Summary
Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.
Abstract
Como el metabolismo celular es un regulador clave de la auto-renovación de células madre hematopoyéticas (HSC), los diversos papeles desempeñados por las mitocondrias en la homeostasis hematopoyética han sido ampliamente estudiados por los investigadores de HSC. Los niveles de actividad mitocondrial se reflejan en sus potenciales de membrana ( , que se pueden medir mediante colores catiónicos persignificados por células como TMRM (tetrametilrhodamina, éster metílico). Sin embargo, la capacidad de las bombas de eflujo para extruir estos tendededores de las células puede limitar su utilidad. El sesgo de medición resultante es particularmente crítico al evaluar los HSC, ya que los transportadores xenobióticos presentan niveles más altos de expresión y actividad en los HSC que en las células diferenciadas. Aquí, describimos un protocolo que utiliza Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo, para medir con precisión a través de múltiples poblaciones de médula ósea. Se ha demostrado que la inhibición resultante de la actividad de la bomba aumenta la intensidad de la TMRM en las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC), mientras que la deja relativamente sin cambios en fracciones maduras. Esto pone de relieve la atención cercana a la actividad de colorante-eflujo que se requiere cuando se utilizan tintes dependientes de la m, y según lo escrito y visualizado, este protocolo se puede utilizar para comparar con precisión diferentes poblaciones dentro de la médula ósea, o la misma población en diferentes modelos experimentales.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son auto-renovadas, multipotentes, y capaces de dar lugar a todas las células de la sangre1,2. El metabolismo celular es un regulador clave del mantenimiento de HSC, juntocon factores transcripcionales, señales intrínsecas y el microambiente 3,4,5. Por lo tanto, el control adecuado de la función y la calidad mitocondriales es fundamental para el mantenimiento de HSC6,7.
El potencial de la membrana mitocondrial es un parámetro clave en la evaluación de las mitocondrias, ya que refleja directamente su funcionalidad, que deriva del equilibrio de la actividad de bombeo de protones en la cadena de transporte de electrones y el flujo de protones a través de F 1/FO ATP sintasa. Ambos son necesarios (dependiendo de la expresión génica y la disponibilidad del sustrato) para la fosforilación dependiente del oxígeno de ADP a ATP8,9. Aprovechando la electronegatividad del compartimiento mitocondrial, se han desarrollado varios colorantes potenciométricos para medir el sistema. Uno de ellos es el perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que se ha utilizado ampliamente para medir la citometría de flujo en una variedad de células10,incluyendo el tallo hematopoyético y las células progenitoras11.
Los tintes mitocondriales deben utilizarse con cierta precaución en los HSC, sin embargo, porque la alta actividad de las bombas de eflujo xenobiótico de estas células puede dar lugar a la extrusión de tinte12. De hecho, la extrusión de tintes mitocondriales como Rhodamine 123 ha permitido a los investigadores aislar los HSC13 o identificar las "poblaciones laterales" de HSC explotando la extrusión diferencial de los tintes Hoechst Blue y Hoechst Red14, 15. También se ha demostrado que Fumitremorgin C, un bloqueador específico del transportador de la subfamilia G de casete de unión ATP G (ABCG2), no afecta al patrón de tinción de MitoTracker en HSPCs16. Después de la publicación de estos resultados, se realizaron múltiples estudios utilizando desies mitocondriales en ausencia de inhibidores de la bomba de eflujo xenobiótico, lo que llevó a la impresión generalizada de que los HSC tienen sólo un pequeño número de mitocondrias conbajo , 17 , 18.
Recientemente, se demostró, sin embargo, que Verapamil, un inhibidor de amplio espectro de bombas de eflujo, modifica significativamente el patrón de tinción del tinte mitocondrial MitoTracker Green19. Esta discrepancia es probablemente debido al hecho de que Fumitremorgin C es altamente selectivo para Abcg2, mientras que los HSC también expresan otros transportadores como Abcb1a (que sólo es débilmente sensible a Fumitremorgin C)19. También hemos informado de que otros colorantes mitocondriales, como TMRM, Naranja acridina Nonyl y Naranja Mitotracker (MTO) exhiben los mismos patrones que Mitotracker Green. Lo que es más importante, hemos observado que los patrones citométricos de flujo de los HSCCP reflejan su m, además de la masa mitocondrial11.
La ingesta de tinte TMRM depende estrictamente de la carga negativa de las mitocondrias, pero la acumulación resultante de tinte está en equilibrio constante entre su ingesta y el aclaramiento por las bombas de eflujo20. La diferencia en la expresión de la bomba de eflujo xenobiótico entre los HSC y las poblaciones de células maduras afecta este equilibrio y puede conducir a resultados sesgados. El uso de inhibidores específicos como Verapamil debe ser considerado en el análisis de los diques potenciométricos. Aquí describimos un protocolo modificado para la medición precisa de m-m por citometría de flujo basada en TMRM que corrige la actividad del transportador xenobiótico mediante el uso de inhibidores dedicados.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparación de soluciones
- Tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 2% de suero bovino fetal (FBS)): Añadir 10 ml de FBS en 500 ml de una solución estéril de PBS.
NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante al menos un mes en estado estéril. Antes de iniciar los siguientes procedimientos, coloque una alícuota de esta solución (50 ml) en hielo. - Tampón de lising ACK (amonio-cloruro-potasio): Coloque una alícuota de tampón de lising ACK (1 ml) sobre hielo antes de iniciar el procedimiento.
NOTA: Para preparar el mismo tampón no comercial, disolver 8,02 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3 y 37,2 mg de Na2EDTA en 1 L de H2O. Ajuste el pH a 7.2-7.4. Conservar durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente. - Medio de cultivo: Añadir factor de células madre de 50 ng/ml (SCF) y trombopoietina de 50 ng/ml (TPO) al medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (ver Tabla de Material para el medio comercial recomendado).
- Solución de stock TMRM: Preparar la solución TMRM (1 M) disolviendo 5 g de polvo TMRM en 10 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC protegida de la luz.
- Solución en stock de Verapamil: Preparar la solución de Verapamil (50 mM) diluyendo 24 mg de Verapamilo en 1 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC.
- Solución de stock FCCP: Preparar la solución de carbonilcianicida p-triflourometoxifenilhidrazona (FCCP) (1 M) disolviendo 254 mg en 1 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC protegida de la luz.
2. Aislamiento de la médula ósea
- Euthanice el ratón por inhalación de CO2 siguiendo las pautas institucionales y rocíe a los ratones con 70% de etanol.
NOTA: Este paso evita la contaminación de las células de interés sin comprometer los resultados experimentales. - Usando un par de fórceps y tijeras afiladas, haz un pequeño recorte en la piel ventral del ratón y estira la piel.
- Extraiga el fémur y la tibia mientras se cuida de no desalojar las cabezas del fémur, ya que contienen una gran cantidad de células de la médula ósea. Coloque los huesos eliminados en una placa de 6 pocillos llena de 1,5 ml de tampón de tinción.
NOTA: Este procedimiento no requiere área estéril. - Retire los músculos de los huesos y corte los extremos de los huesos permitiendo la salida de la médula ósea (Figura1A). Coloque los huesos limpios en nuevos pozos con 1,5 ml de tampón de tinción.
NOTA: Los músculos y otros tejidos deben retirarse cuidadosamente para evitar la obstrucción de la jeringa en el siguiente paso. - Retire la médula ósea con una jeringa de 3 ml con una aguja de 25 G.
NOTA: Continúe lavando la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco (Figura1B). - Recoger todas las células en un tubo de 1,5 ml, centrífuga durante 5 minutos a 180 x g y luego desechar el sobrenadante (Figura1C).
- Resuspenda el gránulo en 300 ml de tampón de lising ACK helado con mucho cuidado, ponte en hielo durante 1 min y la lisis inmediatamente inactiva añadiendo 1 ml de tampón de tinción. Centrífuga durante 5 min a 180 x g.
NOTA: El pellet de células aparece blanco (Figura1D). El número total de células aisladas es de aproximadamente 2-4 x 107. - Resuspenda los gránulos en 1 ml de tampón de tinción y filtre utilizando una tapa de colador celular (12 x 75 mm2, 5 ml de capacidad) con una malla de nylon de 35 m incorporada para obtener células mononucleares. Después de bloquear, mantenga la muestra en hielo.
3. Inmunostaining para la detección de HSC
- Preparar cóctel de linaje (Lin). En 400 l de tampón de tinción, añadir 4 l de los siguientes anticuerpos biotinilados contra CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM e Il7Ra para obtener una dilución final 1:100.
- Preparar fluoróforos conjugados-anticuerpos (Abs). En 400 l de tampón de tinción, añadir 4 l de los siguientes Abs para obtener una dilución final 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 y CD34-FITC. Mantener en hielo, protegido de la luz.
- Centrifugar la muestra durante 5 min a 180 x g, luego deseche el sobrenadante.
- Añadir 400 l de solución de cóctel Lin a las células pellet. Añadir 4 l de CD135-biotinilado Ab. Vórtice rápidamente para mezclar e incubar durante 30 minutos en hielo.
- Lave la muestra añadiendo 3 ml de tampón de tinción, gire hacia abajo durante 5 minutos a 180 x g y deseche el sobrenadante.
- Añadir 400 l de abs solución. Vórtice para mezclar e incubar rápidamente durante 30 minutos sobre hielo.
- Lavar las muestras con 3 ml de tampón de tinción, girar hacia abajo durante 5 minutos a 180 x g y desechar el sobrenadante.
4. Tinción TMRM
- Prepare la solución de tinción TMRM. Añadir 2,2 ml de solución de material TMRM y 1,1 l de Verapamil (2 nM y 50 oM como concentración final, respectivamente) en 1,1 ml de medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (ver Tabla de Material para el medio comercial recomendado) con TPO y SCF.
NOTA: Este es el paso más importante del protocolo. La adición de Verapamil es necesaria para bloquear las bombas de eflujo que están muy expresadas en los HSC y pueden extruir TMRM. - Resuspender la médula ósea en 1 ml de solución de tinción TMRM, vórtice rápidamente e incubar durante 1 h a 37oC.
NOTA: La tinción TMRM no debe lavarse. El control de compensación dedicado a PE también se resuspende en 100 ml de solución de tinción TMRM y se somete a incubación durante 1 h a 37 oC después de vórtice rápido. - Filtrar la muestra utilizando una tapa de colador celular (12 x 75 mm2, 5 ml de capacidad) con una malla de nylon de 35 m incorporada para evitar la obstrucción del citómetro de flujo.
NOTA: La tinción TMRM aumenta la posibilidad de formación de obstrucciones en la muestra. Se recomienda la filtración de la muestra justo antes de los ensayos de flujo. - Añadir 1 l de 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para excluir las células muertas por citometría de flujo.
5. Adquisición por catómetro de flujo
- Ejecuta la muestra de médula ósea y adquiere al menos 1 x 106 eventos.
-
Configure la estrategia de gating para identificar las diferentes poblaciones hematopoyéticas (Figura2).
- Visualizar células mononucleares de médula ósea viva (BM-MNCs), DAPI- fracción, enparcela para Pacific Blue para identificar CD135-Lin ( Lin ) y Lin+ fracciones.
- Trazar Lin- fracción para APC/Cy7 (c-kit) versus PE/Cy7 (Sca-1) para identificar la fracción de progenitores multipotentes (MPP), como c-kit+ y Sca-1+.
- Trazar fracción MPP para APC (CD48) frente a PerCP/Cy5.5 (CD150) para identificar lafracción HSC, como CD150+ y CD48 .
- Visualice la fracción HSC para FITC (CD34) para dividir CD34 -HSC y CD34+-HSC.
- Adquirir la intensidad TMRM (canal PE) en cada población.
- Después de la adquisición, añadir a la muestra 1 l de FCCP para obtener la concentración final de 1 mM e incubar a 37 oC durante 5 min, luego adquirir 1 x 106 eventos.
NOTA: FCCP es un desacoplador mitocondrial que se utiliza para disipar el ám. Se utiliza como control experimental para confirmar que la tinción TMRM funciona correctamente. Después de la administración de FCCP, la intensidad de TMRM debe disminuir drásticamente (Figura3A). - Analizar los datos normalizando la intensidad media de PE de cada población por la intensidad de PE de todos los BM-MNCs.
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Representative Results
El protocolo descrito anteriormente permite el fácil aislamiento de los BMC de un modelo de ratón. La Figura 1 resume los principales pasos del protocolo: aislamiento óseo, eliminación de la médula ósea, lisis de glóbulos rojos y tinción de anticuerpos seguida de tinción TMRM para medir el potencial de la membrana mitocondrial en una población hematopoyética específica .
Los BM-MNC contienen varias poblaciones celulares, incluyendo HSCs. Los cócteles de anticuerpos utilizados en este protocolo están bien establecidos en la purificación de hSC (CD34 y CD34+), células progenitoras multipotentes (MPP), Lin, así como lin+ células, respectivamente 21. La estrategia de gating para aislar estas fracciones se muestra en la Figura2.
Después de la identificación de las poblaciones de interés, se evaluó la intensidad de TMRM, que debería aparecer como una señal brillante. La tinción TMRM en el medio de expansión libre de suero (SFEM) es muy recomendable, ya que los perfiles TMRM en HSCCP pueden sufrir alteraciones cuando la tinción se realiza en PBS +2% FBS (Figura3A).
La Figura 3C muestra la intensidad media de cada población, que se normaliza por la intensidad de los BMC-MNCs. Los HSC expresan altos niveles de actividad de bombas de eflujo xenobiótico capaces de extruir el tinte TMRM20,y de hecho, encontramos perfiles TMRM en HSCCP fueron cambiados en presencia deVerapamil (Figura 3B,C). Resultados similares fueron obtenidos por otros inhibidores como la Ciclosporina H (Figura3C). Por lo tanto, la cantidad exacta de TMRM cargada en las mitocondrias por la letra m puede medirse después de la inhibición de las bombas de eflujo por Verapamil o Ciclosporina H (Figura3C).
Finalmente, fcCP se puede utilizar para verificar la exactitud de la tinción TMRM. FCCP despolariza las mitocondrias, lo que resulta en una reducción de la intensidad de TMRM (Figura3D). Este enfoque también se puede utilizar para determinar la intensidad de fondo de la tinción y/o como un control negativo.
Figura 1: Diagrama de flujo de protocolo. Resumen gráfico del procedimiento para aislar y manchar BM-MNCs para determinar el valor de . Los pasos críticos se resaltan con inserciones de imagen (A-D). Se aislaron los fémures y las tibias de los ratones adultos C57BL/6 y se les quitaron los extremos (A). Huesos largos como en A después de enjuagar (B). BM-MNCs aislados antes (C) y después (D) Lisis ACK. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de Gating. Representación esquemática de la estrategia de gating para identificarlas diferentes poblaciones hematopoyéticas, incluyendo CD34 -HSC y CD34+-HSC, MPP, Liny Lin +células. Los paneles fueron modificados de Bonora, M. et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de citometría de flujo del potencial de membrana mitocondrial. (A) Distribución representativa de los SAC en los HSM teñidos con TMRM en PBS+2%FBS (verde) o en medio de expansión libre de suero (SFEM) (rojo). (B, C) Distribución representativa de las células cd34 -HSC y Lin( B) yla cuantificación de las células de la cd34 -HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin y Lin+ (C) teñidas con TMRM en presencia o ausencia de inhibidores de la bomba de eflujo. La intensidad TMRM de cada población se normalizó por la intensidad TMRM de los BM-MNCs propios (modificados de Bonora, M. et al.11). (D) Histograma representativo de la distribución de intensidad TMRM en HSCs antes (rosa) y después (azul claro) adición FCCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La medición del potencial de la membrana mitocondrial es una piedra angular del análisis y evaluación de las mitocondrias, que son críticas para el estado metabólico de la célula. Aquí, describimos un protocolo para el análisis de la tinción de TMRM. TMRM es un tinte fluorescente permeado por células que se acumula en las mitocondrias activas debido a los compartimentos extracelulares, citoplasmáticos y mitocondriales10. Este protocolo se puede adaptar para varios colorantes, incluyendo tetrametilrhodamina, éster etílico (TMRE) y JC-1. Las condiciones de tinción adecuadas son fundamentales para lograr resultados precisos. Estos incluyen: protección contra la exposición a la luz, tiempo de incubación adecuado, mantenimiento de la temperatura constante (37 oC) y concentración extracelular. Cuando los niveles de tinte TMRM aún no han alcanzado un equilibrio perfecto, se pueden detectar cambios inesperados en la intensidad de la tinción durante la adquisición de datos en el proceso de citometría de flujo. Por lo tanto, el período de tinción recomendado para TMRM es de 1 h en lugar de 30 min (como se menciona en un protocolo del fabricante TMRM). También se sugiere que la muestra debe adquirirse al menos dos veces dentro de 5 minutos para comparar la estabilidad del tinte.
Otro paso crítico del protocolo es la creación de una combinación de colores eficiente entre los anticuerpos y el tinte. Las poblaciones hematopoyéticas pueden detectarse mediante citometría de flujo utilizando marcadores de superficie bien establecidos21. La estrategia de medición descrita aquí (Figura2)es compatible con la tinción TMRM, y permite la medición de su intensidad en diferentes etapas de diferenciación simultáneamente. TMRM coincide con el canal PE, pero su intensidad suele ser mucho más débil que la de los anticuerpos conjugados con PE (datos no mostrados). Como esto puede afectar a la compensación de color, causando cambios inesperados en los espectros de algunas poblaciones, la muestra con tinción TMRM debe utilizarse como un control de compensación para el canal PE.
La principal ventaja del protocolo actual es que permite la eliminación del efecto de las bombas de eflujo xenobiótico, cuya extrusión eficiente del tinte TMRM modifica tanto su equilibrio a través de la membrana plasmática como su acumulación mitocondrial. Este es un paso crítico en la evaluación precisa de la función mitocondrial HSC por absorción de tinte. Como los HSC expresan bombas de eflujo más activas que las células comprometidas19, Verapamil o fármacos similares, como la Ciclosporina H, un inhibidor de la resistencia multifármaco independiente de Ca2+22 (Figura3B-C), debe utilizarse en el procedimiento de tinción de los HSC para evaluar con mayor precisión los niveles de actividad mitocondrial. Dado que esta cuestión crítica se señaló recientemente11,19 y todavía se está debatiendo23, el objetivo principal de este informe es proporcionar un protocolo fácil y detallado que ayudará a estandarizar el procedimiento para datos reproducibles y reducir las aparentes discrepancias entre los resultados de los diferentes grupos de investigación. El protocolo aquí descrito muestra en detalle cada paso, incluyendo dosis, sincronización y medios específicos. Por ejemplo, los perfiles TMRM en HSCCP pueden diferir dependiendo de su medio (Figura3A). Un análisis detallado de los mecanismos involucrados requerirá una mayor exploración, pero dado que el medio de expansión libre de suero (SFEM) es un método bien establecido para el cultivo de HSC, sFEM en lugar de PBS se recomienda encarecidamente al realizar la tinción TMRM para HSCs. Además, la evaluación precisa del potencial de membrana mitocondrial demostrada aquí a través de la inhibición de las bombas de eflujo pone de relieve las posibles aplicaciones futuras de Verapamil, así como otros colorantes (por ejemplo, MitoTracker, MitoSOX), en la investigación de Hscs.
Es importante destacar que la intensidad de TMRM como se muestra en la citometría de flujo puede no reflejar con precisión el volumen mitocondrial. La citometría de flujo mide la intensidad total de la fluorescencia por célula, pero la distribución de los tintes mitocondriales a las mitocondrias depende de la cantidad de tiempo. Por lo tanto, es difícil discernir si la contribución crítica a una lectura TMRM deriva del volumen mitocondrial11. Hemos confirmado que MTO, uno de los tensiodos más utilizados para medir la masa mitocondrial, se ve afectado por la actividad de la bomba de eflujo y de ém. También hemos observado que Verapamil cambia el perfil de intensidad de MTO en las poblaciones de HSPC, pero no hemos encontrado correlación entre la intensidad de la MTO y el volumen mitocondrial11. La medición combinada del volumen mitocondrial y de la m-m debe utilizarse para normalizar los datos y eliminar los efectos del potencial de la membrana, y la exploración adicional del contenido mitocondrial debe llevarse a cabo utilizando técnicas independientes de la m.
Tales técnicas incluirían análisis de volumen 3D basados en marcadores fluorescentes (por ejemplo, inmunomanchación de proteínas mitocondriales), microscopía electrónica11y cuantificación de relaciones de ADN mitocondrial/nuclear. El uso de colorantes mitocondriales (es decir, TMRM) en combinación con inhibidores del sistema de eflujo sin duda resultará de gran beneficio en la elucidación de la biología mitocondrial a través de la citometría de flujo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Ito, especialmente K Ito y H Sato, y al Instituto de Células Madre Einstein por sus comentarios y a las instalaciones básicas de Citometría e Imágenes Analíticas de Einstein Flow (financiadas por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA013330) ayudar a llevar a cabo los experimentos. K.I. cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK98263, R01DK115577 y R01DK100689) y del Departamento de Salud del Estado de Nueva York como Director Principal de Genómica/Eyómica de Células Simples de Einstein (C029154). K.I. Ito es un estudioso de investigación de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
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