Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Reinigungsmethode für rekombinantes tagfreies Calciumbindungsprotein S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für humane Monozytenstimulationstests.
Abstract
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Reinigung des humanen Calcium-bindenden Proteins S100A12 und seiner ioneninduzierten Oligomere aus der Escherichia coli-Kultur für Immunzellstimulationen. Dieses Protokoll basiert auf einer zweistufigen Chromatographiestrategie, die die Proteinvorreinigung auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule und einen anschließenden Polierschritt auf einer hydrophoben Wechselwirkungssäule umfasst. Diese Strategie produziert S100A12 Protein von hoher Reinheit und Ausbeute zu überschaubaren Kosten. Für funktionelle Tests an Immunzellen erfordert eine eventuelle Rest-Endotoxin-Kontamination eine sorgfältige Überwachung und weitere Reinigungsschritte, um endotoxinfreies Protein zu erhalten. Die mehralsige Endotoxinkontamination kann durch Anionenaustauschchromatographie ausgeschlossen werden. Um Restkontaminationen zu beseitigen, beschreibt dieses Protokoll einen Entfernungsschritt mit Zentrifugalfiltern. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12 in verschiedene Homomultimere anordnen. Um das Verhältnis zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, beschreibt dieses Protokoll die Ionenbehandlung von S100A12-Protein enden, gefolgt von chemischer Vernetzung zur Stabilisierung von S100A12-Oligomeren und deren anschließender Trennung durch Größenausschluss. Chromatographie. Schließlich beschreiben wir einen zellbasierten Assay, der die biologische Aktivität des gereinigten Proteins bestätigt und die LPS-freie Zubereitung bestätigt.
Introduction
S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs; auch als "Alarmins" bezeichnet). DAMPs sind endogene Moleküle wie zelluläre Proteine, Lipide oder Nukleinsäuren1. DAMP-Funktionen sind für die Mitglieder der Calgranulin-Proteinfamilie, S100A8/A9 und S100A122, die auch als divalente metallionchelisierende antimikrobielle Peptide 3,4, 5,6. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12, wie andere Mitglieder der S100-Familie, in verschiedene Homomultimere einwirken und bis vor kurzem waren die Auswirkungen der S100A12-Oligomerisierung auf die PRR-Interaktion, insbesondere TLR4, unbekannt.
Die monomere Form des Proteins (92 Aminosäuren, 10,2 kDa) besteht aus zwei EF-Hand-Helix-Loop-Helix-Strukturen, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Die C-Klemme EF-Hand enthält das klassische Ca2+-Bindungsmotiv, während die N-TerminalEF-Hand eine S100-proteinspezifische erweiterte Schleifenstruktur ('pseudo-EF-hand') aufweist und eine reduzierte Ca2+-Affinitätaufweist. Ca2+-Bindung durch S100A12 kann eine wesentliche konforme Veränderung des C-Terminusder Proteine induzieren, was zu einer Exposition eines hydrophoben Pflasters auf jedem Monomer führt und die Dimerisierungsschnittstelle bildet. So ist die kleinste quaternäre Struktur, die durch S100A12 gebildet wird, unter physiologischen Bedingungen ein nicht-kovalenter Dimer (ca. 21 kDa), in dem einzelne Monomere antiparallel ausgerichtet sind. Als Dimer angeordnet, wird S100A12 als Sequestrierung Zn2+ sowie andere divalente Metallionen, z.B. Cu2+ mit hoher Affinität7gemeldet. Diese Ionen werden an der Dimerschnittstelle S100A12 durch die Aminosäuren H15 und D25 einer Untereinheit und H85 sowie H89 der parallel enzierenden anderen Untereinheit8,9,10koordiniert. Während frühere Studien nahelegten, dass Zn2+-geladene S100A12 die Organisation des Proteins in Homo-Tetramere (44 kDa) induzieren und zu einer erhöhten Ca2+-Affinität11,12führen kann, Studien6 schlagen Ca2+-bindung durch S100A12 vor, um die Affinität des Proteins zu Zn2+zu erhöhen. Sobald die S100A12 EF-Zeiger von Ca2+voll belegt sind, wird angenommen, dass zusätzliche Ca2+ zwischen Dimeren binden und die Hexamerbildung auslösen (ca. 63 kDa). Die Architektur der hexamerischen Viertelstruktur unterscheidet sich deutlich von der des Tetramers. Es wird vorgeschlagen, dass die Tetramer-Schnittstelle unterbrochen wird, um neue Dimer-Dimer-Schnittstellen hervorzurufen, die der Hexamer-Bildung10zugute kommen. S100A12 wird fast ausschließlich von menschlichen Granulozyten ausgedrückt, wo es etwa 5% des gesamten zytosolischen Proteins13ausmacht. In seiner DAMP-Funktion wurde S100A12 historisch als Agonist des Multiligandenrezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) beschrieben, das damals als extrazelluläres neu identifiziertes RAGE-bindendes Protein (EN-RAGE)14bezeichnet wurde. Obwohl wir früher über biochemische S100A12-Bindung sowohl an RAGE als auch an TLR415berichtet haben, haben wir kürzlich gezeigt, dass menschliche Monozyten auf S100A12-Stimulation in einer TLR4-abhängigen Weise reagieren16. Dies erfordert die Anordnung von S100A12 in seine Ca2+/Zn2+-induzierte hexamerische Viertelstruktur16.
Hier beschreiben wir ein Reinigungsverfahren für rekombinantes menschliches S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für Immunzellstimulationen16,17. Diese basiert auf einer zweistufigen Chromatographie-Strategie, die zunächst eine Anionenaustauschsäule umfasst, um das Protein zu isolieren und zu konzentrieren und Massenkontaminationen (z.B. Endotoxine/Lipopolysaccharide) zu entfernen18. Ionenaustauscher-Chromatographieharze trennen Proteine auf der Grundlage unterschiedlicher Netzoberflächenladungen. Bei sauren Proteinen wie S100A12 (isoelektrischer Punkt von 5,81) führt ein Puffersystem mit einem pH-Wert von 8,5 und einem starken Anionenaustauschharz zu einer guten Trennung. Gebundene Proteine wurden mit einem hohen Salzpuffergradienten eluiert. Mit einer Erhöhung der Ionenstärke konkurrieren negative Ionen im Elutionspuffer mit Proteinen um Ladungen auf der Oberfläche des Harzes. Proteine, die je nach Nettoladung einzeln elutieren, und dadurch ermöglichen die hier beschriebenen Puffer, das überexprimierte S100A12-Protein zu isolieren und zu konzentrieren. Aufgrund negativ geladener Gruppen in Lipopolysacchariden binden diese Moleküle auch an Anionenaustauschharze. Ihre höhere Nettoladung führt jedoch zu einer späteren Elution im aufgebrachten Hochsalzgradienten. Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens wurde zu Polierzwecken eingeführt. Dies nutzt die Calciumbindungsfähigkeit von S100A12 und entfernt restliche Verunreinigungen an einer hydrophoben Wechselwirkungssäule. Die Calciumbindung von S100A12 führt zu einer Konformationsänderung und einer Exposition hydrophober Flecken auf der Oberfläche des Proteins. Unter diesem Zustand interagiert S100A12 mit der hydrophoben Oberfläche des Harzes. Bei der Calcium-Chelatierung durch EDTA wird diese Wechselwirkung umgekehrt. In Gegenwart von Ionen, insbesondere Kalzium und Zink, ordnet S100A12 zu homomeren Oligomeren. Um Struktur-Funktions-Beziehungen der verschiedenen Oligomere zu untersuchen, stabilisierten wir dimer, tetramerische und hexamerische Rekombinante S100A12 mit einem chemischen Verklinker und trennten die Komplexe auf einer Farbtonographiesäule mit Größenausschluss. Um die Funktionalität und biologische Aktivität des gereinigten Proteins und seiner ioneninduzierten Oligomere zu analysieren, kann schließlich die Zytokinfreisetzung von S100A12 und LPS stimulierter Monozyten verglichen werden.
Verschiedene Methoden zur Reinigung von S100A12 wurden bisher beschrieben. Jackson et al.19veröffentlichten beispielsweise ein Protokoll mit Reinigung über eine Anionenaustauschsäule und eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Das Feinpolieren an einer Größenausschlusssäule führt zu guten Ergebnissen, ist aber aufgrund der z. B. begrenzten Ladevolumina weniger flexibel in der Skalierbarkeit. Ein anderer Ansatz, veröffentlicht von Kiss et al.20, beschreibt die Reinigung des markierten Proteins über Ni2+ Affinitätsspalte als ersten Reinigungsschritt, gefolgt von enzymatischer Spaltung, um das Tag zu entfernen und weitere Reinigungsschritte. Im Gegensatz zu den vorherzitierten Studien19,20wird das in diesem Protokoll beschriebene produzierte Protein für Experimente an Immunzellen bestimmt. Daher ist eine Rest-Endotoxin-Kontamination aus der Bakterienkultur eine Herausforderung. Obwohl bisher unterschiedliche Ansätze zur Endotoxinentfernung beschrieben wurden, gibt es keine einheitliche Methode, die für eine gegebene Proteinlösung gleich gut funktioniert21,22.
Zusammenfassend kombiniert unser Protokoll die Vorteile einer tagfreien Expression in einem bakteriellen System mit einer effizienten Endotoxinentfernung und einer hohen Ausbeute an reinem Protein.
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Protocol
HINWEIS: Zur Vorbereitung von Puffern und Lagerlösungen finden Sie in der Zusatztabelle 1.
1. Proteinexpression in E. coli
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Klonen
- Klonen Sie tagfreie menschliche S100A12 (NCBI-Referenzsequenz: NP_005612.1) in bakteriellen Expressionsvektor pET11b. Um das Protein auszudrücken, wandeln Sie das Konstrukt in E. coli BL21(DE3) um.
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kultur
- Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml Wachstumsmedium (LB-Brühe mit 100 g/ml Ampicillin) in einem 14 ml Rundbodenrohr impfen. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren. Übertragen Sie 2 x 4 ml Übernachtungskultur in 400 ml Wachstumsmedium in einem 2 L Erlenmayer Kolben und bebrüten die Kultur bei 37 °C mit Schütteln bei 220 U/min.
HINWEIS: Die Anfangsdichte der Hauptkultur sollte die optische Dichte bei 600 nm (OD600) = 0,1 betragen. - Überwachen Sie die OD600 während des Wachstums. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 1 M Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM bei OD600 = 0,5-0,6. Bei 37 °C und 220 Rpm für weitere 4 h inkubieren.
HINWEIS: Im Allgemeinen wird ein OD600 von 0,6 nach 1,5 bis 2,5 h bei 37 °C erreicht. - Bereiten Sie 50 ml Beschallungspuffer vor, indem Sie 50 mM Tris, 50 mM NaCl und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 40 ml entionisiertem Wasser auflösen. PH mit HCl auf 8,0 einstellen und bis zu 50 ml aufstellen. Proteaseinhibitor (1 Tablette pro 50 ml Lösung) hinzufügen und den Puffer auf 4 °C ausdemieren.
- Die Bakterienkultur in geeignete Zentrifugenflaschen übertragen und die Zellen bei 3.200 x g 30 min bei 4 °C ernten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 25 ml eiskaltem Beschallungspuffer wieder auf. Von nun an halten Sie die Zellen auf Eis.
HINWEIS: Resuspendierte Zellen können kurzfristig bei -20 °C und langfristig bei -80 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml Wachstumsmedium (LB-Brühe mit 100 g/ml Ampicillin) in einem 14 ml Rundbodenrohr impfen. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren. Übertragen Sie 2 x 4 ml Übernachtungskultur in 400 ml Wachstumsmedium in einem 2 L Erlenmayer Kolben und bebrüten die Kultur bei 37 °C mit Schütteln bei 220 U/min.
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Beschallung/Lyse
- Sonicate die Zellen für 6 Zyklen von 30 s auf Eis. Nach jedem Zyklus ruhen Zellen für 30 bis 60 s, um die Zellen vor Überhitzung zu schützen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes 50 ml Hochgeschwindigkeitszentrifugationsrohr und Zentrifuge in einem festwinkeligen Rotor bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C. Dekantieren Sie das gereinigte Lysat, das die löslichen zytosolischen Proteine enthält, in ein frisches 50 ml-Rohr und entsorgen Sie das Pellet.
2. Proteinreinigung
- Anionenaustauschchromatographie
- dialyse
- Vorbereiten von Anionenaustauschchromatographie (AIEX) Puffer A durch Auflösen von 20 mM Tris, 1 mM EDTA und 1 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N'N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) in entionisiertem Wasser und stellen Sie den pH auf 8,5 mit HCl ein. Für die Dialyse vorbereiten 2 x 5 L und für die Chromatographie 2x 1 L AIEX Puffer A.
HINWEIS: Das Dialysatvolumen sollte etwa das 100-fache des Probenvolumens betragen. Alle Puffer, die für die Chromatographie verwendet werden, sollten gefiltert (0,45 m oder kleiner) und entgast werden (z. B. durch Ultraschallbad oder Vakuumentgasung). - Dialyseschläuche (Molekulargewichtsabschaltung [MWCO]: 3,5 kDa) in eine geeignete Länge mit zusätzlichem Luftraum schneiden, um den Probenauftrieb über dem rotierenden Rührstab zu gewährleisten.
HINWEIS: Glycerin bewahrt die Membran und muss vor Gebrauch entfernt werden. - Um die Viskosität der geclearten Proteinlösung ab Schritt 1.3.2 zu reduzieren, verdünnen Sie die Lösung mit 25 ml AIEX-Puffer A, um die nachträgliche Anwendung der Chromatographiesäule zu erleichtern. Befestigen Sie den ersten Verschluss an den Schläuchen, laden Sie die Probe in die Membran und befestigen Sie den zweiten Verschluss mindestens 1 cm vom oberen Ende des Schlauches entfernt.
- Legen Sie den 5 L Behälter mit AIEX Puffer A auf eine Rührplatte, fügen Sie einen Rührstab hinzu und die Membran mit Proteinlösung gefüllt. Passen Sie die Geschwindigkeit an, um die Probe zu drehen, indem Sie Interferenzen mit dem rotierenden Rührstab vermeiden. Dialyse für 12 x 24 h bei 4 °C, dann den Dialysatpuffer (AIEX-Puffer A) durch eine frische vorgekühlte Zubereitung ersetzen und mindestens 4 weitere Stunden fortsetzen. Übertragen Sie die dialysierte Proteinlösung in ein 50 ml-Rohr und filtern Sie sie über eine 0,45 m Filtereinheit.
HINWEIS: Lagerung möglich.
- Vorbereiten von Anionenaustauschchromatographie (AIEX) Puffer A durch Auflösen von 20 mM Tris, 1 mM EDTA und 1 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N'N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) in entionisiertem Wasser und stellen Sie den pH auf 8,5 mit HCl ein. Für die Dialyse vorbereiten 2 x 5 L und für die Chromatographie 2x 1 L AIEX Puffer A.
- Chromatographie
- Starten Sie das Flüssigchromatographiesystem (FPLC) mit allgemeiner Wartung, verbinden Sie die Säulenpuffer AIEX A und AIEX B (AIEX Puffer A mit 1 M NaCl) und die anionenaustauschende Harzenthaltende Säule. Allgemeine chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 1.
ANMERKUNG: Puffer, Säulen- und FPLC-Geräte sollten vor Beginn des Laufs auf dieselbe Temperatur ausgeglichen werden (siehe chromatographische Parameter in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4und Tabelle 5). - Die Säule mit dem AIEX-Puffer A auslagern, anschließend die Probe auf die Säule laden und die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% Hochsalzpuffer (AIEX B) auflegen. Ein detailliertes Methodenprotokoll finden Sie in Tabelle 2.
- Sammeln Sie 2 ml-Fraktionen während der Elution und analysieren Sie 10 l jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15% Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Bündeln Sie die Fraktionen, die S100A12-Protein für die Dialyse enthalten.
HINWEIS: Das Molekulargewicht von S100A12 beträgt 10.575 Da.
- dialyse
- Calciumabhängige hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC)
- dialyse
- Dialyse die Proteinlösung gegen 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 nach dem in Abschnitt 2.1.1 beschriebenen Verfahren.
- Chromatographie
- Bereiten Sie 1 L Chromatographiepuffer HIC A vor, indem Sie 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 25 mM CaCl2 in entionisiertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 7,5 einstellen. Für HIC Puffer B 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 50 mM EDTA auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein und filtern und entgasen Sie die Puffer. CaCl2 der Probe zu einer Endkonzentration von 25 mM hinzufügen und durch 0,45 m filtern. HIC-Puffer ausdemieren und auf 4 °C (Säulentemperatur) proben.
- Starten Sie das Flüssigchromatographiesystem mit allgemeiner Wartung, verbinden Sie die Säulenpuffer HIC A und B und die Säule. Weitere chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 3.
- Stellen Sie die Säule aus, laden Sie die Probe und verlängern Sie den Block "Ungebundene Probe waschen", bis das UV-Signal den Basiswert wieder erreicht. Dann beginnen Sie die Elution mit einem Kalziumchelator, der Puffer (EDTA) enthält. Ein detailliertes Methodenprotokoll finden Sie in Tabelle 4.
HINWEIS: Frühere Experimente haben gezeigt, dass ein Überschuss an Kalzium für die Bindung von S100A12 an das Chromatographieharz von Vorteil zu sein scheint. - Sammeln Sie Spitzenfraktionen von 2 ml und analysieren Sie 10 l von jedem Anteil auf einem Coomassie-gefärbten 15% SDS-PAGE. S100A12-Fraktionen bündeln und gegen Hepes-gepufferte Saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) dialysieren, wie in Abschnitt 2.1.1 beschrieben.
HINWEIS: Der Aussterbekoeffizient des monomeren S100A12 beträgt 2980 M-1 cm-1.
- dialyse
3. Nachweis und Entfernung von Endotoxin
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Nachweis von Endotoxin
- Zur Bestimmung der Endotoxinkontamination die Konzentrationen des verdünnten Proteins ab Schritt 2.2.2.4 messen. (z. B. 1:10 und 1:100 in HBS) mit einem enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA)-basierten, fluoreszierenden Endotoxin-Nachweisassay (Materialtabelle). Führen Sie diesen Test durch Befolgen des Herstellerprotokolls durch.
HINWEIS: Verwenden Sie frisch zubereitete HBS-Lösungen, die in ultrareinem entionisiertem Wasser gelöst werden, um eine (neue) Endotoxinkontamination durch den Puffer zu vermeiden.
- Zur Bestimmung der Endotoxinkontamination die Konzentrationen des verdünnten Proteins ab Schritt 2.2.2.4 messen. (z. B. 1:10 und 1:100 in HBS) mit einem enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA)-basierten, fluoreszierenden Endotoxin-Nachweisassay (Materialtabelle). Führen Sie diesen Test durch Befolgen des Herstellerprotokolls durch.
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Entfernung von Endotoxin und Proteinkonzentration
- 15 ml Probe ca. 10 min auf eine 50 kDa Zentrifugalfiltereinheit und Zentrifuge bei 3.200 x g und 10 °C laden. Durchfluss in ein frisches Gefäß (auf Eis) übertragen und das 50 kDa Filterrohr so oft wie nötig nachfüllen und zentrieren. Waschen Sie die Filtermembran zweimal mit HBS, um nach jedem Schritt so viel Protein wie möglich zurückzugewinnen.
- Konzentrieren Sie den S100A12-haltigen Durchfluss mit einem 3 kDa Zentrifugalfilter, bis das Volumen auf ein Fünftel bis zu einem Zehntel des ursprünglichen Ladevolumens reduziert wird (Zentrifugation bei 3.200 x g,10 °C für ca. 30 min). Füllen Sie den Filter so oft wie nötig, spülen Sie die Membran ab und übertragen Sie die konzentrierte Lösung nach jeder Nachfüllung in ein neues Rohr. Entsorgen Sie den Durchfluss. Filtern Sie erneut durch 50 kDa, wie oben beschrieben.
HINWEIS: Während dieses Verfahrens ist der Proteinverlust bemerkenswert (bis zu 50%), aber die verbleibende Proteinzubereitung ist vollständig aus LPS erschöpft. Diese Methode liefert etwa 10 x 15 mg Protein aus 400 ml Kultur. - Stellen Sie die Proteinlösung mit endotoxinfreiem HBS auf 1 mg/ml ein und messen Sie den LPS-Gehalt wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. Falls die Proteinlösung noch nicht als LPS-frei (<0.1 EU/ml) getestet wird, beseitigen Sie Restkontaminationen mit einem Endotoxin-Entfernungsharz.
HINWEIS: Bei einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml entspricht die Kontamination von 0,1 EU/ml LPS etwa 0,01 pg LPS/g Protein.
4. Chemische Vernetzung und Oligomertrennung
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Chemische Vernetzung
- Bereiten Sie hochreine (endotoxinfreie) Stofflösungen von 1 M CaCl2 und 100 mM ZnCl2 in ultrareinem deionisiertem Wasser(Materialtabelle)vor. Verwenden Sie diesen Puffer, frisch gemacht, für den nächsten Schritt.
- 10 ml gereinigtes Endotoxinfreies S100A12 (Konzentration 1 mg/ml in HBS) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit entweder 25 mM CaCl2 für Dimeric/Tetramer, oder 25 mM CaCl2 und 1 mM ZnCl2 für hexameric/tetramere S100A12 Oligomere.
- Bereiten Sie den Vernetzener vor, indem Sie 8 mg BS3 in 500 l Endotoxin-freies Wasser direkt vor gebrauchen auflösen (8 mg Vernetzen für 10 ml ionenspiked Proteinlösung entspricht einer Endkonzentration von 1,4 mM). Vernetzen und Proben durch Pipettieren mischen und für weitere 30 min bei RT brüten. Die Reaktion durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 50 mM und Filter durch 0,45 m ablöschen.
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Größenausschlusschromatographie
- Die vernetzte Probe auf 12 bis 15 °C (Säulentemperatur) ausdemieren und das Flüssigchromatographiesystem mit allgemeiner Wartung starten. Verbinden Sie den Spaltenpuffer (HBS) und die Spalte Größenausschluss. Ausführliche Informationen finden Sie in Tabelle 5.
- Gleichgewichten Sie die Spalte in HBS, laden Sie die Probe aus und sammeln Sie Spitzenbrüche (1 x 2 ml) während des Laufs. Analysieren Sie diese Brüche auf einem 4-20%igen Gradienten SDS-PAGE und Pool-Fraktionen mit Hauptbändern des gewünschten Proteinkomplexes.
HINWEIS: Die Hydrolyse von NHS-Ester-Reagenzien wie BS3 in wässrigen Lösungen führt zu einer starken Absorption bei 280 nm. Ungebundener Vernetzender (Molekulargewicht: 572 g/mol) elutiert am Ende des Laufs und führt zu einem starken Peak. - Konzentrieren Sie die Lösungen durch den Einsatz von Zentrifugalfiltereinheiten mit MWCOs von 10 kDa (Dimer), 30 kDa (Tetramer) oder 50 kDa (Hexamer). Bestimmen Sie die Endotoxinkontamination, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Entfernen Sie ggf. das verbleibende LPS mit einem Endotoxinentfernungsharz nach den Empfehlungen des Herstellers (Materialtabelle).
5. Funktionstests an Monozyten
- Zubereitung von Monozyten
- Isolieren Sie Monozyten von menschlichen Buffy-Schichten durch Dichtegradientenzentrifugation und anschließende Monozytenanreicherung mit einem magnetischen Perlentrennsatz (Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Dieses Protokoll führt zu ca. 5 x 7 x 107 Monozyten (ein buffy Mantel) mit einer Reinheit von 83 x 95%. Da die Anzahl, aber auch die Reaktionsfähigkeit der Zellen stark vom Spender abhängt, muss das Protokoll möglicherweise skaliert werden (abhängig von der erforderlichen Zellzahl). - Für die Dichtezentrifugation die Trennlösung (Dichte = 1,077 g/ml) auf RT ausdemieren und 20 ml in 50 ml Zentrifugenrohre (2 Tuben pro Buffy-Schicht) übertragen. Blut aus dem menschlichen Buffy-Mantel mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) auf ein Gesamtvolumen von 60 ml verdünnen und 30 ml dieser Mischung sorgfältig auf das Trennmedium schichten. Zentrifuge bei 550 x g für 35 min bei RT. Deaktivieren Sie die Zentrifugenbremse.
- Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären peripheren Blutkörperchen (PBMCs) direkt auf dem Trennmedium. Übertragen Sie diese Zellen in ein frisches 50 ml Zentrifugenrohr, machen Sie bis zu 50 ml mit HBSS und Zentrifuge bei 170 x g für 10 min. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in einem kleinen HBSS-Volumen durch Pipettieren wieder aufsetzen.
- Füllen Sie das Rohr bis zu 50 ml und Zentrifuge bei 290 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand erneut, setzen Sie die Zellen in HBSS (50 ml) und Zentrifuge bei 170 x g für 10 min. Zählen Sie die Zellen und setzen Sie sie im Zelltrennpuffer wieder aus (Tabelle der Materialien /c9>) auf eine Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml.
HINWEIS: Anstelle von HBSS kann phosphatgepufferte Saline (PBS) zum Waschen der Zellen verwendet werden. - Verwenden Sie für die Monozytenisolation von PBMCs ein magnetisches Negativzellisolationskit und folgen Sie dem Herstellerprotokoll. Monozyten zählen und in Monozytenmedium (RPMI 1640, 15% hitzeinaktiviertes fetales Kalbsserum [FCS], 4 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin) auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zählen.
- Zur Kultur monozyten, Mantel Kulturgerichte (z.B. 100 mm) mit einem hydrophoben, gasdurchlässigen Film, geeignet fürSuspensionszellen( Tisch der Materialien ). Sterilisieren Sie die Platten mit UV-Licht ca. 30 min. Übertragen Sie die Zellen auf diese Kulturplatten und lassen Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5%CO2ruhen.
HINWEIS: Verwenden Sie 15 bis 25 ml Zellsuspension pro beschichteter Schale.
- Isolieren Sie Monozyten von menschlichen Buffy-Schichten durch Dichtegradientenzentrifugation und anschließende Monozytenanreicherung mit einem magnetischen Perlentrennsatz (Tabelle der Materialien).
- Monozytenstimulation
- Stimulation mit S100A12 (Wildtyp)
HINWEIS: Um unbehandeltes S100A12 (Endprodukt aus Abschnitt 2.2.2) von vernetztem Protein zu unterscheiden, wird S100A12 im Folgenden als "Wildtyp" bezeichnet.- Übertragen Sie die ausgeruhten Zellen in ein 50 ml Zentrifugalrohr und Zentrifuge bei 350 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im Stimulationsmedium (RPMI 1640, 5% hitzeinaktiviertes FCS, 4 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/ Streptomycin) in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml.
- Zur Stimulation verwenden Sie 24 Well Suspension Platten und fügen Sie 250 l Zellsuspension pro Bohrkörper (0,5 x 106 Zellen/Well) hinzu. Fügen Sie den vorgesehenen Brunnen 50 g/ml Polymyxin B hinzu, gefolgt von LPS in verschiedenen Konzentrationen (25, 50, 100 und 200 pg/ml) oder dem Wildtyp S100A12 (10, 20, 40, 60 g/ml). Wenden Sie das Protein entweder unbehandelt oder wärmedenaturiert (99 °C, 10 min) in verschiedenen Konzentrationen auf die Zellen an.
HINWEIS: Eine kurze Wärmebehandlung denaturiert S100A12 Protein, hat aber weniger bis gar keine Auswirkungen auf LPS. - Inkubationsplatten für 4 h bei 37 °C und 5%CO2. Ernte der Zellen durch Übertragung der Zellsuspension jedes Brunnens auf 1,5 ml Reaktionsröhren. Zentrifuge bei 500 x g für 10 min. Überführen Sie die Überräube in frische Schläuche und messen Sie die TNF-Freisetzung in verschiedenen Verdünnungen (z.B. 1:2, 1:5, 1:10) mit einem menschlichen TNF-ELISA-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers.
- Stimulation mit S100A12 Oligomeren
- Bereiten Sie Monozyten in 24 gut aufhängungen Platten wie oben beschrieben vor und säen Sie sie aus. Stimulieren Sie Zellen durch Zugabe von S100A12-Oligomeren aus Schritt 4.2.3. in verschiedenen Molkonzentrationen (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
HINWEIS: Um die Fähigkeiten der verschiedenen Oligomere zur Stimulierung von Monozyten zu vergleichen, wurden Oligomere in vergleichbaren Molkonzentrationen auf die Zellen aufgetragen. - Inkubieren Sie für 4 h bei 37 °C und 5%CO2, ernten Sie die Zellen und messen Sie die TNF-Freisetzung in den Überstand, wie oben beschrieben.
- Bereiten Sie Monozyten in 24 gut aufhängungen Platten wie oben beschrieben vor und säen Sie sie aus. Stimulieren Sie Zellen durch Zugabe von S100A12-Oligomeren aus Schritt 4.2.3. in verschiedenen Molkonzentrationen (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Stimulation mit S100A12 (Wildtyp)
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Representative Results
Nach vorerierierweiser AIEX-Säule (Abbildung 1A-C) und anschließender kalziumabhängiger HIC (Abbildung 2A,B) wurde hochreines Protein gewonnen (Abbildung 2C). Darüber hinaus ergaben Messungen von Endotoxin eine erfolgreiche LPS-Entfernung. Der LPS-Gehalt nach AIEX wurde in einer Verdünnung von 1:10 über dem Assay-Nachweisgrenzwert, d. h. über 500 EU/ml, gemessen. Nach der ersten Filtration durch eine 50 kDa Filtereinheit wurde der LPS-Gehalt auf 1 EU/ml reduziert. Nach Konzentration mit einer 3 kDa-Filtereinheit und zusätzlicher Filtration durch 50 kDa betrug die gemessene LPS-Kontamination 0,08 EU/ml.
Als zusätzliche Kontrolle wurden menschliche Monozyten mit dem produzierten Wildtypprotein stimuliert (Abbildung 3A,B). Die Polymyxin-B-Behandlung hebt die TNF-Freisetzung aus LPS-stimulierten Monozyten auf, die mit S100A12 nicht beobachtet werden kann. Auf der anderen Seite schafft die Wärmebehandlung von LPS und S100A12 die Fähigkeit des Proteins, Zellen zu stimulieren, während dies die zelluläre Reaktion auf LPS-Stimulation nicht beeinflusst.
Die Proteinexposition gegenüber verschiedenen Ionen führt zur Anordnung verschiedener S100A12-Oligomere (Abbildung 4A). Die chemische Vernetzung ermöglicht die Erfassung definierter Komplexe wie Dimer, Tetramere und Hexamer sowie Übergangszustände (z. B. "Trimer", Band bei ca. 30 kDa). Um eine ausgeprägte Verschiebung des Oligomer-Gleichgewichts vor der Vernetzung zu induzieren, wurde ein Ionenüberschuss angewendet (Abbildung 4B).
Isolierte Oligomere in gleichen Molkonzentrationen (Abbildung 5A-C) wurden dann zur Monozytenstimulation verwendet, um Signalfähigkeiten über PRRs zu vergleichen. Monozyten-Stimulation mit hexamerischer S100A12 führte zu ausgeprägter TNF-Freisetzung (Abbildung 6 ). Die Freisetzung von Zytokin könnte aus Zellen nachgewiesen werden, die mit tetramerischem S100A12 stimuliert werden, während die Behandlung mit dimerem Protein keine TNF-Freisetzung induziert.
Abbildung 1: Ergebnisse der Anionenaustauschchromatographie. (A) Ein Chromatogramm mit Absorption bei 280 nm (A280) und dem Prozentsatz des Elutionspuffers B (gestrichelte Linie). Methodenblöcke werden mit A = ungebundene Probe waschen, B = linearer Gradient mit Elutionspuffer (Puffer B), C = Auswaschen mit Puffer B und D = Regleichgewicht in Puffer A. (B) Fokus auf die relevanten Spitzen mit Bruchrohrnummern in Rot. (C) Ausgewählte Fraktionen wurden auf 15% Coomassie-gebeizt SDS-PAGE analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ergebnisse der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie. (A) Ein Chromatogramm mit Absorption bei 280 nm (A280) und dem Prozentsatz des Elutionspuffers B (gestrichelte Linie). Methodenblöcke werden mit A = ungebundene Probe waschen, B = Elution mit Puffer B und C = Re-Gleichgewicht in Puffer A angezeigt. (B) Fokus auf die relevanten Spitzen mit Bruchrohrnummern in Rot. (C) Analysierte Brüche auf 15% Coomassie-gebeiztS-PAGE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Primäre menschliche Monozyten wurden bei indizierten Konzentrationen stimuliert. LPS (A) oder S100A12 (Wildtyp, B) wurden unbehandelt oder wärmedenaturiert (99 °C, 10 min). Beide Bedingungen wurden in Gegenwart und Abwesenheit von Polymyxin B getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Das S100A12-Protein wurde nach der Inkubation im HBS-Puffer mit 5 mM Ca2+ mit BS3 vernetzt und zeigte Zn2+-Konzentrationen an. (A) Steigende Zn2+-Konzentrationen induzieren die Anordnung von S100A12 in Tetramere und Hexamer bei Trennung auf 4-20% Coomassie-gebeiztem SDS-PAGE. (B) Repräsentatives Ergebnis vernetzter Oligomere mit Bedingungen, die für die Trennung an einer Größenausschlusssäule verwendet werden. S100A12 wurde in Anwesenheit von 25 mM Ca2+ (Spur 1) oder 25 mM Ca2+ und 1 mM Zn2+ (Spur 2) vernetzt. (S100A12) 2 = Dimer; (S100A12) 4 = Tetramer; (S100A12) 6 = hexamer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: S100A12-Oligomere wurden auf einer Größenausschlusssäule getrennt. (A) Chromatogramm der Hexamer/Tetramer-Trennung nach Vernetzung im HBS-Puffer mit 25 mM CaCl2 und 1 mM ZnCl2. (B) Chromatogramm zur Tetramer-/Dimertrennung im HBS-Puffer mit 25 mM CaCl2. (C) Beispiel für gepoolte und konzentrierte Oligomere nach Trennung auf einem Coomassie-gefärbten 4-15% Gradienten SDS-PAGE. Spur 1 = Dimer; Spur 2 = Tetramer; Spur 3 = hexamer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Stimulation von Monozyten mit gereinigten S100A12-Oligomeren. Die TNF-Freisetzung nach 4 h Inkubation wurde durch ELISA quantifiziert. Die Daten zeigen den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bettvolumen (CV) | 75 ml |
| klassenordner | Absorption bei 280 nM |
| Druck Max | 3 bar |
| Spaltenpuffer A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Spaltenpuffer B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Beispielvolumen | veränderlich |
| Durchflussrate | 1 x 2 mL/min |
| temperatur | 4 °C |
Tabelle 1: Detaillierte Informationen zu den angewandten Parametern der Anionenaustauschchromatographie.
| block | Volumen | stoßdämpfer | auslaß |
| Gleichgewicht | 1-2-Spalten-Volumes (CVs) | pro | verschwenden |
| Probenlast | k.A. | pro | verschwenden |
| Ungebundenes Beispiel auswaschen | 1 Lebenslauf | pro | Hochvolumiger Auslass |
| Gradient-Elution | 0 bis 100 % Puffer B in 1 CV | A bis B | Fraktionssammler |
| Auswaschen –Puffer B | 1 Lebenslauf | B | verschwenden |
| Re-Equilibration | 2 Lebensläufe | pro | verschwenden |
Tabelle 2: Detaillierte Informationen über die angewandte Methode der Anionenaustauschchromatographie.
| Bettvolumen (CV) | 125 ml |
| klassenordner | Absorption bei 280 nM |
| Druck Max | 4 bar |
| Spaltenpuffer A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Spaltenpuffer B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Beispielvolumen | veränderlich |
| Durchflussrate | 1 x 2 mL/min |
| temperatur | 4 °C |
Tabelle 3: Detaillierte Informationen zu den angewandten Parametern der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie.
| block | Volumen | stoßdämpfer | auslaß |
| Gleichgewicht | 1-2-Spalten-Volumes (CVs) | pro | verschwenden |
| Probenlast | k.A. | pro | verschwenden |
| Ungebundenes Beispiel auswaschen | 1 x 2 Lebensläufe | pro | Hochvolumiger Auslass |
| Elution | 100 % Puffer B | B | Fraktionssammler |
| Auswaschen –Puffer B | 1 Lebenslauf | B | verschwenden |
| Re-Equilibration | 2 Lebensläufe | pro | verschwenden |
Tabelle 4: Detaillierte Informationen über die verwendete Methode der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie.
| Bettvolumen (CV) | 320 ml |
| klassenordner | Absorption bei 280 nm |
| Druck Max | 3 bar |
| Spaltenpuffer A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Beispielvolumen | Bis zu 13 ml |
| Durchflussrate | 1 bis 1,5 mL/min |
| temperatur | 12 bis 15 °C |
Tabelle 5: Detaillierte Informationen zu den angewandten Parametern der Größenausschlusschromatographie.
Ergänzende Tabelle 1: Vorbereitung von Puffern und Lagerlösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die tagfreie bakterielle Expression des menschlichen S100A12 und seine Reinigung sowie die Trennung in verschiedene Ionen-induzierte Oligomere zur Immunzellstimulation. Im Vergleich zur veröffentlichten Literatur zur S100A12-Proteinreinigung8,23,24ist die Verwendung von hohem CaCl2 (25 mM) in der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unseres Wissens einzigartig. Mehrere Protokolle, die Konzentrationen von 1 bis 5 mM anwenden, produzieren reines Protein, aber wir beobachteten eine um ein Vielfaches höhere Ausbeute nach unserem Ansatz mit 25 mM CaCl2 statt. Dies könnte durch eine Hierarchie der Proteininteraktion mit dem Säulenmaterial erklärt werden:S100A12 kann direkt an das Säulenmaterial binden, aber der Überschuss von Ca2+ kann auch die indirekte Bindung von S100A12-Dimeren an das bereits säulengebundene Protein erleichtern. 8. So können hohe Ca2+-Konzentrationen die für die S100A12-Reinigung verfügbare Oberfläche vergrößern. Elution (unter Verwendung eines linearen Gradienten) von S100A12 von HIC als eine frühe (indirekt gebundene S100A12) und eine sehr späte Spitze (Spaltenmaterial gebundenes Protein) kann diese Spekulation unterstützen (Daten nicht gezeigt).
Für die Herstellung von rekombinantem S100A12 (sowie anderen Proteinen) zu hohen Erträgen und überschaubaren Kosten ist die Proteinexpression in E. coli nach wie vor die Methode der Wahl. Die unvermeidliche Kontamination mit bakteriellen Endotoxinen bleibt jedoch ein Problem, wenn Proteine für Zellkulturexperimente bestimmt werden, insbesondere in Studien mit angeborenen Immunzellen. Unserer Erfahrung nach können selbst kommerziell erhältliche Proteine, die explizit für die Zellkultur-Nutzung deklariert wurden, Endotoxinkontaminationen bis zu 1 EU/g-Protein enthalten, was die Assays erheblich verzerren kann. Daher ist eine vollständige Entfernung von Endotoxinen obligatorisch. Endotoxinmonomere in Lösung reichen von Molekulargewichten von 10 bis 20 kDa, können aber Mizellen und Strukturen mit höheren Molekulargewichten bilden. Die Bildung sehr großer Strukturen wird z.B. durch bivalente Ionen21,25gefördert.
Gemäß unserem Protokoll überprüfen wir die endotoxinfreie Produktion von S100A12-Proteinen durch Kombination hochempfindlicher Endotoxinmessungen mit Monozytenstimulationstests. Wir halten eine solche Kombination für besonders sinnvoll wie a) eine Kontamination mit niedrigem Niveau kann je nach Empfindlichkeit des Assays schwer zu beurteilen sein und b) die Verwendung von Polymyxin B als LPS-Inhibitor auf Monozyten kann zu schwierigen Interpretationsdaten führen, die exklusive Polymyxin-B-Effekte auf die Zellen26,27. Polymyxin B sowie andere kationische Peptide werden berichtet, lpS über negativ geladenes Lipid A28zu binden. Da die lösungsmittelexponierte Oberfläche von S100A12 auch große negativ geladene Pflaster enthält, kann die beobachtete Reduktion der TNF-Freisetzung von S100A12-stimulierten menschlichen Monozyten in Gegenwart von Polymyxin B (Abbildung 3B) auf eine) unspezifische direkte Bindung von Polymyxin B bis S100A12 und/oder b) direkte Wirkungen von Polymyxin B auf stimulierte Zellen26,27. Aufgrund der bekannten Einschränkungen sowohl des Nachweises von Low-Level-Endotoxinkontamination als auch unspezifischer Polymyxin-B-Effekte enthält unser Protokoll weiterhin einen Wärme-Inaktivierungsschritt, um klar zwischen LPS- und proteinvermittelter TLR4-Signalisierung zu unterscheiden.
Die Verwendung von LPS-freiem S100A12 zur Erzeugung und Reinigung definierter Ionen-induzierter Oligomere ist von entscheidender Bedeutung, und es sollte deren nachträgliche Reinigung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden, um eine eventuelle Wiedereinführung von Endotoxin über Puffer oder Säulenmaterial und damit weitere proteinintensive LPS-Depletion über Endotoxin-Entfernungsharze.
Die Relevanz der Oligomerisierung für die biologische Funktion von Proteinen kann mit unterschiedlichen Mitteln beurteilt werden. Im Falle von S100A12 haben wir sowohl Oberflächen-Plasmonresonanz als auch gezielten Aminosäureaustausch an Ionenbindungsstellen verwendet und , um den Proteinkomplex, der durch TLR4 binden und signalisieren kann, am genauesten definieren – wir haben chemische Vernetzung von Ca2+/Zn 2+ eingesetzt. -gepulstes rekombinantes S100A1216. Chemische Vernetzung von S100A12 unter verschiedenen ionischen Bedingungen Snap-Freezes einen momentanen Zustand einschließlich mehrerer oligomerer Formen, die im Übergang sind. Aus Ionentitrationsexperimenten definierten wir Bedingungen, unter denen dimerische, tetramerische oder hexamerische Oligomere als die vorherrschenden Oligomere bestimmt werden konnten16. Darüber hinaus haben frühere Experimente gezeigt, dass ein Überschuss an Ionen für eine vergleichbare, stabile Vernetzung und nachfolgende Reinigung von Vorteil ist, obwohl die Oligomerisierung auch bei deutlich niedrigeren Ionenkonzentrationen induziert werden kann. Die Reinigung dieser Oligomere durch Größenausschlusschromatographie führt jedoch zu einer guten, aber nicht absoluten Trennung. Dennoch ermöglicht die selektive Anreicherung von Oligomeren zuverlässige nachgelagerte Analysen.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll eine Methode zur Reinigung von LPS-freien menschlichen S100A12 oder verwandten Calciumbindungsproteinen. Um ioneninduzierte Konformationsveränderungen zu beheben, ist die chemische Vernetzung und die anschließende komplexe Trennung durch Größenausschlusschromatographie ein nützliches Werkzeug, um die Relevanz der Proteinoligomerisierung für nachgelagerte biologische Prozesse zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Stipendien des intramuralen innovativen medizinischen Forschungsprogramms der Medizinischen Fakultät der Universität Münster (KE121201 bis C.K.) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fo354/3-1 bis D.F.)unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
