-MNCs. hscs udtrykker høje aktivitetsniveauer af xenobiotiske effluks-pumper, der kan ekstrudere tmrm-farvestof20, og vi fandt også tmrm-profiler i hspcs blev ændret under tilstedeværelse af verapamil (figur 3b, C). Lignende resultater blev opnået af andre hæmmere såsom ciclosporin H (figur 3c). Således kan den nøjagtige mængde tmrm, der er indlæst i mitokondrierne ved ΔΨm, måles efter verapamils hæmning af effluks-pumperne eller ciclosporin H (figur 3c).
Endelig kan FCCP bruges til at verificere nøjagtigheden af TMRM-farvning. FCCP depolariserer mitokondrier, hvilket resulterer i en reduktion i TMRM intensitet (figur 3D). Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at bestemme baggrunds intensiteten af farvning og/eller som en negativ kontrol.
Figur 1: protokol rutediagram. Grafisk Resumé af proceduren for at isolere og bejdse BM-multinationale selskaber til at bestemme ΔΨm. Kritiske trin fremhæves af billed skær (A-D). Femurs og forbenede fra voksne C57BL/6 mus blev isoleret og deres ender fjernes (A). Lange knogler som i en efter flush (B). Isolerede BM-multinationale selskaber før (C) og efter (D) ACK lysis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning af gating. Skematisk gengivelse af gating strategi til at identificere de forskellige hæmatopoietiske populationer, herunder CD34−-HSC og CD34+-HSC, MPP, Lin− og Lin+ celler. Panelerne blev modificeret fra Bonora, M. et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: flow cytometri analyse af mitokondriel membran potentiale. A) repræsentativ distribution af ΔΨm i hscs, der er plettet med TMRM i PBS + 2% FBS (grøn) eller i serumfrit ekspansions medium (sfem) (rød). (B, C) Repræsentativ fordeling af ΔΨm i CD34−HSC og Lin− celler (B) og kvantificering af ΔΨm i CD34−-HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin− og Lin+ celler (C) farvet med tmrm i tilstedeværelse eller fravær af effluks-pumpe hæmmere. TMRM-intensiteten for hver population blev normaliseret ved TMRM-intensiteten af egne BM-multinationale selskaber (modificeret fra Bonora, M. et al.11). D) repræsentativt histogram af TMRM-intensitets fordeling i hscs før (Pink) og efter (lyseblå) fccp-tilsætning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriel membran potentiel måling er en hjørnesten i analysen og vurderingen af mitokondrier, som er afgørende for den metaboliske tilstand af cellen. Her beskriver vi en protokol til analyse af ΔΨm ved TMRM-farvning. TMRM er en celle-permente fluorescerende farvestof, der ophobes i aktive mitokondrier på grund af ΔΨm, og dens respektive niveauer forbliver i ligevægt mellem de ekstracellulære, cytoplasmiske og mitokondrie rum10. Denne protokol kan tilpasses til forskellige farvestoffer, herunder tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE) og JC-1. Passende farvnings betingelser er afgørende for at opnå nøjagtige resultater. Disse omfatter: beskyttelse mod lys eksponering, korrekt inkubationstid, vedligeholdelse af konstant temperatur (37 °C) og ekstracellulær koncentration. Når TMRM-farve niveauet endnu ikke er nået perfekt ligevægt, kan der påvises uventede ændringer i farvnings intensiteten under dataindsamlingen i flowcytometri-processen. Den anbefalede farvnings periode for TMRM er derfor 1 t i stedet for 30 min (som nævnt i en TMRM-fabrikants protokol). Det foreslås også, at prøven skal erhverves mindst to gange inden for 5-min for at sammenligne stabiliteten af farvestoffet.
Et andet kritisk trin i protokollen er oprettelsen af en effektiv farve match blandt antistoffer og farvestof. Hæmatopoietiske populationer kan påvises ved flow cytometri ved hjælp af veletablerede overflade markører21. Den gating-strategi, der er beskrevet her (figur 2), er kompatibel med TMRM-farvning og gør det muligt at måle intensiteten i forskellige differentierings faser samtidigt. TMRM svarer til PE-kanalen, men intensiteten er som regel meget svagere end for antistoffer, der er konjugeret med PE (data ikke vist). Da dette kan påvirke farve kompensationen og medføre uventede forskydninger i nogle populationers spektre, bør prøven med TMRM-farvning anvendes som kompensations kontrol for PE-kanalen.
Den største fordel ved den nuværende protokol er, at den gør det muligt at fjerne virkningen af xenobiotiske effluks-pumper, hvis effektive ekstrudering af tmrm-farvestof modificerer både dens ligevægt på tværs af plasma membranen og dens mitokondrielle akkumulering. Dette er et kritisk skridt i den nøjagtige vurdering af HSC mitokondrie funktion ved farve absorption. Da hscs udtrykker mere aktive effluks-pumper end forpligtede celler19, verapamil eller lignende lægemidler, såsom cyclosporin H, skal der anvendes en ca2 +-uafhængig multi-resistens inhibitor22 (figur 3b-C) i farvnings procedure for HSCs til mere præcist at vurdere niveauet af mitokondrie aktivitet. Da dette kritiske spørgsmål først blev påpeget for nylig11,19 og stadig drøftes23, er hovedformålet med denne betænkning at give en let og detaljeret protokol, som vil bidrage til at standardisere proceduren for indhentning af reproducerbare data og mindske de tilsyneladende uoverensstemmelser mellem resultaterne af forskellige forskningsgrupper. Protokollen her beskrevet viser i detaljer hvert trin, herunder doser, timing og specifikke medier. F. eks. kan TMRM-profiler i Hspc'er variere afhængigt af deres medium (figur 3a). En detaljeret analyse af de involverede mekanismer vil kræve yderligere udforskning, men da det serum frie ekspansions medium (SFEM) er en veletableret metode til HSC-kultur, anbefales SFEM snarere end PBS kraftigt, når der udføres TMRM-farvning for HSCs. Desuden fremhæver den nøjagtige vurdering af mitokondriel membranpotentialet her gennem hæmning af effluks pumper mulige fremtidige anvendelser af verapamil, samt andre farvestoffer (f. eks mitotracker, mitosox), i undersøgelsen af HSCs.
Det er vigtigt, at TMRM-intensiteten som vist ved flowcytometri ikke præcist afspejler mitokondriel volumen. Flow cytometri måler total fluorescens intensitet pr. celle, men fordelingen af mitokondrielle farvestoffer til mitokondrier afhænger af ΔΨm. Det er derfor vanskeligt at skelne mellem, om det kritiske bidrag til en TMRM-aflæsning stammer fra ΔΨm eller mitokondrie volumen11. Vi har bekræftet, at MTO, en af de farvestoffer, der hyppigst anvendes til at måle mitokondriel masse, påvirkes af både ΔΨm og effluks pumpe aktivitet. Vi har også observeret, at verapamil ændrer intensiteten profil af MTO i HSPC populationer, men har fundet nogen sammenhæng mellem MTO intensitet og mitokondrie volumen11. Kombineret måling af mitokondriel volumen og ΔΨm bør anvendes til at normalisere data og eliminere virkningerne af membran potentiale, og yderligere udforskning af mitokondriel indhold bør udføres ved hjælp af ΔΨm-uafhængige teknikker.
Sådanne teknikker vil omfatte 3D-volumen analyse baseret på fluorescerende markører (f. eks. immun farvning af mitokondrie proteiner), elektronmikroskopi11og kvantitation af mitokondrielle/nukleare DNA-nøgletal. Brugen af mitokondrie farvestoffer (dvs. tmrm) i kombination med effluks system hæmmere vil utvivlsomt vise sig stor gavn i belysning af mitokondrie biologi gennem flow cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle medlemmer af Ito laboratorium, især K Ito og H Sato, og Einstein stamcelle Institute for kommentarer og Einstein flow cytometry og analytiske Imaging Core faciliteter (finansieret af National Cancer Institute Grant P30 CA013330) for hjælpe med at udføre forsøgene. K.I. er støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 og R01DK100689) og New York State Department of Health som Core Director of Einstein enkelt celle Genomics/epigenomics (C029154). K.I. Ito er en forsker i leukæmi og lymfomer samfund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
