Summary
Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.
Abstract
Bu protokolde, bağışıklık hücresi stimülasyonu için Escherichia coli kültüründen insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve iyon kaynaklı oligomerleri arındırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, bir aniyon değişimi kromatografisi sütununda protein ön arıtma ve hidrofobik etkileşim sütununda bir sonraki parlatma adımlarını içeren iki aşamalı bir kromatografi stratejisine dayanmaktadır. Bu strateji yönetilebilir maliyetlerle yüksek saflıkta ve verim S100A12 protein üretir. Bağışıklık hücreleri nihai kalıntı endotoksin kontaminasyonfonksiyonel tahliller için endotoksin içermeyen protein elde etmek için dikkatli izleme ve daha fazla temizlik adımları gerektirir. Endotoksin kontaminasyonlarının çoğu aniyon değişimi kromatografisi ile dışlanabilir. Artık kontaminasyonları tüketmek için, bu protokol santrifüj filtreleri ile bir kaldırma adımı açıklar. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12 farklı homomultimerler içine düzenleyebilirsiniz. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için, bu protokol s100A12 proteininin iyon tedavisini ve ardından S100A12 oligomerlerini stabilize etmek için kimyasal crosslinking'i ve bunların boyut-dışlanma ile ayrılmasını tanımlar. Kromatografi. Son olarak, saflaştırılmış proteinin biyolojik aktivitesini doğrulayan ve LPS içermeyen hazırlığı doğrulayan hücre bazlı bir test tanımlıyoruz.
Introduction
S100A12 ağırlıklı olarak insan granülositleri tarafından üretilen kalsiyum bağlayıcı bir proteindir. Protein (sistemik) inflamasyon sırasında aşırı ifade edilir ve serum düzeyleri, özellikle sistemik juvenil idiyopatik artrit (sJIA), ailesel Akdeniz ateşi (FMF) veya Kawasaki hastalığı (KD) gibi (oto)inflamatuar hastalıklar hakkında bilgi verebilir hastalık aktivitesi ve tedaviye yanıt. Toll benzeri reseptörler (TLR) gibi örüntü tanıma reseptörlerine (PrR) bağlı olarak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi lipopolisakkaritler (LPS) veya hasar ilişkili moleküler desenler (DAMP) gibi patojen ilişkili moleküler desenler (PAMP' ler) tarafından aktive edilebilir; ayrıca 'alarmins' olarak da adlandırılır). DAMP'lar hücresel proteinler, lipidler veya nükleikasitler1 gibi endojen moleküllerdir. DAMP fonksiyonları iyi calgranulin protein ailesinin üyeleri için tarif edilir, S100A8/A9 ve S100A122, ayrıca divalent metal iyon-şelat antimikrobiyal peptidler 3 olarak faaliyet bildirilmiştir3,4, 5,6. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12, S100 ailesinin diğer üyeleri gibi, farklı homomultimerler içine düzenlemek ve yakın zamana kadar PRR-etkileşim, özellikle TLR4 s100A12-oligomerizasyon etkisi bilinmemektedir.
Proteinin monomerik formu (92 amino asit, 10.2 kDa) esnek bir bağlayıcı ile birbirine bağlanan iki EF-el sarlis-döngü-sarlis yapılarından oluşur. C-terminal EF-eli klasik Ca2+-bağlayıcı motifiçerirken, N-terminalEF-eli S100 proteine özgü genişletilmiş döngü yapısını ('pseudo-EF-hand') sergiler ve azaltılmış Ca2+-yakınlığı ortaya çıkarır. Ca2+-S100A12 ile bağlanma proteinlerin C-terminus'unda büyük bir konformasyonel değişikliğe neden olabilir, bu da her monomerde hidrofobik bir yamanın maruz kalmasına neden olur ve dimerizasyon arayüzünü oluşturur. Bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, S100A12 tarafından oluşturulan en küçük kuaternary yapı, tek tek monomerlerin antiparalel yönde olduğu kovalent olmayan bir dimer (yaklaşık 21 kDa) dir. Dimer olarak düzenlendiğinde, S100A12 sequester Zn2 + yanı sıra diğer divalent metal iyonları bildirilmiştir, örneğin, Cu2 + yüksek yakınlık ile7. Bu iyonlar S100A12 dimer arabiriminde bir alt birim ve H85 amino asitleri H15 ve D25 yanı sıra anti-paralel diğer alt birim8,9,10H89 tarafından koordine edilir. Daha önceki çalışmalarz Zn2 +yüklü S100A12 homo-tetramer (44 kDa) içine protein organizasyonu neden olabilir ve artmış Ca2 +-afinite11,12, son metal titrasyon neden olabileceğini öne süre çalışmalar6 Zn2 +proteinin afinitesini artırmak için S100A12 tarafından Ca 2+-bağlayıcı öneririz. S100A12 EF-hands tamamen Ca 2+tarafından işgal edildikten sonra, ek Ca2 + dimers arasında bağlamak için düşünülmektedir, hexamer oluşumunu tetikleyen (yaklaşık 63 kDa). Hexameric quarternary yapısının mimarisi tetramerin mimarisinden açıkça farklıdır. Tetramer arabiriminin, hexamerformasyonu 10'afayda sağlayan yeni dimer-dimer arabirimlerine yol vermek için bozulduğu öne sürüldü. S100A12 neredeyse sadece insan granülositler tarafından ifade edilir nerede tüm sitosolik protein13yaklaşık% 5 oluşturmaktadır. Onun DAMP fonksiyonu nda S100A12 tarihsel gelişmiş glisasyon son ürünler için multi-ligand reseptöragonist olarak tarif edildi (RAGE), sonra ekstrasellüler yeni tanımlanan RAGE bağlayıcı protein denir (EN-RAGE)14. Daha önce hem RAGE hem de TLR415için biyokimyasal S100A12-bağlayıcı rapor olsa da, biz son zamanlarda bir TLR4 bağımlı şekilde S100A12 stimülasyon yanıt insan monositler gösterdi16. Bunun için S100A12'nin Ca2+/Zn2+indüklenen hexameric quarternary yapısına düzenlenmesigerekmektedir 16.
Burada rekombinant insan S100A12 ve bağışıklık hücresi stimülasyonu için iyon kaynaklı oligomerler için bir arıtma prosedürü tarif16,17. Bu iki aşamalı kromatografi stratejisine dayanmaktadır, başlangıçta izole etmek ve protein konsantre ve toplu kontaminasyonkaldırmak için bir aniyon değişimi sütun içeren (örneğin, endotoksinler / lipopolisakkaritler)18. İon-exchange kromatografi resinleri farklı net yüzey yükleri temelinde ayrı proteinler. S100A12 (izoelektrik nokta 5.81), pH ile bir tampon sistemi 8.5 ve güçlü bir aniyon değişimi reçine gibi asidik proteinler için iyi bir ayırma yol açar. Bağlı proteinler yüksek tuz tampon gradyanı ile eluted edildi. Elüsyon tamponundaki iyonik mukavemetartışı ile negatif iyonlar rezorin yüzeyindeki yükler için proteinlerle rekabet eder. Proteinler net yüklerine bağlı olarak ayrı ayrı eute ve bunun sonucu olarak, burada açıklanan tamponlar aşırı ifade edilen S100A12 proteinini izole edip konsantre etmelerine olanak sağlar. Lipopolisakkaritlerde negatif yüklü gruplar nedeniyle, bu moleküller de aniyon değişimi reçineler bağlanır. Ancak, onların yüksek net şarj uygulanan yüksek tuz gradyan daha sonra elüsyon sonuçlanır. Arınma prosedürünün ikinci adımı parlatma amacıyla getirilmiştir. Bu, S100A12'nin kalsiyum bağlama yeteneğini kullanır ve hidrofobik etkileşim sütununda kalan yabancı maddeleri ortadan kaldırır. S100A12 kalsiyum bağlanması konformasyonel değişime ve protein yüzeyinde hidrofobik yamalar maruz kalmasına yol açar. Bu durumda, S100A12 resenin hidrofobik yüzeyi ile etkileşime girer. EDTA tarafından kalsiyum-şelat üzerine, bu etkileşim tersine çevrilir. S100A12, başta kalsiyum ve çinko olmak üzere iyonların varlığında homomerik oligomerlere dönüşür. Farklı oligomerlerin yapı-fonksiyon ilişkilerini incelemek için dimerik, tetramerik ve hexameric rekombinant S100A12'yi kimyasal bir çapraz bağlantı ile stabilize ettik ve kompleksleri boyut dışlama kromatografisi sütununda ayırdık. Son olarak, saflaştırılmış proteinin ve iyonkaynaklı oligomerlerin işlevselliğini ve biyolojik aktivitesini analiz etmek için, S100A12 ve LPS uyarılmış monositin sitokin salınımı karşılaştırılabilir.
S100A12'yi arındırmak için şimdiye kadar çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Jackson ve ark.19, örneğin, bir aniyon değişimi sütun ve sonraki boyut dışlama kromatografisi yoluyla arınma ile bir protokol yayınladı. Boyut dışlama sütununda saflaştırma parlatma iyi sonuçlar doğurur, ancak örneğin sınırlı yükleme hacimleri―ölçeklenebilirlik açısından daha az esnektir. Kiss ve ark.20tarafından yayınlanan farklı bir yaklaşım, etiketli proteinin Ni2+ yakınlık sütunu üzerinden saflaştırılmasını ilk saflaştırma adımı olarak tanımlar, ardından etiketi ve daha fazla saflaştırma adımını çıkarmak için enzimatik bölünme yi takip eder. Önseki çalışmaların aksine19,20, bu protokolde açıklandığı gibi üretilen protein bağışıklık hücreleri üzerinde deneyler için belirlenir. Bu nedenle, bakteri kültüründen kalıntı endotoksin kontaminasyonu bir meydan okumadır. Endotoksin çıkarılması için farklı yaklaşımlar şimdiye kadar tarif edilmiş olmasına rağmen, herhangi bir protein çözeltisi için eşit derecede iyi çalışan bir yöntem yoktur21,22.
Özetle, protokolümüz bir bakteri sisteminde etiketsiz ifadenin avantajlarını verimli endotoksin giderme ve yüksek saf protein verimi ile birleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tamponlar ve stok çözümlerinin hazırlanması için lütfen Ek Tablo 1'e bakın.
1. E. coli protein ekspresyonu
-
Klonlama
- Klon etiketiz insan S100A12 (NCBI Referans Sırası: NP_005612.1) içine bakteriyel ekspresyon vektör pET11b. Proteini ifade etmek için yapıyı E. coli BL21'e (DE3) dönüştürün.
-
Kültür
- 14 mL yuvarlak alt tüpte 5 mL büyüme ortamına (LB suyu 100 μg/mL ampisilin) tek bir koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Gece boyunca 37 °C'de 220 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 2 L Erlenmayer şişesinde 400 mL'lik büyüme ortamına gece kültürünün 2−4 mL'sini aktarın ve 220 rpm'de sallayarak kültürü 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Ana kültürün başlangıç yoğunluğu 600 nm (OD600) = 0.1 optik yoğunluk olmalıdır. - Büyüme sırasında OD600'ü izleyin. OD600 = 0.5−0.6'da 1 mM'lik son konsantrasyona 1 M izopropil-ß-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Ek 4 saat için 37 °C ve 220 rpm'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Genel olarak, 37 °C'de 1,5−2,5 h'den sonra 0,6'lık bir OD600'e ulaşılacaktır. - 50 mM Tris, 50 mM NaCl ve 1 mM etilendim tetraasetik asit (EDTA) 40 mL deiyonize su eriterek 50 mL sonication tampon hazırlayın. HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve 50 mL'ye kadar yapın. Proteaz inhibitörü (50 mL çözeltisi başına 1 tablet) ekleyin ve tamponu 4 °C'ye dengeleyin.
- Bakteri kültürünü uygun santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri 3200 x g'de 4 °C'de 30 dk'da hasat edin. Supernatant atın ve buz gibi sonication tampon 25 mL pelet resuspend. Bundan sonra hücreleri buzda tut.
NOT: Resuspended hücreler kısa süreli olarak -20 °C'de, uzun süreli olarak ise -80 °C'de saklanabilir.
- 14 mL yuvarlak alt tüpte 5 mL büyüme ortamına (LB suyu 100 μg/mL ampisilin) tek bir koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Gece boyunca 37 °C'de 220 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 2 L Erlenmayer şişesinde 400 mL'lik büyüme ortamına gece kültürünün 2−4 mL'sini aktarın ve 220 rpm'de sallayarak kültürü 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
-
Sonication / lysis
- Hücreleri buzüzerinde 30 s 6 döngü için sonicate. Her döngüden sonra hücreleri aşırı ısınmadan korumak için hücreleri 30−60 s kadar dinlendirin.
- Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g sabit açı rotoruile santrifüje aktarın. Çözünür sitosolik proteinleri içeren temizlenmiş lysat'ı 50 mL'lik taze bir tüpe boşaltın ve peleti atın.
2. Protein Arıtma
- Aniyon değişimi kromatografisi
- Diyaliz
- 20 mM Tris, 1 mM EDTA ve 1 mM etilen glikol-bis(2-aminoetitilether)-N,N,N'-tetraasetik asit (EGTA) deiyonize suda eriterek anyon değişimi kromatografisi (AIEX) tamponUnu hazırlayın ve pH'ı HCl ile 8,5'e ayarlayın. Diyaliz için 2 x 5 L ve kromatografi için 2x 1 L AIEX tampon A hazırlayın.
NOT: Diyaliz hacmi örnek hacmin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Kromatografi için kullanılan tüm tamponlar filtre edilmeli (0,45 μm veya daha küçük) ve gazgiderilmelidir (örn. ultrasonik banyo veya vakum lu gaz giderme ile). - Diyaliz borularını (moleküler ağırlık kesme [MWCO]: 3,5 kDa) hava için ek alan ile uygun bir uzunlukta keserek, dönen karıştırma çubuğunun üzerinde numune kaldırma kuvveti sağlayın.
NOT: Gliserol membran korur ve kullanmadan önce kaldırılmalıdır. - Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini adım 1.3.2'den azaltmak için, kromatografi kolonuna sonraki uygulamayı kolaylaştırmak için çözeltiyi 25 mL AIEX tampon A ile seyreltin. İlk kapatmayı boruya takın, numuneyi membrana yükleyin ve ikinci kapatmayı borunun üst ucundan en az 1 cm takın.
- AIEX tampon A ile 5 L kabını bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ve protein çözeltisi ile dolu membran ekleyin. Dönen karıştırma çubuğuna müdahale den kaçınarak numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. 4 °C'de 12−24 saat diyalize koyun, ardından diyaliz tamponu (AIEX tampon A) taze bir önceden soğutulmuş bir hazırlıkla değiştirin ve en az 4 saat daha devam edin. Diyaliz protein çözeltisini 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 0,45 m'lik bir filtre ünitesinden filtreleyin.
NOT: Depolama mümkün.
- 20 mM Tris, 1 mM EDTA ve 1 mM etilen glikol-bis(2-aminoetitilether)-N,N,N'-tetraasetik asit (EGTA) deiyonize suda eriterek anyon değişimi kromatografisi (AIEX) tamponUnu hazırlayın ve pH'ı HCl ile 8,5'e ayarlayın. Diyaliz için 2 x 5 L ve kromatografi için 2x 1 L AIEX tampon A hazırlayın.
- Kromatografi
- Sıvı kromatografi sistemini (FPLC) genel bakımla başlatın, kolon tamponlarını AIEX A ve AIEX B (AIEX tamponA 1 M NaCl'li A) ve kolon içeren aniyon değişimi reçinesini bağlayın. Genel kromatografik parametreler için Tablo 1'e bakın.
NOT: Arabellekler, kolon ve FPLC ekipmanları çalıştırmaya başlamadan önce aynı sıcaklığa denk verilmelidir (Tablo 1, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4ve Tablo 5'tekikromatografik parametrelere bakın). - Sütunu AIEX tampon U ile dengeleyin, daha sonra numuneyi kolona yükleyin ve proteinleri %0 ile %100 arasında doğrusal bir degrade yle (AIEX B) uzaklaştırın. Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 2'ye bakın.
- Elüsyon sırasında 2 mL fraksiyonu toplayın ve Coomassie lekeli %15 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Diyaliz için S100A12 proteini içeren fraksiyonları havuz.
NOT: S100A12'nin molekül ağırlığı 10.575 Da'dır.
- Diyaliz
- Kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC)
- Diyaliz
- 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5'e karşı 2.1.1 bölümünde açıklanan prosedürü uygulayın.
- Kromatografi
- Deiyonize suda 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 25 mM CaCl2 eriterek 1 L kromatografi tamponu HIC A hazırlayın ve pH'ı 7,5'e ayarlayın. HIC tampon B için 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 50 mM EDTA çözünür. pH'ı 7.0'a ayarlayın ve arabellekleri filtreleyin ve gazdan arındırın. CaCl2'yi numuneye 25 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve 0,45 m. üzerinden filtre uygulayın.
- Sıvı kromatografi sistemini genel bakımla başlatın, hic A ve B sütunaralarını ve sütunu bağlayın. Daha fazla kromatografik parametreler için Tablo 3'e bakın.
- Kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve UV sinyali taban çizgisine tekrar ulaşana kadar 'bağlı olmayan numuneyi yıkayın' bloğunu genişletin. Sonra tampon içeren bir kalsiyum şelatör ile elütion başlayın (EDTA). Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 4'e bakın.
NOT: Önceki deneyler, kalsiyum fazlalığı kromatografi rezorne S100A12 bağlanması için yararlı gibi görünüyor göstermiştir. - 2 mL'lik pik fraksiyonları toplayın ve Coomassie lekeli %15 SDS-PAGE'de her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Havuz saf S100A12 fraksiyonları ve hepes tamponlu tuzlu (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) karşı diyaliz bölüm 2.1.1 açıklandığı gibi.
NOT: Monomerik S100A12'nin yok olma katsayısı 2980 M-1 cm-1'dir.
- Diyaliz
3. Endotoksinin Saptanması ve Çıkarılması
-
Endotoksin tespiti
- Endotoksin kontaminasyonunu belirlemek için seyreltilmiş protein konsantrasyonlarını adım 2.2.2.4'ten ölçün. (örneğin, 1:10 ve HBS 1:100) bir enzim bağlı immünosorbent test kullanarak (ELISA) tabanlı, floresan endotoksin algılama tayini (Malzeme Tablosu). Üreticinin protokolünü izleyerek bu tayini gerçekleştirin.
NOT: Tampon tarafından endotoksin kontaminasyonunu önlemek için ultra saf deiyonize suda çözünmüş taze hazırlanmış HBS çözeltilerini kullanın.
- Endotoksin kontaminasyonunu belirlemek için seyreltilmiş protein konsantrasyonlarını adım 2.2.2.4'ten ölçün. (örneğin, 1:10 ve HBS 1:100) bir enzim bağlı immünosorbent test kullanarak (ELISA) tabanlı, floresan endotoksin algılama tayini (Malzeme Tablosu). Üreticinin protokolünü izleyerek bu tayini gerçekleştirin.
-
Endotoksinin çıkarılması ve protein konsantrasyonu
- Yaklaşık 10 dk. için 3.200 x g ve 10 °C'de 50 kDa santrifüj filtre ünitesine ve santrifüje 15 mL numune yükleyin. Her adımdan sonra mümkün olduğunca fazla protein ilerletmek için filtre zarını HBS ile iki kez yıkayın.
- S100A12 içeren akışı, hacim ilk yükleme hacminin onda birine kadar beşte birine (3.200 x g, yaklaşık 30 dakika boyunca 10 °C'de santrifüj) indirinceye kadar 3 kDa santrifüj filtre kullanarak yoğunlaştırın. Filtreyi gerektiği sıklıkta doldurun, membranı durulayın ve konsantre çözeltiyi her dolumdan sonra yeni bir tüpe aktarın. Akışı atın. Yukarıda açıklandığı gibi 50 kDa ile tekrar filtreuygulayın.
NOT: Bu işlem sırasında, protein kaybı dikkat çekicidir (%50'ye kadar), ancak kalan protein preparatları LPS'den tamamen tükenir. Bu yöntem 400 mL kültüründen yaklaşık 10−15 mg protein verir. - Protein çözeltisini endotoksinsiz HBS ile 1 mg/mL'ye ayarlayın ve adım 3.1.1'de açıklandığı gibi LPS içeriğini ölçün. Protein çözeltisinin LPS içermeyen (<0.1 EU/mL) olarak hala test edilememiş olması durumunda, endotoksin giderme recibunu kullanarak kalıntı kontaminasyonu ortadan kaldırın.
NOT: Protein konsantrasyonu 1 mg/mL olan 0.1 EU/mL LPS'nin kontaminasyonu yaklaşık 0.01 pg LPS/μg proteine eşittir.
4. Kimyasal Crosslinking ve Oligomer Ayırma
-
Kimyasal crosslinking
- Ultra saf deiyonize suda 1 M CaCl2 ve 100 mM ZnCl2'lik son derece saf (endotoksiniçermeyen) stok çözeltilerini hazırlayın(Malzeme Tablosu). Bir sonraki adım için bu arabelleği, yeni yapılmış olarak kullanın.
- 10 mL saflaştırılmış endotoksinsiz S100A12 (HBS'de konsantrasyon 1 mg/mL) oda sıcaklığında 30 dakika (RT) dimeric/tetrameric için 25 mM CaCl2 veya hexameric/tetrameric S100A12 için 25 mM CaCl2 ve 1 mM ZnCl2 oligomerlar.
- Kullanmadan önce 500 μL endotoksinsiz suyun 8 mg BS3 mg'ını eriterek çapraz bağlantıyı hazırlayın (10 mL iyon çivili protein çözeltisi için 8 mg crosslinker 1.4 mM'lik son konsantrasyona eşittir). Çapraz bağlantıyı karıştırın ve rt. 1 M Tris-HCl, pH 7.5 50 mM son konsantrasyonve filtre ile 0.45 μm ile reaksiyon quench ek 30 dakika için pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
-
Boyut dışlama kromatografisi
- Çapraz bağlı numuneyi 12−15 °C (kolon sıcaklığı) arasında dengeleyin ve sıvı kromatografi sistemini genel bakım la çalıştırın. Sütun arabelleği (HBS) ve boyut dışlama sütununa bağlayın. Ayrıntılı bilgi için Tablo 5'e bakın.
- HbS'deki kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve çalışma sırasında tepe kesirlerini (1−2 mL) toplayın. Bu kesirleri %4−20 degrade SDS-PAGE ve havuz fraksiyonları üzerinde istenilen protein kompleksinin ana bantları ile analiz edin.
NOT: Sulu çözeltilerde BS3 gibi NHS ester reaktiflerinin hidrolizi 280 nm'de güçlü bir emicilik sağlar. Bağlantısız çapraz bağlantı (molekül ağırlığı: 572 g/mol) koşu sonunda eutes ve güçlü bir tepe ile sonuçlanır. - 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) veya 50 kDa (hexamer) MWCOs ile santrifüj filtre üniteleri kullanarak çözeltileri konsantre. Bölüm 3.1'de açıklandığı gibi endotoksin kontaminasyonunu belirleyin. Gerekirse, üreticinin tavsiyelerine(Malzeme Tablosu)uyarak kalan LPS'yi endotoksin giderme reçiyonu ile çıkarın.
5. Monositler Üzerinde Fonksiyonel Test
- Monositlerin hazırlanması
- Yoğunluk gradyan santrifüj ve sonraki monosit zenginleştirme ile insan buffy kat monositler izole manyetik boncuk ayırma kiti kullanarak(Malzeme Tablosu).
NOT: Bu protokol yaklaşık 5−7 x 107 monosit (bir buffy kat) saflık %83−95 ile sonuçlanacaktır. Hücre sayısı nın değil, aynı zamanda yanıt verme nin donöre bağlı olması nedeniyle, protokolün (gerekli hücre sayısına bağlı olarak) ölçeklendirilmesi gerekebilir. - Yoğunluk santrifüjü için ayırma çözeltisini (yoğunluk = 1,077 g/mL) RT'ye dengeleyin ve 20 mL'yi 50 mL santrifüj tüpüne (buffy coat başına 2 tüp) aktarın. Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile insan buffy ceketindeki kanı 60 mL toplam hacimve bu karışımın 30 mL'lik tabakasına kadar seyreltin. Sentrifüj 550 x g 35 dk rt. santrifüj fren ilerler.
- Santrifüjden sonra mononükleer periferik kan hücreleri (PBMCs) ayırma ortamının hemen üstünde yer alır. Bu hücreleri 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın, HBSS ile 50 mL'ye kadar yapın ve 10 dk.'da 170 x g'de santrifüj yapın.
- Tüpü 50 mL'ye kadar doldurun ve 10 dk için 290 x g'da santrifüj doldurun. /c9>) 5 x 107 hücre/mL konsantrasyonuna.
NOT: HBSS yerine, fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak için kullanılabilir. - PBMC'lerden monosit izolasyonu için manyetik negatif hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin protokolünü uygulayın. Monositleri sayın ve monosit ortamda (RPMI 1640, %15 ısı-inaktive fetal baldır serumu [FCS], 4 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin/streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna geri alın.
- Kültür monositler için, ceket kültür yemekleri (örneğin, 100 mm) bir hidrofobik, gaz geçirilebilir film, süspansiyon hücreleri için uygun(Malzeme Tablosu). Yaklaşık 30 dakika UV ışığı kullanarak plakaları sterilize edin. Hücreleri bu kültür plakalarına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'degece boyunca dinlenmelerini sağlar.
NOT: Kaplamalı çanak başına 15−25 mL hücre süspansiyonu kullanın.
- Yoğunluk gradyan santrifüj ve sonraki monosit zenginleştirme ile insan buffy kat monositler izole manyetik boncuk ayırma kiti kullanarak(Malzeme Tablosu).
- Monosit stimülasyonu
- S100A12 ile stimülasyon (wildtype)
NOT: İşlenmemiş S100A12'yi (bölüm 2.2.2'den son ürün) çapraz bağlı proteinden ayırt etmek için, aşağıdaki S100A12'ye 'yabani tip' denir.- Dinlenmiş hücreleri 10 dk için 350 x g'de 50 mL santrifüj tüp ve santrifüje aktarın. streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonda.
- Stimülasyon için, 24 iyi süspansiyon plakası kullanın ve kuyu başına 250 μL hücre süspansiyonu ekleyin (0,5 x 106 hücre/kuyu). Amaçlanan kuyulara 50 g/mL polimaddin B ekleyin ve ardından farklı konsantrasyonlarda LPS (25, 50, 100 ve 200 pg/mL) veya wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL) ekleyin. Ayrıca, proteini işlenmemiş veya ısıden arındırılmış (99 °C, 10 dk) farklı konsantrasyonlarda hücrelere uygulayın.
NOT: Kısa ısıl işlem S100A12 proteinini denatüre eder ancak LPS üzerinde daha az etkisi yoktur. - 37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçka plakaları. Her kuyunun hücre süspansiyonuna 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktararak hücreleri hasat edin. 10 dakika için 500 x g'de santrifüj. Süpernatantları taze tüplere aktarın ve üreticinin tavsiyelerine uygun olarak bir insan TNFα ELISA kiti ile tnfα salınımını farklı seyreltmelerde (örn. 1:2, 1:5, 1:10) ölçün.
- S100A12 oligomerleri ile stimülasyon
- Hazırlamak ve yukarıda açıklandığı gibi 24 iyi süspansiyon plakaları monositler tohum. Adım 4.2.3 S100A12 oligomerler ekleyerek hücreleri uyarmak. farklı molar konsantrasyonlarında (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
NOT: Farklı oligomerlerin monositleri uyarabilmeleri için hücrelere karşılaştırılabilir azı lı konsantrasyonlarda oligomerler uygulandı. - 37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçkaya yatın, hücreleri hasat edin ve yukarıda açıklandığı gibi süpernatantlarda TNFα salınımını ölçün.
- Hazırlamak ve yukarıda açıklandığı gibi 24 iyi süspansiyon plakaları monositler tohum. Adım 4.2.3 S100A12 oligomerler ekleyerek hücreleri uyarmak. farklı molar konsantrasyonlarında (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- S100A12 ile stimülasyon (wildtype)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AIEX kolonunda ön arıtma(Şekil 1A-C)ve sonraki kalsiyuma bağımlı HIC(Şekil 2A,B)sonra, yüksek saf protein elde edildi (Şekil 2C). Buna ek olarak, endotoksin ölçümleri başarılı LPS kaldırma ortaya. AIEX'i izleyen LPS içeriği, 500 EU/mL'nin üzerinde, yani, assay algılama limitinin 1:10 seyreltmesinde ölçüldü. 50 kDa filtre ünitesinden ilk filtreleme den sonra, LPS içeriği 1 EU/mL'ye düşürüldü. 3 kDa filtre ünitesi ve 50 kDa ile ek filtrasyon ile konsantrasyon uğrama sonra ölçülen LPS kontaminasyonu 0.08 EU/mL idi.
Ek bir kontrol olarak, üretilen yabani tip protein(Şekil 3A,B)ile insan monositleri uyarıldı. Polimiksin B tedavisi, S100A12 ile gözlenemez LPS uyarılmış monositlerden TNFα salınımını ortadan kaldırıyor. Diğer taraftan, hem LPS hem de S100A12'nin ısıl işlem, proteinin hücreleri uyarma kapasitesini ortadan kaldırırken, bu LPS stimülasyonuna hücresel yanıtı etkilemez.
Farklı iyonlara protein maruziyeti, farklı S100A12 oligomerlerinin düzenlenmesiyle sonuçlanır (Şekil 4A). Kimyasal çapraz bağlama, dimerler, tetramerler ve hexamer'lar gibi tanımlanmış komplekslerin yanı sıra geçiş durumları (örneğin, 'düzelticiler', yaklaşık 30 kDa bant) gibi tanımlanmış kompleksleri yakalamayı sağlar. Çapraz bağlanmadan önce oliomer dengesinin belirgin bir değişimini sağlamak için, fazla iyonlar uygulandı (Şekil 4B).
Eşit molar konsantrasyonlarda izole oligomerler(Şekil 5A-C)prr'ler ile sinyalyeteneklerini karşılaştırmak için monosit stimülasyonu için kullanılmıştır. ). Tetramerik S100A12 ile uyarılmış hücrelerden kalıntı sitokin salınımı saptanabilirken, dimerik proteinle tedavi TNFα salınımını tetiklemez.
Şekil 1: Aniyon değişimi kromatografisi sonuçları. (A) 280 nm (A280)ve elüsyon arabelleği B (kesik çizgi) yüzdesi emici bir kromatogram. Yöntem blokları A = bağlı olmayan örnekle gösterilir, B = elütion arabelleği ile doğrusal degrade (arabellek B), C = arabellek B ile yıkayın ve D = arabellek A. (B) Kırmızı kesirli tüp numaraları ile ilgili zirvelere odaklanın. (C) Seçilen kesirler %15 Coomassie lekeli SDS-PAGE üzerinde analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hidrofobik etkileşim kromatografisi sonuçları. (A) 280 nm (A280)ve elüsyon arabelleği B (kesik çizgi) yüzdesi emici bir kromatogram. Yöntem blokları A = bağlı olmayan numuneyi yıkama, B = arabellek B ile elution ve arabellek A.' da C = yeniden dengeleme ile gösterilir. (B) Kırmızı kesirli tüp numaraları ile ilgili zirvelere odaklanın. (C) %15 Coomassie lekeli SDS-PAGE'de kesirler analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Primer insan monositleri belirtilen konsantrasyonlarda uyarıldı. LPS (A) veya S100A12 (yabani tip, B)işlenmemiş veya ısıden zarar görmüş (99 °C, 10 dk). Her iki koşul da polimtoksin B varlığında ve yokluğunda test edilmiştir.
Şekil 4: S100A12 proteini 5 mM Ca2+ içeren HBS tamponunda kuluçka sonrası BS3 ile çapraz bağlaştı ve Zn2+ konsantrasyonları gösterdi. (A) Artan Zn2+ konsantrasyonları, %4−20 Coomassie lekeli SDS-PAGE'de ayrılması üzerine S100A12'nin tetramer ve hexamer'lara dönüşmesine neden olur. (B) Bir boyut dışlama sütununda ayırma için kullanılan koşullara sahip çapraz bağlı oligomerlerin temsili sonucu. S100A12, 25 mM Ca2+ (şerit 1) veya 25 mM Ca2+ ve 1 mM Zn2+ (şerit 2) varlığında çapraz bağlandı. (S100A12) 2 = dimer; (S100A12) 4 = tetramer; (S100A12) 6 = hexamer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: S100A12 oligomerleri boyut dışlama sütununda ayrılmıştır. HBStamponunda 25 mM CaCl2 ve 1 mM ZnCl2ile çapraz bağlandıktan sonra hexamer/tetramer ayırmanın kromatogramı . (B) 25 mM CaCl2ile HBS tampontetrasında tetramer/dimer ayırma için kromatogram . (C) Coomassie-lekeli 4−15% degrade SDS-PAGE üzerinde ayrıldıktan sonra havuzlu ve konsantre oligomerler örneği. Şerit 1 = dimer; şerit 2 = tetramer; şerit 3 = hexamer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Saflaştırılmış S100A12 oligomerleri ile monositlerin uyarılması. 4 saat kuluçka dan sonra TNFα-salınımı ELISA tarafından ölçüldü. Veriler, iki bağımsız denemenin ortalama değerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yatak Hacmi (CV) | 75 mL |
| Monitör | 280 nM'de absorbe etme |
| Basınç Max | 3 bar |
| Sütun arabelleği A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Sütun arabelleği B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Örnek Hacmi | Değişken |
| Akış Hızı | 1−2 mL/dk |
| Sıcaklık | 4 °C |
Tablo 1: Aniyon değişimi kromatografisinin uygulanan parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi.
| Blok | Birim | Arabellek | Çıkış |
| Denklik | 1−2 sütun hacmi (CV) | A | Atık |
| Örnek yük | Yok | A | Atık |
| Bağlanmamış numuneyi yıkayın | 1 CV | A | Yüksek hacimli çıkış |
| Degrade-Elüsyon | 0−100 % 1 CV'de Tampon B | A'dan B'ye | Kesir toplayıcısı |
| Yıkayın–Arabellek B | 1 CV | B | Atık |
| Yeniden Sorgulama | 2 cv'ler | A | Atık |
Tablo 2: Aniyon değişimi kromatografisinin kullanılan yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi.
| Yatak Hacmi (CV) | 125 mL |
| Monitör | 280 nM'de absorbe etme |
| Basınç Max | 4 bar |
| Sütun arabelleği A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Sütun arabelleği B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Örnek Hacmi | Değişken |
| Akış Hızı | 1−2 mL/dk |
| Sıcaklık | 4 °C |
Tablo 3: Hidrofobik etkileşim kromatografisinin uygulanan parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi.
| Blok | Birim | Arabellek | Çıkış |
| Denklik | 1−2 sütun hacmi (CV) | A | Atık |
| Örnek yük | Yok | A | Atık |
| Bağlanmamış numuneyi yıkayın | 1−2 CV | A | Yüksek hacimli çıkış |
| Elüsiyon | 100 % Arabellek B | B | Kesir toplayıcısı |
| Yıkayın–Arabellek B | 1 CV | B | Atık |
| Yeniden Sorgulama | 2 cv'ler | A | Atık |
Tablo 4: Hidrofobik etkileşim kromatografisinin kullanılan yöntemi hakkında detaylı bilgi.
| Yatak Hacmi (CV) | 320 mL |
| Monitör | 280 nm'de absorbe etme |
| Basınç Max | 3 bar |
| Sütun arabelleği A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.2 |
| Örnek Hacmi | 13 mL'ye kadar |
| Akış Hızı | 1−1,5 mL/dk |
| Sıcaklık | 12−15 °C |
Tablo 5: Boyut dışlama kromatografisinin uygulanan parametreleri için ayrıntılı bilgi.
Ek Tablo 1: Tamponlar ve stok çözümlerinin hazırlanması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, insan S100A12 etiketsiz bakteriyel ekspresyonu ve saflaştırma yanı sıra bağışıklık hücresi stimülasyonu için farklı iyon kaynaklı oligomerler içine ayırma açıklar. S100A12 protein arınması8,23,24üzerine yayınlanan literatürile karşılaştırıldığında hidrofobik etkileşim kromatografisinde yüksek CaCl2 (25 mM) kullanımı bilgimize özgüdür. 1 ila 5 mM arasında konsantrasyon uygulayan çeşitli protokoller saf protein üretir, ancak 25 mM CaCl2 yerine yaklaşımımızı takiben birkaç kat daha yüksek verim gözlemledik. Bu, sütun materyali ile protein etkileşiminin bir hiyerarşisi ile açıklanabilir:S100A12 doğrudan sütun materyaline bağlanabilir ancak Ca2+ fazlalığı da S100A12-dimerlerin zaten sütuna bağlı olan proteine dolaylı bağlanmasını kolaylaştırabilir 8. Böylece, yüksek Ca2+ konsantrasyonları S100A12 arıtma için mevcut yüzeyi büyütebilir. Hic'ten S100A12'nin doğrusal bir degradekullanılarak erken (dolaylı olarak bağlı S100A12) ve çok geç bir tepe (sütun malzemesine bağlı protein) olarak elüsyonu bu spekülasyonları (veri gösterilmez) destekleyebilir.
Rekombinant S100A12 (ve diğer proteinlerin) yüksek verim ve yönetilebilir maliyetlerle üretimi için, E. coli protein ekspresyonu hala tercih edilen yöntemdir. Ancak, bakteriyel endotoksinler ile kaçınılmaz kontaminasyon bir sorun olmaya devam etmektedir, proteinler hücre kültürü deneyleri için belirlenir, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri içeren çalışmalarda özellikle. Deneyimlerimize göre, hücre kültürü kullanımı için açıkça beyan edilen ticari olarak mevcut proteinler bile 1 AB/μg proteinine kadar endotoksin kontaminasyonu içerebilir ve bu proteinler tahlilleri önemli ölçüde çarpıtabilir. Bu nedenle, endotoksinlerin tamamen çıkarılması zorunludur. Çözeltideki endotoksin monomerleri 10 ila 20 kDa arasında değişmektedir, ancak miseller ve daha yüksek molekül ağırlıklarına sahip yapılar oluşturabilirler. Çok büyük yapıların oluşumu, örneğin, bivalent iyonlar21,25ile teşvik edilir.
Protokolümüzgereği, yüksek duyarlılıklı endotoksin ölçümlerini monosit stimülasyon testleriyle birleştirerek S100A12 proteininin endotoksinsiz üretimini doğrulıyoruz. Bu kombinasyonun özellikle anlamlı olduğunu düşünüyoruz a) Düşük seviyeli endotoksin kontaminasyonu, talın hassasiyetine bağlı olarak değerlendirilmesi zor olabilir ve b) polimiksin B'nin monositlerde LPS inhibitörü olarak kullanılması nedeniyle verilerin yorumlanmasında zorlanabilir hücreler üzerinde özel polimtoksin B etkileri26,27. Polimiksin B ve diğer katyonik peptidler negatif yüklü lipid A28ile LPS bağlamak için bildirilmiştir . S100A12'nin çözücü maruz kalan yüzeyi de büyük negatif yüklü yamalar içerdiğinden, polimin B(Şekil 3B)varlığında S100A12 uyarılmış insan monositlerinden TNFα salınımının gözlenen azalması a) spesifik olmayan doğrudan bağlanmasına bağlı olabilir. polimiksin B'den S100A12'ye ve/veya b) polisimiksin B'nin uyarılmış hücreler üzerindeki doğrudan etkileri26,27. Hem düşük seviyeli endotoksin kontaminasyonunun saptanması hem de spesifik olmayan poliksin B etkilerinin bilinen sınırlamaları nedeniyle, protokolümüz LPS ve protein aracılı TLR4 sinyalizasyonunu net bir şekilde ayırt etmek için Bir ısı inaktivasyon adımı da içermektedir.
LPS-free S100A12'nin tanımlanmış iyon kaynaklı oligomerlerin üretimi ve saflaştırılması için kullanılması önemlidir ve tamponlar veya kolon malzemesi ile endotoksinin nihai olarak tekrar girişini önlemek için sonraki saflaştırmalarına ekstra dikkat edilmelidir ve böylece endotoksin giderme recinesi ile daha fazla protein gerektiren LPS-tükenmesi.
Proteinlerin biyolojik işlevi için oliomerizasyonun önemi farklı yollarla değerlendirilebilir. S100A12 durumunda, iyon bağlayıcı bölgelerde yüzey plazmon rezonansının yanı sıra hedeflenen amino asit değişimlerini kullandık ve tlR4―ile bağlanabilen protein kompleksini ve sinyalini tam olarak tanımlamak için Ca2+/Zn 2+ kimyasal çapraz bağlantı kullandık. -darbeli rekombinant S100A1216. Farklı iyonik koşullar altında S100A12 kimyasal crosslinking snap-geçiş aşamasında olan çeşitli oligomerik formları da dahil olmak üzere bir anlık devlet donuyor. Iyon titrasyonu deneylerinden dimerik, tetramerik veya hexameric oligomerlerin baskın oligomerler16olarak belirlenebileceği koşulları tanımladık. Buna ek olarak, önceki deneyler iyonların aşırı karşılaştırılabilir, kararlı crosslinking ve sonraki arıtma için yararlı olduğunu göstermiştir, oliomerizasyon da önemli ölçüde daha düşük iyon konsantrasyonlarında indüklenebilir rağmen. Ancak, bu oligomerlerin boyut dışlama kromatografisi ile arındırılması, mutlak ayrışma değil, iyi sonuçlanır. Yine de, oligomerlerin seçici zenginleşmesi güvenilir downstream analizleri sağlar.
Özetle, bu protokol LPS içermeyen insan S100A12 veya ilgili kalsiyum bağlayıcı proteinlerin saflaştırılması için bir yöntem sağlar. İyona bağlı konformasyonel değişiklikleri düzeltmek için, kimyasal çapraz bağlama ve boyut dışlama kromatografisi ile sonraki karmaşık ayırma, aşağı biyolojik süreçler için protein oliomerizasyonunun önemini anlamak için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Muenster Üniversitesi tıp fakültesi (KE121201-C.K.) ve Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG, Fo354/3-1'den D.F.)'e intramural yenilikçi tıbbi araştırma programı tarafındandesteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
