Summary
Este protocolo describe un método de purificación para la proteína de unión al calcio sin etiquetas recombinante S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones para ensayos de estimulación de monocitos humanos.
Abstract
En este protocolo, describimos un método para purificar la proteína humana de unión al calcio S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones del cultivo de Escherichia coli para estimulaciones de células inmunitarias. Este protocolo se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que comprende la pre-purificación de proteínas en una columna de cromatografía de intercambio de aniones y un paso de pulido posterior en una columna de interacción hidrofóbica. Esta estrategia produce proteína S100A12 de alta pureza y rendimiento a costos manejables. Para ensayos funcionales en células inmunitarias, la contaminación por endotoxinas remanentes requieren un control cuidadoso y más pasos de limpieza para obtener proteínalibre de endotoxinas. La mayoría de las contaminaciones por endotoxinas pueden excluirse mediante cromatografía de intercambio de aniones. Para agotar las contaminaciones residuales, este protocolo describe un paso de eliminación con filtros centrífugos. Dependiendo de la resistencia iónal disponible S100A12 puede organizarse en diferentes homomultimers. Para investigar la relación entre estructura y función, este protocolo describe además el tratamiento iónico de la proteína S100A12 seguido de la reticulación química para estabilizar los oligómeros S100A12 y su posterior separación por exclusión de tamaño Cromatografía. Por último, describimos un ensayo a base de células que confirma la actividad biológica de la proteína purificada y confirma la preparación libre de LPS.
Introduction
S100A12 es una proteína de unión al calcio que es producida predominantemente por granulocitos humanos. La proteína se sobreexpresa durante la inflamación (sistémica) y sus niveles séricos, particularmente en enfermedades (auto)inflamatorias como la artritis idiopática juvenil sistémica (SJIA), la fiebre mediterránea familiar (FMF) o la enfermedad de Kawasaki (KD) pueden informar sobre actividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia. Dependiendo de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como receptores similares a los peajes (TLR), el sistema inmunitario innato puede ser activado por patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) como lipopolisacáridos (LPS) o patrones moleculares asociados al daño (DPP; también se denominan "alarmins"). Los DAPP son moléculas endógenas como proteínas celulares, lípidos o ácidos nucleicos1. Las funciones DAMP están bien descritas para los miembros de la familia de proteínas de calgranulina, S100A8/A9 y S100A122, que también se informa que funcionan como péptidos antimicrobianos de iones metálicos divalentes3,4, 5,6. Dependiendo de la resistencia iónica disponible S100A12 puede, al igual que otros miembros de la familia S100, organizarse en diferentes homomultimeros y hasta hace poco se desconocía el impacto del oligomerización S100A12 en la interacción PRR, particularmente TLR4.
La forma monomérica de la proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste en dos estructuras de hélice-bucle-hélice de mano EF conectadas por un vinculador flexible. El C-terminalEF-hand contiene el motivo clásico de unión Ca2+,mientras que el N-terminalEF-hand exhibe una estructura de bucle extendido específica de proteína S100 ('pseudo-EF-hand') y revela una reducción de Ca2+-afinidad. Ca2+-unión por S100A12 puede inducir un cambio de conformación importante en la proteína' C-terminus, que resulta en la exposición de un parche hidrófobo en cada monómero y forma la interfaz de dimerización. Así, en condiciones fisiológicas, la estructura cuaternaria más pequeña formada por S100A12 es un dímero no covalente (aproximadamente 21 kDa) en el que los monómeros individuales están en orientación antiparalela. Cuando se organiza como dimer, S100A12 se divulga para secuestrar Zn2+ así como otros iones de metal divalente, por ejemplo, Cu2+ con alta afinidad7. Estos iones están coordinados en la interfaz de dimer S100A12 por los aminoácidos H15 y D25 de una subunidad y H85, así como H89 de la subunidad antiparalela8,9,10. Mientras que estudios anteriores proponen que Zn2+-cargado S100A12 puede inducir la organización de la proteína en homo-tetrameros (44 kDa) y para dar lugar a un aumento de Ca2+-afinidad11,12, reciente valoración de metal estudios6 sugieren Ca2+-unión por S100A12 para aumentar la afinidad de la proteína a Zn2+. Una vez que las manos EF S100A12 están completamente ocupadas por Ca2+,se cree que Ca2+ adicional se une entre dimers, desencadenando la formación de hexamer (aproximadamente 63 kDa). La arquitectura de la estructura de los barrios hexamíricos es claramente diferente de la del tetrámero. Se propone que la interfaz de los tetrámeros se interrumpa para dar lugar a nuevas interfaces dimer-dimer que benefician la formación de hexamer10. S100A12 es expresado casi exclusivamente por granulocitos humanos donde constituye alrededor del 5% de toda la proteína citosólica13. En su función DAMP S100A12 fue históricamente descrito como agonista del receptor multi-ligand para productos finales de glicación avanzada (RAGE), luego denominado proteína de unión RAGE (EN-RAGE)14. Aunque anteriormente informamos bioquímico S100A12-unión a RAGE y TLR415, recientemente demostramos monocitos humanos para responder a la estimulación S100A12 de una manera dependiente de TLR416. Esto requiere la disposición de S100A12 en su Ca2+/Zn2+-inducida estructura de trimestral hexameric16.
Aquí describimos un procedimiento de purificación para el S100A12 humano recombinante y sus oligómeros inducidos por iones para estimulaciones celulares inmunes16,17. Esto se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que inicialmente incluye una columna de intercambio de aniones para aislar y concentrar la proteína y eliminar las contaminaciones a granel (por ejemplo, endotoxinas/lipopolisacáridos)18. Las resinas de cromatografía de intercambio iónico separan las proteínas sobre la base de diferentes cargas netas de superficie. Para proteínas ácidas como S100A12 (punto isoeléctrico de 5.81), un sistema tampón con un pH de 8.5 y una resina fuerte de intercambio de aniones conduce a una buena separación. Las proteínas enlazadas se eluyen con un gradiente de tampón de alta sal. Con un aumento de iones negativos de fuerza iónica en el tampón de elución competir con las proteínas para las cargas en la superficie de la resina. Las proteínas eluyen individualmente dependiendo de su carga neta y en consecuencia, los tampones descritos en este documento permiten aislar y concentrar la proteína S100A12 sobreexpresada. Debido a grupos cargados negativamente en lipopolisacáridos, estas moléculas también se unen a resinas de intercambio de aniones. Sin embargo, su mayor carga neta resulta en la elución posterior en el gradiente de alta sal aplicado. El segundo paso del procedimiento de purificación se ha introducido con fines de pulido. Esto hace uso de la capacidad de unión al calcio de S100A12 y elimina las impurezas restantes en una columna hidrofóbica-interacción. La unión al calcio de S100A12 conduce a un cambio de conformación y a una exposición de parches hidrófobos en la superficie de la proteína. En esa condición, S100A12 interactúa con la superficie hidrófoba de la resina. Al quelar el calcio por EDTA, esta interacción se invierte. En presencia de iones, especialmente calcio y zinc, S100A12 se organiza en oligómeros homoméricos. Para estudiar las relaciones estructura-función de los diferentes oligómeros, estabilizamos el recombinante dimerico, tetramírico y hexámero S100A12 con un retitulador químico y separamos los complejos en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Por último, para analizar la funcionalidad y la actividad biológica de la proteína purificada y sus oligómeros inducidos por iones, se puede comparar la liberación de citoquinas de S100A12 y lpS estimulado monocitos.
Hasta el momento se han descrito varios métodos para purificar S100A12. 19, por ejemplo, publicaron un protocolo con purificación a través de una columna de intercambio de aniones y una posterior cromatografía de exclusión de tamaño. El pulido de purificación en una columna de exclusión de tamaño da como resultado buenos resultados, pero, por ejemplo, debido a volúmenes de carga limitados, es menos flexible en escalabilidad. Un enfoque diferente, publicado por Kiss et al.20, describe la purificación de la proteína etiquetada a través de la columna de afinidad Ni2+ como el primer paso de purificación, seguido de escisión enzimática para eliminar la etiqueta y otros pasos de purificación. A diferencia de los estudios citados19,20, la proteína producida como se describe en este protocolo se determina para experimentos en células inmunitarias. Por lo tanto, la contaminación por endotoxinas remanentes del cultivo bacteriano es un desafío. Aunque hasta ahora se han descrito diferentes enfoques para la eliminación de endotoxinas, no existe un método uniforme que funcione igual de bien para cualquier solución proteicadada 21,22.
En resumen, nuestro protocolo combina las ventajas de una expresión libre de etiquetas en un sistema bacteriano con eliminación eficiente de endotoxinas y alto rendimiento de proteína pura.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla Suplementaria 1 para la preparación de tampones y soluciones de stock.
1. Expresión de proteínas en E. coli
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Clonación
- Clonar sin etiquetas s100A12 (secuencia de referencia NCBI: NP_005612.1) en vector de expresión bacteriana pET11b. Para expresar la proteína, transforme la construcción en E. coli BL21(DE3).
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Cultura
- Preparar un cultivo inicial inoculando una sola colonia en 5 ml de medio de crecimiento (caldo LB con ampicilina de 100 g/ml) en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 220 rpm. Transfiera 2 x 4 ml de cultivo nocturno a 400 ml de medio de crecimiento en un matraz Erlenmayer de 2 L e incubar el cultivo a 37 oC con agitación a 220 rpm.
NOTA: La densidad inicial del cultivo principal debe ser la densidad óptica a 600 nm (OD600) a 0,1. - Supervise el OD600 durante el crecimiento. Inducir la expresión de proteína mediante la adición de 1 M isopropyl-a-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración final de 1 mM a OD600 a 0,5 x 0,6. Incubar a 37oC y 220 rpm por 4 h adicionales.
NOTA: En general, se alcanzará una DoT600 de 0,6 después de 1,5 x 2,5 h a 37 oC. - Preparar el tampón de sonicación de 50 ml disolviendo 50 mM Tris, 50 mM NaCl y 1 mM de ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) en 40 ml de agua desionizada. Ajuste el pH con HCl a 8,0 y haga hasta 50 ml. Añadir inhibidor de la proteasa (1 comprimido por solución de 50 ml) y equilibrar el tampón a 4 oC.
- Transfiera el cultivo bacteriano a botellas de centrífuga adecuadas y cosecha las células a 3.200 x g durante 30 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 25 ml de tampón de sonicación helada. A partir de ahora mantén las células en hielo.
NOTA: Las celdas resuspendidas se pueden almacenar a -20 oC a corto plazo y a -80 oC a largo plazo.
- Preparar un cultivo inicial inoculando una sola colonia en 5 ml de medio de crecimiento (caldo LB con ampicilina de 100 g/ml) en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 220 rpm. Transfiera 2 x 4 ml de cultivo nocturno a 400 ml de medio de crecimiento en un matraz Erlenmayer de 2 L e incubar el cultivo a 37 oC con agitación a 220 rpm.
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Sonicación/lisis
- Sonicar las células durante 6 ciclos de 30 s en hielo. Después de cada ciclo, las células de reposo durante 30 a 60 s para proteger las células del sobrecalentamiento.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrifugación de alta velocidad pre-enfriado de 50 ml y centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 15.000 x g durante 30 min a 4 oC. Decantar el lisato transparente que contiene las proteínas citosólicas solubles en un tubo fresco de 50 ml y desechar el pellet.
2. Purificación de proteínas
- Cromatografía de intercambio de aniones
- Diálisis
- Preparar el tampón A de la cromatografía de intercambio de aniones (AIEX) mediante la disolución de 20 mM Tris, 1 mM EDTA y 1 mM de etilenglicol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'ácido tetraacético (EGTA) en agua desionizada y ajustar el pH a 8.5 con HCl. Para diálisis, prepare 2 x 5 L y para la cromatografía 2x 1 L del tampón AIEX A.
NOTA: El volumen de dializado debe ser de aproximadamente 100 veces el volumen de la muestra. Todos los tampones utilizados para la cromatografía deben filtrarse (0,45 m o menos) y desgasificarse (por ejemplo, por baño ultrasónico o desgasificación al vacío). - Corte el tubo de diálisis (corte del peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) en una longitud adecuada con espacio adicional para el aire para garantizar la flotabilidad de la muestra por encima de la barra de agitación giratoria.
NOTA: El glicerol conserva la membrana y debe retirarse antes de su uso. - Para reducir la viscosidad de la solución proteica aclarada del paso 1.3.2, diluya la solución con 25 ml de tampón AIEX A para facilitar su posterior aplicación a la columna de cromatografía. Fije el primer cierre en el tubo, cargue la muestra en la membrana y conecte el segundo cierre al menos 1 cm del extremo superior del tubo.
- Coloque el recipiente de 5 L con tampón AIEX A en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución proteica. Ajuste la velocidad para girar la muestra evitando interferencias con la barra de agitación giratoria. Dialyze para 12 x 24 h a 4 oC, luego reemplace el búfer de dializado (buffer AA A) por una preparación fresca preenfriada y continúe durante al menos 4 horas adicionales. Transfiera la solución de proteína dializada a un tubo de 50 ml y filtre a través de una unidad de filtro de 0,45 m.
NOTA: Almacenamiento posible.
- Preparar el tampón A de la cromatografía de intercambio de aniones (AIEX) mediante la disolución de 20 mM Tris, 1 mM EDTA y 1 mM de etilenglicol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'ácido tetraacético (EGTA) en agua desionizada y ajustar el pH a 8.5 con HCl. Para diálisis, prepare 2 x 5 L y para la cromatografía 2x 1 L del tampón AIEX A.
- Cromatografía
- Inicie el sistema de cromatografía líquida (FPLC) con mantenimiento general, conecte los búferes de columna AIEX A y AIEX B (búfer AIEX A con 1 M NaCl) y la resina de intercambio de aniones que contiene la columna. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros cromatográficos generales.
NOTA: Los búferes, la columna y los equipos FPLC deben equilibrarse a la misma temperatura antes de iniciar la ejecución (consulte los parámetros cromatográficos en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4y Tabla 5). - Equilibrar la columna con el búfer AA, posteriormente cargar la muestra en la columna y eluir las proteínas con un gradiente lineal de 0% a 100% de búfer de alta sal (AIEX B). Refiera al cuadro 2 para un protocolo del método detallado.
- Recoger fracciones de 2 ml durante la elución y analizar 10 ml de cada fracción en una electroforesis de gel de dodecilo sódico 15% manchada de Coomassie (SDS-PAGE). Aunar las fracciones que contienen proteína S100A12 para diálisis.
NOTA: El peso molecular de S100A12 es 10,575 Da.
- Diálisis
- Cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente del calcio (HIC)
- Diálisis
- Dialyze la solución proteica contra 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 siguiendo el procedimiento descrito en la sección 2.1.1.
- Cromatografía
- Preparar 1 L de tampón de cromatografía HIC A disolviendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl y 25 mM CaCl2 en agua desionizada y ajustar el pH a 7.5. Para el buffer HIC B, disuelva 20 mM Tris, 140 mM NaCl y 50 mM EDTA. Ajuste el pH a 7.0 y filtre y desgasifique los buffers. Añadir CaCl2 a la muestra a una concentración final de 25 mM y filtrar a través de 0,45 m. Equilibrar los tampones HIC y la muestra a 4 oC (temperatura de columna).
- Inicie el sistema de cromatografía líquida con mantenimiento general, conecte los búferes de columna HIC A y B y la columna. Consulte la Tabla 3 para obtener más parámetros cromatográficos.
- Equilibrar la columna, cargue la muestra y extienda el bloque 'lavar la muestra sin enlazar' hasta que la señal UV alcance de nuevo el nivel basal. Luego comience la elución con un quelante de calcio que contenga tampón (EDTA). Refiera al cuadro 4 para un protocolo del método detallado.
NOTA: Experimentos anteriores han demostrado que un exceso de calcio parece ser beneficioso para la unión de S100A12 a la resina de cromatografía. - Recoger fracciones pico de 2 ml y analizar 10 l de cada fracción en un 15% de SDS-PAGE teñido de Coomassie. Piscina pura S100A12 fracciones y dializar contra solución salina con búfer Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) como se describe en la sección 2.1.1.
NOTA: El coeficiente de extinción de S100A12 monomérico es 2980 M-1 cm-1.
- Diálisis
3. Detección y eliminación de endotoxinas
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Detección de endotoxina
- Para determinar la contaminación por endotoxinas, mida las concentraciones de proteína diluida a partir del paso 2.2.2.4. (por ejemplo, 1:10 y 1:100 en HBS) utilizando un ensayo de detección de endotoxinas fluorescentes basado en enzimas (ELISA)(Tabla de materiales). Realice este ensayo siguiendo el protocolo del fabricante.
NOTA: Utilice soluciones HBS recién preparadas disueltas en agua desionizada ultrapura para evitar (nuevas) contaminación por endotoxinas por el tampón.
- Para determinar la contaminación por endotoxinas, mida las concentraciones de proteína diluida a partir del paso 2.2.2.4. (por ejemplo, 1:10 y 1:100 en HBS) utilizando un ensayo de detección de endotoxinas fluorescentes basado en enzimas (ELISA)(Tabla de materiales). Realice este ensayo siguiendo el protocolo del fabricante.
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Eliminación de endotoxina y concentración de proteína
- Cargue 15 ml de muestra en una unidad de filtro centrífugo de 50 kDa y centrífuga a 3.200 x g y 10 oC durante aproximadamente 10 minutos. Lave la membrana del filtro dos veces con HBS para recuperar tanta proteína como sea posible después de cada paso.
- Concentre el flujo que contiene el S100A12 utilizando un filtro centrífugo de 3 kDa hasta que el volumen se reduzca a una quinta parte hasta una décima parte del volumen de carga inicial (centrifugación a 3.200 x g,10 oC durante aproximadamente 30 minutos). Rellene el filtro tantas veces como sea necesario, enjuague la membrana y transfiera la solución concentrada a un tubo nuevo después de cada recarga. Deseche el flujo. Filtrar de nuevo a través de 50 kDa como se describió anteriormente.
NOTA: Durante este procedimiento, la pérdida de proteína es notable (hasta un 50%), pero la preparación de proteína restante se agota completamente de LPS. Este método produce alrededor de 10 x 15 mg de proteína de cultivo de 400 ml. - Ajuste la solución proteica a 1 mg/ml con HBS libre de endotoxinas y mida el contenido de LPS como se describe en el paso 3.1.1. En caso de que la solución proteica aún no se pruebe como libre de LPS (<0.1 EU/mL), elimine las contaminaciones remanentes mediante el uso de una resina de eliminación de endotoxinas.
NOTA: Con una concentración proteica de 1 mg/ml, la contaminación de 0,1 LPS de la UE/ml equivale aproximadamente a 0,01 pg LPS/g de proteína.
4. Reticulación química y separación de oligómero
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Reticulación química
- Preparar soluciones de stock altamente puras (libres de endotoxinas) de 1 M CaCl2 y 100 mM ZnCl2 en agua desionizada ultrapura(Tabla de Materiales). Utilice este búfer, recién hecho, para el siguiente paso.
- Incubar 10 ml de S100A12 sin endotoxinas purificado (concentración 1 mg/ml en HBS) durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con 25 mM de CaCl2 para dimeric/tetrameric, o 25 mM DeCl2 y 1 mM ZnCl2 para hexámeric/tetrameric S100A12 Oligómeros.
- Preparar el reticontinuaciónr disolviendo 8 mg de BS3 en 500 l de agua libre de endotoxinas directamente antes de su uso (8 mg de reticomaño para solución de proteína de iones de 10 ml equivale a una concentración final de 1,4 mM). Mezclar el reticulante y la muestra mediante pipeteo e incubar durante 30 minutos adicionales a RT. Quemuestre la reacción añadiendo 1 M Tris-HCl, pH 7,5 a una concentración final de 50 mM y filtre a través de 0,45 m.
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Cromatografía de exclusión de tamaño
- Equilibre la muestra reticulada a 12 oC (temperatura de columna) e inicie el sistema de cromatografía líquida con mantenimiento general. Conecte el búfer de columna (HBS) y la columna de exclusión de tamaño. Consulte el Cuadro 5 para obtener información detallada.
- Equilibrar la columna en HBS, cargar la muestra y recoger fracciones máximas (1 x 2 ml) durante la ejecución. Analice estas fracciones en un Gradiente 4-20% SDS-PAGE y fracciones de piscina con bandas principales del complejo proteico deseado.
NOTA: La hidrólisis de reactivos de éster NHS como BS3 en soluciones acuosas da como resultado una fuerte absorbancia a 280 nm. Reticulante sin ataduras (peso molecular: 572 g/mol) eluyera al final de la carrera y da como resultado un pico fuerte. - Concentre las soluciones utilizando unidades de filtro centrífugos con MWCOs de 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) o 50 kDa (hexamer). Determinar la contaminación por endotoxinas como se describe en la sección 3.1. Si es necesario, retire el LPS restante con una resina de eliminación de endotoxinas siguiendo las recomendaciones del fabricante(Tabla de materiales).
5. Pruebas funcionales sobre monocitos
- Preparación de monocitos
- Aislar a los monocitos de las capas buffy humanas por centrifugación de gradiente de densidad y posterior enriquecimiento de monocitos mediante el uso de un kit de separación de perlas magnéticas(Tabla de materiales).
NOTA: Este protocolo resultará en aproximadamente 5 x 7 x 107 monocitos (una capa buffy) con una pureza de 83-95%. Dado que el número, pero también la capacidad de respuesta de las células depende en gran medida del donante, el protocolo puede tener que ser escalado vertical (dependiendo del recuento de células requerido). - Para la centrifugación de densidad, equilibre la solución de separación (densidad de 1,077 g/ml) a RT y transfiera 20 ml a tubos centrífugos de 50 ml (2 tubos por capa de color adelanto). Diluir la sangre de la capa de color humano con la solución salina tamponada de Hank (HBSS) a un volumen total de 60 ml y capa 30 mL de esta mezcla cuidadosamente en la parte superior del medio de separación. Centrífuga a 550 x g durante 35 minutos en RT. Desactive el freno de centrífuga.
- Después de la centrifugación, las células sanguíneas periféricas mononucleares (PPB) se encuentran directamente en la parte superior del medio de separación. Transfiera estas células en un tubo de centrífuga fresco de 50 ml, haga hasta 50 ml con HBSS y centrífuga a 170 x g durante 10 minutos.
- Llenar el tubo hasta 50 ml y centrifugar a 290 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante de nuevo, resuspender las células en HBSS (50 mL) y centrifugar a 170 x g durante 10 min. Cuente las células y resuspenderlas en el búfer de separación celular(Tabla de materiales< /c9>) a una concentración de 5 x 107 células/ml.
NOTA: En lugar de HBSS, la solución salina con búfer de fosfato (PBS) se puede utilizar para lavar las células. - Para el aislamiento de monocitos de los PMI, utilice un kit de aislamiento de células negativas magnéticas y siga el protocolo del fabricante. Contar monocitos y resuspender en medio de monocitos (RPMI 1640, 15% suero de becerro fetal inactivado por calor [FCS], 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina) a una concentración de 2 x 106 células/ml.
- Para cultivar monocitos, cubra platos de cultivo (por ejemplo, 100 mm) con una película hidrófoba permeable al gas, adecuada para células de suspensión (Tabla de materiales). Esterilice las placas utilizando luz UV durante aproximadamente 30 minutos. Transfiera las células a estas placas de cultivo y déjelas reposar durante la noche a 37 oC y 5% DECO2.
NOTA: Utilice 15 x 25 ml de suspensión celular por plato recubierto.
- Aislar a los monocitos de las capas buffy humanas por centrifugación de gradiente de densidad y posterior enriquecimiento de monocitos mediante el uso de un kit de separación de perlas magnéticas(Tabla de materiales).
- Estimulación de monocitos
- Estimulación con S100A12 (tipo salvaje)
NOTA: Para distinguir el S100A12 no tratado (producto final de la sección 2.2.2) de la proteína reticulada, S100A12 en lo siguiente se denomina «tipo salvaje».- Transfiera las células descansadas a un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 350 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio de estimulación (RPMI 1640, FCS activado por calor al 5%, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina) a una concentración de 2 x 106 células/ml.
- Para la estimulación, utilice 24 placas de suspensión de pozo y agregue 250 l de suspensión celular por pozo (0,5 x 106 células/pozo). Añadir 50 g/ml de polimyxina B a los pocillos previstos, seguido de LPS en diferentes concentraciones (25, 50, 100 y 200 pg/mL) o de tipo salvaje S100A12 (10, 20, 40, 60 g/ml). Además, aplicar la proteína ya sea sin tratar o desnaturalizada por calor (99 oC, 10 min) en diferentes concentraciones a las células.
NOTA: Un tratamiento térmico corto desnaturaliza la proteína S100A12, pero tiene menos o ningún efecto sobre LPS. - Incubar placas durante 4 h a 37oC y 5% CO2. Cosecha las células transfiriendo la suspensión celular de cada pozo a tubos de reacción de 1,5 ml. Centrífuga a 500 x g durante 10 minutos. Transfiera los sobrenatantes a tubos nuevos y mida la liberación de TNF en diferentes diluciones (por ejemplo, 1:2, 1:5, 1:10) con un kit ELISA TNF humano siguiendo las recomendaciones del fabricante.
- Estimulación con oligómeros S100A12
- Preparar y sembrar monocitos en 24 placas de suspensión de pozos como se describió anteriormente. Estimular las células mediante la adición de oligómeros S100A12 desde el paso 4.2.3. en diferentes concentraciones molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
NOTA: Con el fin de comparar las capacidades de los diferentes oligómeros para estimular los monocitos, los oligómeros se aplicaron a las células en concentraciones molares comparables. - Incubar durante 4 h a 37oC y 5% deCO2,cosechar las células y medir la liberación de TNF en los sobrenatogros como se ha descrito anteriormente.
- Preparar y sembrar monocitos en 24 placas de suspensión de pozos como se describió anteriormente. Estimular las células mediante la adición de oligómeros S100A12 desde el paso 4.2.3. en diferentes concentraciones molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Estimulación con S100A12 (tipo salvaje)
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Representative Results
Tras la pre-purificación en la columna AIEX(Figura 1A-C) y posterior HIC dependiente del calcio(Figura 2A,B),se obtuvo proteína altamente pura (Figura 2C). Además, las mediciones de endotoxina revelaron una eliminación exitosa de LPS. El contenido de LPS después de AIEX se midió en una dilución 1:10 por encima del límite de detección de ensayos, es decir, por encima de 500 EU/mL. Después de la primera filtración a través de una unidad de filtro de 50 kDa, el contenido de LPS se redujo a 1 UE/ml. Tras la concentración con una unidad de filtro de 3 kDa y una filtración adicional a través de 50 kDa, la contaminación por LPS medida fue de 0,08 UE/ml.
Como control adicional, los monocitos humanos fueron estimulados con la proteína de tipo silvestre producida(Figura 3A,B). El tratamiento con polimyxina B abroga la liberación de TNF de monocitos estimulados por LPS, que no se pueden observar con S100A12. Por otro lado, el tratamiento térmico de LPS y S100A12 elimina la capacidad de la proteína para estimular las células, mientras que esto no afecta la respuesta celular a la estimulación LPS.
La exposición a proteínas a diferentes iones da como resultado la disposición de diferentes oligómeros S100A12 (Figura 4A). El reticulación química permite capturar complejos definidos como dimers, tetrámeros y hexamers, así como estados de transición (por ejemplo, 'trimers', banda de aproximadamente 30 kDa). Para inducir un cambio pronunciado del equilibrio oligomero antes del reticulación, se aplicó un exceso de iones(Figura 4B).
Los oligómeros aislados en concentraciones molares iguales(Figura 5A-C) se utilizaron entonces para la estimulación de monocitos para comparar las capacidades de señalización a través de PRRs. ). La liberación de citoquinas remanentes podría detectarse a partir de células estimuladas con tetramérica S100A12, mientras que el tratamiento con proteína dimerica no induce la liberación de TNF.
Figura 1: Resultados de la cromatografía de intercambio de aniones. (A) Un cromatograma con absorbancia a 280 nm (A280) y el porcentaje de tampón de elución B (línea discontinua). Los bloques de métodos se indican con A - lavar la muestra no enlazada, B - gradiente lineal con tampón de elución (buffer B), C - lavar con tampón B, y D - re-equilibración en el tampón A. (B) Enfoque en los picos relevantes con números de tubo de fracción en rojo. (C) Se analizaron fracciones seleccionadas en SDS-PAGE manchada de Coomassie al 15%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de la cromatografía de interacción hidrofóbica. (A) Un cromatograma con absorbancia a 280 nm (A280) y el porcentaje de tampón de elución B (línea discontinua). Los bloques de métodos se indican con A - lavar la muestra no enlazada, B - elución con tampón B, y C - reequilibrio en el búfer A. (B) Enfoque en los picos relevantes con números de tubo fraccionarios en rojo. (C) Fracciones analizadas en 15% SDS-PAGE teñido de Coomassie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los monocitos humanos primarios fueron estimulados a concentraciones indicadas. LPS (A) o S100A12 (wildtype, B) se dejaron sin tratar o desnaturalizaron térmicamente (99 oC, 10 min). Ambas condiciones fueron probadas en presencia y ausencia de polimyxin B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La proteína S100A12 se retravutó con BS3 después de la incubación en el tampón HBS que contenía 5 mM Ca2+ e indicaba concentraciones de Zn2+. (A) El aumento de las concentraciones de Zn2+ induce la disposición de S100A12 en tetrámeros y hexámeros tras la separación en 4-20% SDS-PAGE teñido de Coomassie. (B) Resultado representativo de los oligómeros reticulados con condiciones utilizadas para la separación en una columna de exclusión de tamaño. S100A12 estaba reticulado en presencia de 25 mM Ca2+ (carril 1) o 25 mM Ca2+ y 1 mM Zn2+ (carril 2). (S100A12) 2 - dimer; (S100A12) 4 o tetrámero; (S100A12) 6o hexamer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Los oligómeros S100A12 se separaron en una columna de exclusión de tamaño. (A) Cromatograma de separación hexamer/tetramer después de la reticulación en tampón HBS con 25 mM CaCl2 y 1 mM ZnCl2. (B) Cromatografía para separación de tetrámeros/dimeros en tampón HBS con 25 mM CaCl2. (C) Ejemplo de oligómeros agrupados y concentrados después de la separación en un gradiente de Coomassie 4-15% Gradiente SDS-PAGE. Carril 1 - dimer; carril 2 - tetrámero; carril 3 . hexamer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estimulación de monocitos con oligómeros S100A12 purificados. ELISA cuantificó la liberación de TNF después de 4 h de incubación. Los datos muestran el valor medio de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen de la cama (CV) | 75 ml |
| Monitor | Absorbencia a 280 nM |
| Presión Máxima | 3 bar |
| Búfer de columnas A | 20 mM Tris-HCl, EDTA de 1 mM, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Búfer de columnas B | 20 mM Tris-HCl, EDTA de 1 mM, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Volumen de la muestra | Variable |
| Caudal | 1 x 2 ml/min |
| Temperatura | 4 oC |
Tabla 1: Información detallada sobre los parámetros aplicados de la cromatografía de intercambio de aniones.
| Bloquear | Volumen | Búfer | Salida |
| Equilibrado | Volúmenes de 1 x 2 columnas (CSV) | Un | Residuos |
| Carga de muestra | n/a | Un | Residuos |
| Lavar la muestra sin ataduras | 1 CV | Un | Salida de alto volumen |
| Degradado–Elución | 0-100 % Tampón B en 1 CV | De la A a la B | Colector de fracciones |
| Wash out–Buffer B | 1 CV | B | Residuos |
| Reequilibración | 2 CV | Un | Residuos |
Tabla 2: Información detallada sobre el método utilizado de cromatografía de intercambio de aniones.
| Volumen de la cama (CV) | 125 ml |
| Monitor | Absorbencia a 280 nM |
| Presión Máxima | 4 bar |
| Búfer de columnas A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Búfer de columnas B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Volumen de la muestra | Variable |
| Caudal | 1 x 2 ml/min |
| Temperatura | 4 oC |
Tabla 3: Información detallada sobre los parámetros aplicados de la cromatografía de interacción hidrofóbica.
| Bloquear | Volumen | Búfer | Salida |
| Equilibrado | Volúmenes de 1 x 2 columnas (CSV) | Un | Residuos |
| Carga de muestra | n/a | Un | Residuos |
| Lavar la muestra sin ataduras | 1-2 CV | Un | Salida de alto volumen |
| Elución | 100 % Tampón B | B | Colector de fracciones |
| Wash out–Buffer B | 1 CV | B | Residuos |
| Reequilibración | 2 CV | Un | Residuos |
Tabla 4: Información detallada sobre el método utilizado de cromatografía de interacción hidrofóbica.
| Volumen de la cama (CV) | 320 ml |
| Monitor | Absorbencia a 280 nm |
| Presión Máxima | 3 bar |
| Búfer de columnas A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Volumen de la muestra | Hasta 13 ml |
| Caudal | 1 x 1,5 ml/min |
| Temperatura | 12 o 15 oC |
Tabla 5: Información detallada para los parámetros aplicados de la cromatografía de exclusión de tamaño.
Tabla suplementaria 1: Preparación de tampones y soluciones de stock. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este protocolo, describimos la expresión bacteriana libre de etiquetas del S100A12 humano y su purificación, así como la separación en diferentes oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias. En comparación con la literatura publicada sobre la purificación de proteínas S100A128,23,24, el uso de caCl2 alto (25 mM) en la cromatografía de interacción hidrofóbica es para nuestro conocimiento único. Varios protocolos que aplican concentraciones de 1 a 5 mM producen proteína pura, sin embargo, observamos un rendimiento varias veces mayor siguiendo nuestro enfoque usando 25 mM CaCl2 en su lugar. Esto podría explicarse por una jerarquía de interacción proteica con el material de la columna:S100A12 puede unirse directamente al material de la columna, pero el exceso de Ca2+ también puede facilitar la unión indirecta de S100A12-dimers a la proteína ya ligada a la columna 8. Por lo tanto, las altas concentraciones de Ca2+ pueden ampliar la superficie disponible para la purificación S100A12. La elución (mediante el uso de un gradiente lineal) de S100A12 de HIC como uno temprano (indirecto unido S100A12) y un pico muy tardío (proteína de entrada de material de columna) puede apoyar esta especulación (datos no mostrados).
Para la producción de S100A12 recombinante (así como otras proteínas) a altos rendimientos y costos manejables, la expresión de proteínas en E. coli sigue siendo el método de elección. Sin embargo, la inevitable contaminación con endotoxinas bacterianas sigue siendo un problema, cuando se determinan proteínas para experimentos de cultivo celular, particularmente en estudios que involucran células inmunitarias innatas. Según nuestra experiencia, incluso las proteínas disponibles comercialmente declaradas explícitamente para el cultivo celular pueden contener contaminaciones por endotoxinas de hasta 1 proteína de la UE/g, que pueden sesgar significativamente los ensayos. Por lo tanto, es obligatorio eliminar completamente las endotoxinas. Los monómeros de endotoxinas en solución varían de pesos moleculares de 10 a 20 kDa, pero pueden formar micelas y estructuras con mayores pesos moleculares. La formación de estructuras muy grandes se promueve, por ejemplo, a través de iones bivalentes21,25.
De acuerdo con nuestro protocolo, verificamos la producción libre de endotoxinas de la proteína S100A12 combinando mediciones de endotoxinas de alta sensibilidad con ensayos de estimulación monocitos. Consideramos que esta combinación es particularmente significativa como a) la contaminación de endotoxinas de bajo nivel puede ser difícil de evaluar dependiendo de la sensibilidad del ensayo y b) el uso de polimyxin a B como inhibidor de LPS en monocitos puede resultar en datos difíciles de interpretar debido a a los efectos exclusivos de la polimicina B en las células26,27. La polimixina B, así como otros péptidos catiónicos se divulgan para unir LPS a través de lípidos cargados negativamente A28. Como la superficie expuesta al disolvente de S100A12 también contiene grandes parches cargados negativamente, la reducción observada de la liberación de TNF de monocitos humanos estimulados por S100A12 en presencia de polimicina B(Figura 3B)puede deberse a a) unión directa inespecífica de monocitos humanos inespecíficos de polimixina B a S100A12 y/o b) efectos directos de la polimixina B en las células estimuladas26,27. Debido a las limitaciones conocidas tanto de la detección de contaminación por endotoxinas de bajo nivel como de efectos inespecíficos de polimyxina B, nuestro protocolo contiene además un paso de inactivación de calor para distinguir claramente entre la señalización TLR4 mediada por LPS y proteínas.
El uso de S100A12 sin LPS para la generación y purificación de oligómeros inducidos por iones definidos es fundamental y se debe prestar atención adicional a su posterior purificación para evitar la reintroducción eventual de la endotoxina a través de tampones o material de columna y, por lo tanto, más proteico-demanda de LPS-agotamiento a través de resinas de eliminación de endotoxinas.
La pertinencia del oligomerización para la función biológica de las proteínas puede evaluarse por diferentes medios. En el caso de S100A12, utilizamos resonancia plasmón superficial, así como intercambios de aminoácidos dirigidos en sitios de unión iónica y para definir con mayor precisión el complejo proteico capaz de unirse y señalar a través de TLR4, empleamos la reticulación química de Ca2+/Zn2+ -pulsado recombinante S100A1216. La reticulación química de S100A12 en diferentes condiciones iónicas congela un estado momentáneo que incluye varias formas oligoméricas que están en transición. A partir de experimentos de valoración iónica, definimos las condiciones bajo las cuales los oligómeros dimericos, tetramricos o hexáméricos podrían determinarse como los oligomeros predominantes16. Además, experimentos anteriores han demostrado que un exceso de iones es beneficioso para la reticulación comparable y estable y la posterior purificación, aunque la oligomerización también puede inducirse a concentraciones de iones significativamente más bajas. Sin embargo, la purificación de estos oligómeros mediante cromatografía de exclusión de tamaño da como resultado una separación buena, pero no absoluta. Aún así, el enriquecimiento selectivo de los oligómeros permite análisis descendentes fiables.
En resumen, este protocolo proporciona un método para la purificación de S100A12 humanas libres de LPS o proteínas de unión al calcio relacionadas. Para corregir los cambios de conformación inducidos por iones, la reticulación química y la posterior separación compleja por cromatografía de exclusión de tamaño es una herramienta útil para comprender la relevancia de la oligomerización de proteínas para los procesos biológicos posteriores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del programa de investigación médica innovadora intramuros de la facultad de medicina de la Universidad de Muenster (KE121201 a C.K.) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
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