Summary
يصف هذا البروتوكول طريقه تنقيه لبروتين الكالسيوم الخالي من العلامات المؤتلف S100A12 والقلة المستحثة بالأيونات لاختبارات تحفيز البويضات البشرية.
Abstract
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لتنقيه الإنسان الكالسيوم ملزمه البروتين S100A12 ولها الأيونات الناجمة عن الايونيه من الثقافة القولونية لتحفيز الخلايا المناعية. ويستند هذا البروتوكول علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تشمل البروتين قبل تنقيه علي عمود اللوني التبادل انيون وخطوه تلميع اللاحقة علي عمود التفاعل مسعور. وتنتج هذه الاستراتيجية S100A12 بروتين عالي النقاء والغلة بتكاليف يمكن التحكم فيها. لاختبارات وظيفية علي الخلايا المناعية بقايا في نهاية المطاف التلوث اندوتوكسين يتطلب الرصد الدقيق والمزيد من الخطوات التنظيف للحصول علي البروتين الخالي من اندوتوكسين. ويمكن استبعاد غالبيه تلوث السمية المعوية من خلال الفصل اللوني لتبادل انيون. لاستنفاد تلوث المتبقية ، يصف هذا البروتوكول خطوه أزاله مع مرشحات الطرد المركزي. اعتمادا علي القوه الأيون المتاحة S100A12 يمكن ان يرتب في homomultimers مختلفه. وللتحقيق في العلاقة بين الهيكل والوظيفة ، يصف هذا البروتوكول أيضا المعالجة الايونيه للبروتين S100A12 التي تليها الوصلات الكيميائية لتحقيق الاستقرار S100A12 قله المواليد وانفصالها اللاحق بالحجم-الاستبعاد اللوني. وأخيرا ، فاننا نقوم بوصف الفحص القائم علي الخلايا الذي يؤكد النشاط البيولوجي للبروتين المنقي ويؤكد التحضير الخالي من LPS.
Introduction
S100A12 هو بروتين ملزم الكالسيوم الذي يتم إنتاجه في الغالب من قبل المحببات البشرية. يتم الإفراط في البروتين خلال (الجهازية) التهاب ومستويات المصل ، وخاصه في (السيارات) الامراض التهابيه مثل التهاب المفاصل الجهازية الاحداث مجهول الشكل (sJIA) ، حمي البحر الأبيض المتوسط العائلية (FMF) أو مرض كاواساكي (KD) يمكن ان تبلغ عن نشاط المرض والاستجابة للعلاج. اعتمادا علي مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل المستقبلات مثل الحصيلة (TLRs) ، يمكن تنشيط الجهاز المناعي الفطري من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) مثل الليبوكوليساشاريدس (LPS) أو تلف الأنماط الجزيئية المرتبطة (DAMPs; ويطلق عليه أيضا اسم "الاردقائق". DAMPs هي جزيئات الذاتية مثل البروتينات الخلوية ، والدهون أو الأحماض النووية1. ووصفت بشكل جيد وظائف رطبه لأعضاء عائله البروتين كالغرولين ، S100A8/A9 و S100A122، والتي يتم أيضا الإبلاغ عنها للعمل كمعدن ثنائي التكافؤ الأيونات المضادة للميكروبات الببتيدات3،4، 5,6. [دبندينغ ون] ال يتوفر أيون قوه S100A12 علبه, مثل أخرى أعضاء من ال S100 أسره, يرتب داخل [هوميمرمررس] مختلفه وحتى مؤخرا التاثير من [S100A12-اوليغمرايشن] علي [بر]-تفاعل, بشكل خاص TLR4, كان مجهوله.
يتكون البروتين الأحادي الشكل (92 الأحماض الامينيه ، 10.2 كده) من اثنين من الهياكل الحلزونية اللولبية المتصلة بواسطة رابط مرن. و C-الطرفية ef-اليد يحتوي علي الكلاسيكية Ca2 +-ربط عزر في حين ان N-الطرفية ef-اليد يسلك هيكل حلقه موسعه البروتين الخاصة S100 (' الزائفة-ef-اليد ') ويكشف انخفاض Ca2 +-تقارب. Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 يمكن ان تحفز علي تغيير المطابقة الرئيسية في البروتينات ' C-المحطة ، مما يؤدي إلى التعرض لرقعه مسعورة علي كل مونومر ويشكل واجهه ديميريشن. وهكذا ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، أصغر هيكل رباعي شكلتها S100A12 هو ديمر غير التكافؤ (ما يقرب من 21 كده) فيها مونومرات الفردية في اتجاه مضاد للمتوازي. عندما رتبت كما dimer, وذكرت S100A12 لتنحيه الزنك2 + فضلا عن غيرها من أيونات المعادن ثنائي التكافؤ, علي سبيل المثال, Cu2 + مع تقارب عاليه7. وتنسق هذه الأيونات في واجهه S100A12 ديمر بواسطة الأحماض الامينيه H15 وD25 الوحدة الفرعية واحده وH85 فضلا عن H89 الفرعية الأخرى8,9,10المضادة لمتوازي الأضلاع. في حين ان الدراسات السابقة تقترح ان الزنك2 +-تحميل S100A12 قد تحفز منظمه البروتين إلى الإنسان-الترام (44 كده) ويؤدي إلى زيادة Ca2 +-تقارب11,12, المعايرة الاخيره المعادن دراسات6 تشير Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 لزيادة تقارب البروتين إلى الزنك2 +. مره واحده S100A12 EF-الأيدي التي احتلت بالبالكامل من قبل Ca2 +، ويعتقد ca2 + اضافيه للربط بين الدمامل ، مما اثار تشكيل hexamer (حوالي 63 كده). ومن الواضح ان البنية المعمارية للهيكل السداسي الأضلاع مختلفه عن الهيكل الرباعي. ومن المقترح ان يتم تعطيل واجهه رباعيه لتؤدي إلى واجات dimer-dimer الجديدة التي تفيد تشكيل hexamer10. يتم التعبير عن S100A12 بشكل حصري تقريبا من قبل المحببات البشرية حيث تشكل حوالي 5 ٪ من جميع البروتين السيتووليك13. في وظيفته رطبه S100A12 وصفت تاريخيا بأنه ناهض من متعددة ligand مستقبلات للمنتجات النهائية glycation المتقدمة (الغضب) ، ثم وصفت حديثا خارج الخلية المعروفة الغضب البروتين ملزمه (EN-الغضب)14. وان كنا قد أبلغت في وقت سابق S100A12 البيوكيميائية لكل من الغضب و TLR415، ونحن أظهرت مؤخرا الخلايا الاحاديه الإنسان للرد علي التحفيز S100A12 بطريقه تعتمد علي TLR416. وهذا يتطلب ترتيب S100A12 في المرجع المصدق2 +/Zn2 +-المستحثة سداسي الأضلاع هيكل كوارتيراري16.
هنا نحن وصف اجراء تنقيه لS100A12 البشرية المؤتلف والتي يسببها الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية16,17. ويستند هذا علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تتضمن في البداية عمود انيون-تبادل لعزل وتركيز البروتين وأزاله التلوث السائبة (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين/ليبووليساشاريدس)18. راتنجات الفصل اللوني للتبادل الأيوني بروتينات منفصلة علي أساس مختلف صافي الرسوم السطحية. للبروتينات الحمضية مثل S100A12 (نقطه ايزوالكتريك من 5.81) ، ونظام العازلة مع درجه الحموضة من 8.5 وقويه انيون-تبادل الراتنج يؤدي إلى فصل جيد. تم التملص من البروتينات المنضمة مع التدرج العازلة عاليه الملح. مع زيادة الأيونات السلبية قوه الايونيه في العازلة التهرب تتنافس مع البروتينات للرسوم علي سطح الراتنج. البروتينات بشكل فردي الوت اعتمادا علي صافي التهمه ونتيجة لذلك ، والمخازن المؤقتة الموصوفة هنا تسمح لعزل وتركيز البروتين S100A12 الإفراط في التعبير. بسبب الجماعات المشحونة سلبا في الليبووليساشاريدس ، ترتبط هذه الجزيئات أيضا إلى راتنجات التبادل انيون. ومع ذلك ، فان ارتفاع الرسوم الصافية يؤدي إلى التملص في وقت لاحق في التدرج عاليه الملح المطبق. وقد تم إدخال الخطوة الثانية من اجراء تنقيه لتلميع الأغراض. وهذا يجعل استخدام قدره ربط الكالسيوم من S100A12 ويزيل الشوائب المتبقية علي عمود التفاعل مسعور. الكالسيوم ملزمه من S100A12 يؤدي إلى تغيير المطابقة والتعرض للبقع مسعور علي سطح البروتين. علي هذا الشرط ، يتفاعل S100A12 مع سطح مسعور من الراتنج. علي الكالسيوم-chelating من قبل أدتا ، يتم عكس هذا التفاعل. في وجود الأيونات ، وخاصه الكالسيوم والزنك ، S100A12 يرتب في الأقليات homomeric. لدراسة هيكل العلاقات وظيفة من القلة المختلفة ، ونحن استقرت ديميريك ، رباعيه الS100A12 والمؤتلف هيكاميرك مع الرابط الكيميائية وفصل المجمعات علي عمود اللوني الاستبعاد الحجم. وأخيرا ، لتحليل الأداء الوظيفي والنشاط البيولوجي للبروتين المنقي والقلة المستحثة بالأيونات ، يمكن مقارنه الإصدار الخلوي من S100A12 و LPS الذي يحفز البويضة الاحاديه.
وقد وصفت طرق مختلفه لتنقيه S100A12 حتى الآن. وعلي سبيل المثال ، نشر جاكسون وآخرون19بروتوكولا بالتنقية عن طريق عمود التبادل انيون والفصل اللوني اللاحق لحجم الاستبعاد. تلميع تنقيه علي عمود الحجم الاستبعاد يؤدي إلى نتائج جيده ، ولكن-بسبب علي سبيل المثال احجام التحميل محدوده-اقل مرونة في قابليه التحجيم. نهج مختلف ، نشرتها قبله وآخرون20، يصف تنقيه البروتين الموسومة عن طريق Ni2 + عمود التقارب كخطوه تنقيه الاولي ، تليها الانقسام الانزيمي لأزاله العلامة والمزيد من خطوات تنقيه. علي النقيض من الدراسات aforecited19،20، يتم تحديد البروتين المنتجة كما هو موضح في هذا البروتوكول للتجارب علي الخلايا المناعية. ولذلك ، فان بقايا التسمم المعوي من الثقافة البكتيرية هو تحد. علي الرغم من انه قد تم وصف النهج المختلفة لأزاله الذيفان المعوي حتى الآن ، لا توجد طريقه موحده تعمل بشكل جيد علي قدم المساواة لأي محلول بروتين معين21،22.
وباختصار ، فان بروتوكولنا يجمع بين مزايا التعبير الخالي من العلامات في نظام بكتيري مع أزاله اندوتوكسين فعاله والغلة العالية من البروتين النقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1 لاعداد المخازن المؤقتة وحلول الأسهم.
1. البروتين التعبير في كولاي
-
استنساخ
- استنساخ العلامة الحرة الإنسان S100A12 (NCBI المرجع تسلسل: NP_ 005612.1) في ناقلات التعبير البكتيرية pET11b. للتعبير عن البروتين ، وتحويل البناء إلى e. القولونية BL21 (DE3).
-
الثقافه
- اعداد ثقافة بداية عن طريق تطعيم مستعمره واحده في 5 مل من متوسط النمو (رطل مرق مع 100 ميكروغرام/مل ampicillin) في أنبوب 14 مل جولة أسفل. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة. نقل 2 − 4 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها إلى 400 مل من متوسط النمو في قارورة ايرلينماير 2 لتر واحتضان الثقافة في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة.
ملاحظه: الكثافة الاوليه للثقافة الرئيسية يجب ان تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) = 0.1. - مراقبه OD600 خلال النمو. الحث علي التعبير عن البروتين بالاضافه إلى 1 م ايزوبروبيل-دي-د-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) إلى تركيز نهائي من 1 ملم في OD600 = 0.5-0.6. احتضان في 37 درجه مئوية و 220 دوره في الدقيقة لمده 4 ساعات اضافيه.
ملاحظه: بشكل عام ، سيتم التوصل إلى600 OD من 0.6 بعد 1.5 − 2.5 h عند 37 درجه مئوية. - اعداد 50 mL المخزن المؤقت سونيكيشن عن طريق تذويب 50 mM تريس ، 50 mM كلوريد الصوديوم و 1 ملليمتر ايثيل لينديمين حمض تتراكسي (أدتا) في 40 مل من الماء منزوع الأيونات. ضبط درجه الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك إلى 8.0 وجعل ما يصل إلى 50 mL. أضافه مثبط الانزيم البروتيني (1 قرص لكل 50 mL محلول) وتتوازن العازلة إلى 4 ° c.
- نقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات الطرد المركزي مناسبه وحصاد الخلايا في 3,200 x g لمده 30 دقيقه في 4 °c. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 25 مل من المخزن المؤقت سونيكيشن الجليد الباردة. من الآن فصاعدا إبقاء الخلايا علي الجليد.
ملاحظه: يمكن تخزين الخلايا المعاد تعليقها عند-20 درجه مئوية للأجل القصير و-80 درجه مئوية للأجل الطويل.
- اعداد ثقافة بداية عن طريق تطعيم مستعمره واحده في 5 مل من متوسط النمو (رطل مرق مع 100 ميكروغرام/مل ampicillin) في أنبوب 14 مل جولة أسفل. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة. نقل 2 − 4 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها إلى 400 مل من متوسط النمو في قارورة ايرلينماير 2 لتر واحتضان الثقافة في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة.
-
سونيكيشن/تحلل
- سوكاتي الخلايا ل 6 دورات من 30 ق علي الجليد. بعد كل دوره ، وبقية الخلايا لمده 30 − 60 s لحماية الخلايا من ارتفاع درجه الحرارة.
- نقل تعليق الخلية إلى ما قبل المبردة 50 mL عاليه السرعة أنبوب طرد والطرد المركزي في الدوار زاوية ثابته في 15,000 x g لمده 30 دقيقه في 4 ° c. Decant مسح محلله الذي يحتوي علي البروتينات السيتووليك القابلة للذوبان في أنبوب 50 mL الطازجة وتجاهل بيليه.
2. تنقيه البروتين
- انيون-تبادل اللوني
- غسيل الكلي
- اعداد انيون-تبادل اللوني (AIEX) العازلة من قبل تذويب 20 مم تريس ، 1 مم أدتا و 1 مم جلايكول الاثيلين-bis (2-امينوميثيلثر)-N ، N ، N ' ، N'-رباعي حمض (EGTA) في الماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 مع HCl. لغسيل الكلي اعداد 2 × 5 لتر واللوني 2x 1 L من AIEX العازلة A.
ملاحظه: يجب ان تكون وحده التخزين الهاتفية في حوالي 100 مرات وحده تخزين العينة. يجب ان يتم تصفيه جميع المخازن المؤقتة المستخدمة للكروماتوغرافي (0.45 μm أو أصغر) والغاز (علي سبيل المثال ، عن طريق حمام الموجات فوق الصوتية أو فراغ التفريغ). - قطع أنابيب الغسيل الكلوي (قطع الوزن الجزيئي [MWCO]: 3.5 كده) إلى طول مناسب مع مساحة اضافيه للهواء لضمان الطفو عينه فوق شريط تحريك الدورية.
ملاحظه: الجلسرين يحفظ الغشاء ويجب ازالته قبل الاستخدام. - للحد من اللزوجة محلول البروتين تطهيرها من الخطوة 1-3-2 ، تمييع الحل مع 25 مل من AIEX العازلة A لتسهيل التطبيق اللاحق للعمود اللوني. نعلق الإغلاق الأول علي الأنابيب ، وتحميل العينة في الغشاء ونعلق الإغلاق الثاني علي الأقل 1 سم من الطرف العلوي من الأنابيب.
- ضع حاويه 5 لتر مع العازلة AIEX A علي لوحه يحركها ، أضافه شريط ضجة والغشاء مليئه محلول البروتين. ضبط السرعة لتدوير العينة عن طريق تجنب التداخل مع تحريك الشريط الدوار. الديزه لمده 12 − 24 ساعة عند 4 درجه مئوية ، ثم استبدل العازل المؤقت (AIEX المخزن المؤقت A) باعداد طازج قبل التبريد واستمر لمده 4 ساعات اضافيه علي الأقل. نقل محلول البروتين ديزيد إلى أنبوب 50 mL وتصفيه من خلال وحده تصفيه 0.45 μm.
ملاحظه: التخزين ممكن.
- اعداد انيون-تبادل اللوني (AIEX) العازلة من قبل تذويب 20 مم تريس ، 1 مم أدتا و 1 مم جلايكول الاثيلين-bis (2-امينوميثيلثر)-N ، N ، N ' ، N'-رباعي حمض (EGTA) في الماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 مع HCl. لغسيل الكلي اعداد 2 × 5 لتر واللوني 2x 1 L من AIEX العازلة A.
- اللوني
- بدء تشغيل نظام اللوني السائل (FPLC) مع الصيانة العامة ، وربط المخازن المؤقتة العمود AIEX A و AIEX B (AIEX العازلة مع 1 م NaCl) والعمود الذي يحتوي علي الراتنج التبادل انيون. راجع الجدول 1 لمعلمات الكروماتوغرافي العامة.
ملاحظه: يجب ان معايرتها المخازن المؤقتة والاعمده ومعدات FPLC إلى نفس درجه الحرارة قبل بدء التشغيل (راجع معلمات الكروماتوغرافي في الجدول 1، الجدول 2، الجدول 3، الجدول 4، والجدول 5). - تتوازن العمود مع المخزن المؤقت aiex a ، ثم تحميل العينة علي العمود و الوت البروتينات مع التدرج الخطي من 0 ٪ إلى 100 ٪ عاليه الملح العازلة (aiex B). راجع الجدول 2 للحصول علي بروتوكول أسلوب مفصل.
- جمع 2 مل الكسور اثناء الشطف وتحليل 10 μL من كل كسر علي كوماسي 15 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS الصفحة). تجمع الكسور التي تحتوي علي بروتين S100A12 لغسيل الكلي.
ملاحظه: الوزن الجزيئي S100A12 هو 10,575 دا.
- غسيل الكلي
- التفاعل اللوني المسعور الذي يعتمد علي الكالسيوم (الائتلاف)
- غسيل الكلي
- الحل البروتين ضد 20 مم تريس ، 140 mM NaCl ، pH 7.5 اتباع الاجراء الموصوف في القسم 2-1-1.
- اللوني
- اعداد 1 لتر من العازل اللوني للموئل A عن طريق تذويب 20 مم تريس ، 140 mM كلوريد الصوديوم و 25 مم CaCl2 في الماء منزوع الأيونات وضبط درجه الحموضة إلى 7.5. للموئل العازلة B ، تذوب 20 مم تريس ، 140 mM NaCl و 50 mM أدتا. ضبط درجه الحموضة إلى 7.0 وتصفيه و ديغا المخازن المؤقتة. أضافه CaCl2 إلى العينة إلى تركيز نهائي من 25 ملم وتصفيه من خلال 0.45 Μm. تتوازن الائتلاف المؤقت وعينه إلى 4 درجه مئوية (درجه حرارة العمود).
- بدء تشغيل نظام اللوني السائل مع الصيانة العامة ، وربط المخازن المؤقتة العمود الائتلاف A و B والعمود. راجع الجدول 3 لمزيد من معلمات الكروماتوغرافي.
- تتوازن العمود ، وتحميل العينة وتوسيع كتله ' غسل عينه غير منضم ' حتى تصل اشاره الاشعه فوق البنفسجية إلى مستوي خط الأساس مره أخرى. ثم بدء التملص مع الكالسيوم التي تحتوي علي العازلة المخزن المؤقت (أدتا). راجع الجدول 4 للحصول علي بروتوكول أسلوب مفصل.
ملاحظه: وقد أظهرت التجارب السابقة ان فائضا من الكالسيوم يبدو ان تكون مفيده للربط من S100A12 إلى راتنج اللوني. - جمع كسور الذروة من 2 مل وتحليل 10 μL من كل كسر علي كوماسي-الملون 15 ٪ SDS-الصفحة. تجمع الكسور S100A12 النقية والديزه ضد Hepes-المحلول الملحي المخزنة (HBS ؛ 20 مم Hepes ، 140 mM NaCl ، pH 7.0) كما هو موضح في القسم 2-1-1.
ملاحظه: معامل الانقراض من موحودي S100A12 هو 2980 M-1 سم-1.
- غسيل الكلي
3. كشف وأزاله السموم الباطنة
-
الكشف عن الذيفان المعوي
- لتحديد التلوث اندوتوكسين ، قياس تركيزات البروتين المخفف من الخطوة 2.2.2.4. (علي سبيل المثال ، 1:10 و 1:100 في HBS) باستخدام مقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA) ، والتي تعتمد علي الفحص الفلوريللكشف عن السموم (جدول المواد). قم باجراء هذا الفحص باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظه: استخدام حلول HBS الطازجة التي تم حلها في الماء منزوع الأيونات الفائقة لتجنب (جديد) التلوث اندوتوكسين من قبل العازلة.
- لتحديد التلوث اندوتوكسين ، قياس تركيزات البروتين المخفف من الخطوة 2.2.2.4. (علي سبيل المثال ، 1:10 و 1:100 في HBS) باستخدام مقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA) ، والتي تعتمد علي الفحص الفلوريللكشف عن السموم (جدول المواد). قم باجراء هذا الفحص باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
-
أزاله الذيفان المعوي وتركيز البروتين
- تحميل 15 مل من عينه علي وحده تصفيه الطرد المركزي 50 دهت وأجهزه الطرد المركزي في 3,200 x g و 10 °c لمده 10 دقيقه تقريبا. نقل تدفق من خلال إلى سفينة جديده (علي الجليد) وأعاده التعبئة والطرد المركزي في 50 كده تصفيه أنبوب كلما كان ذلك ضروريا. يغسل غشاء فلتر مرتين مع HBS لاسترداد أكبر قدر ممكن من البروتين بعد كل خطوه.
- التركيز علي S100A12 التي تحتوي علي التدفق من خلال استخدام فلتر الطرد المركزي 3 كده حتى يتم خفض حجم إلى خمسه تصل إلى واحد عشر من حجم التحميل الاولي (طرد في 3,200 x g، 10 درجه مئوية لمده 30 دقيقه تقريبا). أعاده ملء الفلتر كلما كان ذلك ضروريا ، شطف الغشاء ونقل المحلول المركز إلى أنبوب جديد بعد كل أعاده ملء. تجاهل التدفق من خلال. تصفيه مره أخرى من خلال 50 كده كما هو موضح أعلاه.
ملاحظه: خلال هذا الاجراء ، فان فقدان البروتين ملحوظ (تصل إلى 50 ٪) ، ولكن يتم استنفاد اعداد البروتين المتبقية تماما من LPS. هذا الأسلوب غله حوالي 10 − 15 ملغ بروتين من 400 mL الثقافة. - ضبط محلول البروتين إلى 1 مغ/مل مع اندوتوكسين خاليه من HBS وقياس محتوي LPS كما هو موضح في الخطوة 3-1-1. في حال لم يتم بعد اختبار محلول البروتين كما LPS خاليه (< 0.1 الاتحاد الأوروبي/مل) ، والقضاء علي بقايا تلوث باستخدام راتنج أزاله اندوتوكسين.
ملاحظه: مع تركيز البروتين من 1 مغ/مل, تلوث 0.1 الاتحاد الأوروبي/mL LPS يساوي تقريبا 0.01 pg البروتين الغرام/ميكروغرام.
4. الربط الكيميائي والانفصال اوليغمير
-
الربط الكيميائي
- اعداد نقيه للغاية (اندوتوكسين خاليه) حلول الأسهم من 1 M cacl2 و 100 mM zncl2 في المياه منزوع الأيونات نقاء (جدول المواد). استخدم هذا المخزن المؤقت ، الذي تم اجراؤه حديثا ، للخطوة التالية.
- احتضان 10 مل من المنقي الخالي من السموم S100A12 (تركيز 1 مغ/مل في HBS) لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) مع اما 25 مم CaCl2 ل ديميريك/رباعيه ، أو 25 مم cacl2 و 1 مم zncl2 ل HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligomers.
- اعداد crosslinker عن طريق تذويب 8 ملغ من BS3 في 500 μl من المياه الخالية من اندوتوكسين مباشره قبل الاستخدام (8 ملغ crosslinker ل 10 مل محلول البروتين الأيونات التي ارتفعت يساوي تركيز النهائي من 1.4 mM). مزيج crosslinker وعينه عن طريق التنضيد واحتضان لمده 30 دقيقه اضافيه في RT. إرواء رد الفعل عن طريق أضافه 1 M تريس-HCl ، pH 7.5 إلى تركيز نهائي من 50 mM وتصفيه من خلال 0.45 μm.
-
الفصل اللوني للاستبعاد الحجم
- تتوازن العينة المتقاطعة إلى 12 − 15 درجه مئوية (درجه حرارة العمود) وبدء نظام الفصل اللوني السائل مع الصيانة العامة. الاتصال المخزن المؤقت العمود (HBS) والعمود حجم الاستبعاد. يرجى الرجوع إلى الجدول 5 للحصول علي معلومات مفصله.
- تتوازن العمود في HBS ، وتحميل عينه وجمع كسور الذروة (1 − 2 مل) اثناء التشغيل. تحليل هذه الكسور علي 4 − 20 ٪ التدرج SDS-صفحه وتجمع الكسور مع العصابات الرئيسية من مجمع البروتين المطلوب.
ملاحظه: التحلل من الكواشف استر الدائرة العامة للصحة مثل BS3 في الحلول المائية النتائج في امتصاص قوي في 280 nm. غير منضم crosslinker (الوزن الجزيئي: 572 g/mol) التملص في نهاية الشوط والنتائج في ذروه قويه. - التركيز علي الحلول باستخدام وحدات تصفيه الطرد المركزي مع MWCOs من 10 ده (dimer) ، 30 ده (رباعيه) أو 50 كده (hexamer). تحديد التلوث الذيفان المعوي كما هو موضح في القسم 3.1. إذا لزم الأمر ، أزاله LPS المتبقية مع راتنج أزاله اندوتوكسين بعد توصيات الشركة المصنعة (جدول المواد).
5. اختبار وظيفي علي الخلايا الاحاديه
- اعداد الخلايا الاحاديه
- عزل الخلايا الاحاديه من معاطف بافي البشرية بواسطة طرد التدرج الكثافة والإثراء اللاحق للخلايا الاحاديه باستخدام مجموعه فصل الخرزة المغناطيسية (جدول المواد).
ملاحظه: هذا البروتوكول سوف يؤدي إلى ما يقرب من 5 − 7 × 107 الخلايا الاحاديه (معطف بافي واحد) مع نقاء 83 − 95 ٪. بما ان الرقم, غير ان أيضا الاستجابة الخلايا يعتمد بقوة علي المتبرع, البروتوكول يمكن كنت ان يكون رفعت فوق ([دبندينغ ون] ال يتطلب خليه حساب). - لطرد الكثافة ، تتوازن حل الفصل (الكثافة = 1.077 g/mL) إلى RT ونقل 20 مل في أنابيب الطرد المركزي 50 mL (2 أنابيب لكل معطف بافي). تمييع الدم من معطف بافي الإنسان مع محلول الملح هانك مخزنه (HBSS) إلى الحجم الإجمالي من 60 mL وطبقه 30 مل من هذا الخليط بعناية علي راس متوسط الفصل. جهاز الطرد المركزي في 550 x g ل 35 دقيقه في RT. تعطيل الفرامل الطاردة للطرد المركزي.
- وبعد طرد ، توجد خلايا الدم المحيطيه الاحاديه النواة مباشره علي قمة وسيط الفصل. نقل هذه الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ml جديده ، وجعل ما يصل إلى 50 ml مع hbss ، وأجهزه الطرد المركزي في 170 x g ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في حجم صغير من hbss عن طريق التنضيد.
- ملء أنبوب يصل إلى 50 mL والطرد المركزي في 290 x g ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي مره أخرى ، أعاده تعليق الخلايا في hbss (50 mL) والطرد المركزي في 170 x g لمده 10 دقيقه. عد الخلايا وأعاده تعليقها في المخزن المؤقت لفصل الخلايا (جدول المواد < /c9 >) إلى تركيز 5 × 107 خلايا/مل.
ملاحظه: وبدلا من HBSS ، يمكن استخدام المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (تلفزيوني) لغسل الخلايا. - بالنسبة لعزل الخلايا الاحاديه من Pbmmcmcmcmcmcmcmcmcmmcmcmmcmmc. عدد الخلايا الاحاديه وأعاده التعليق في المتوسطة أحاديه الخلية (RPMI 1640 ، 15 ٪ الحرارة المنشط الجنين الساق [FCS] ، 4 ملم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين/ستربتوميسين) إلى تركيز 2 × 106 خلايا/مل.
- إلى ثقافة الخلايا الوحيدة ، والاطباق الثقافة معطف (علي سبيل المثال ، 100 مم) مع مسعور ، فيلم الغاز نفاذيه ، ومناسبه لخلايا التعليق (جدول المواد). تعقيم لوحات باستخدام ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه تقريبا. نقل الخلايا إلى هذه اللوحات الثقافية والسماح لهم الراحة علي مدي الليل في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
ملاحظه: استخدام 15 − 25 مل من تعليق الخلية لكل طبق المغلفة.
- عزل الخلايا الاحاديه من معاطف بافي البشرية بواسطة طرد التدرج الكثافة والإثراء اللاحق للخلايا الاحاديه باستخدام مجموعه فصل الخرزة المغناطيسية (جدول المواد).
- تحفيز الخلايا الاحاديه
- التحفيز مع S100A12 (النوع الوحشي)
ملاحظه: لتمييز الS100A12 غير المعالجة (المنتج النهائي من القسم 2-2-2) عن البروتين المتداخل ، يتم الاشاره إلى S100A12 في ما يلي باسم "النوع البري".- نقل الخلايا استراح في أنبوب الطرد المركزي 50 mL والطرد المركزي في 350 x ز ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة التحفيز (rpmi 1640 ، 5 ٪ الحرارة المعطلة FCS ، 4 مم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين/ ستربتومايسين) بتركيز 2 × 106 خلايا/مل.
- للتحفيز ، استخدم 24 لوحات تعليق جيدا وأضافه 250 μL من تعليق الخلية في بئر (0.5 x 106 خلايا/بئر). أضافه 50 ميكروغرام/مل بوليميكسين ب إلى الآبار المقصودة ، تليها اما LPS في تركيزات مختلفه (25 ، 50 ، 100 و 200 pg/mL) أو wildtype S100A12 (10 ، 20 ، 40 ، 60 ميكروغرام/مل). وعلاوة علي ذلك ، تطبيق البروتين اما غير المعالجة أو الحرارة المشوهة (99 درجه مئوية ، 10 دقيقه) في تركيزات مختلفه للخلايا.
ملاحظه: المعالجة الحرارية قصيرة الS100A12 البروتين ولكن لديها اقل من اي تاثير علي LPS. - احتضان لوحات ل 4 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. حصاد الخلايا عن طريق نقل تعليق الخلية من كل بئر لأنابيب التفاعل 1.5 mL. أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 10 دقيقه نقل supernatants إلى أنابيب جديده وقياس tnfα الإفراج في التخفيفات المختلفة (علي سبيل المثال ، 1:2 ، 1:5 ، 1:10) مع مجموعه الإنسان TNFΑ ELISA بعد توصيات الشركة المصنعة.
- التحفيز مع S100A12 اوليغمرات
- اعداد والبذور من الخلايا الاحاديه في 24 لوحات تعليق جيدا كما هو موضح أعلاه. تحفيز الخلايا عن طريق أضافه S100A12 اوليغمرات من الخطوة 4-2. في تركيزات المولي مختلفه (125 nM ، 250 nM ، 500 nM ، 1000 nM).
ملاحظه: من أجل المقارنة بين قدرات القلة المختلفة لتحفيز الخلايا الاحاديه ، تم تطبيق قله البويضات للخلايا في تركيزات موليه قابله للمقارنة. - احتضان ل 4 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، حصاد الخلايا وقياس الإفراج عن TNFα في supernatants كما هو موضح أعلاه.
- اعداد والبذور من الخلايا الاحاديه في 24 لوحات تعليق جيدا كما هو موضح أعلاه. تحفيز الخلايا عن طريق أضافه S100A12 اوليغمرات من الخطوة 4-2. في تركيزات المولي مختلفه (125 nM ، 250 nM ، 500 nM ، 1000 nM).
- التحفيز مع S100A12 (النوع الوحشي)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبعد التنقية المسبقة علي عمود AIEX (الشكل 1ا-ج) وما تلاها من الائتلاف الذي يعتمد علي الكالسيوم (الشكل 2ا ، ب) ، تم الحصول علي بروتين نقي للغاية (الشكل 2c). الاضافه إلى ذلك ، كشفت قياسات السمية المعوية أزاله LPS ناجحه. تم قياس المحتوي LPS بعد AIEX في التخفيف 1:10 فوق حد الكشف عن الفحص ، اي فوق 500 الاتحاد الأوروبي/mL. بعد الترشيح الأول من خلال وحده تصفيه 50 ده ، تم تخفيض محتوي LPS إلى 1 الاتحاد الأوروبي/مل. بعد التركيز مع وحده تصفيه 3 كده والترشيح اضافيه من خلال 50 كده ، كان التلوث LPS قياس 0.08 الاتحاد الأوروبي/مل.
كعنصر تحكم إضافي ، تم تحفيز البويضات البشرية مع البروتين الوحشي المنتج (الشكل 3ا ، ب). بوليميكسين B العلاج يلغي TNFα الإفراج عن الخلايا الاحاديه المحفزة LPS ، والتي لا يمكن ملاحظتها مع S100A12. من ناحية أخرى ، والمعالجة الحرارية لكل من LPS و S100A12 يلغي قدره البروتين لتحفيز الخلايا ، في حين ان هذا لا يؤثر علي استجابه الخلوية لتحفيز LPS.
التعرض للبروتين لأيونات مختلفه النتائج في ترتيب مختلف S100A12 القلة (الشكل 4A). الربط الكيميائي يسمح للتقاط المجمعات المحددة مثل الدمامل ، الرباعيات ، والدول التي تمر بمرحله انتقاليه (علي سبيل المثال ، "الزركشة" ، والفرقة في حوالي 30 كده). وللحث علي حدوث تحول واضح في توازن القلة قبل الربط المتقاطع ، تم تطبيق فائض من الأيونات (الشكل 4 ب).
واستخدمت القلة المعزولة في التركيزات المولية المتساوية (الشكل 5ا-ج) لتحفيز البويضات لمقارنه قدرات الإشارات عن طريق الكريات الاحاديه-التحفيز مع هيكاميرميك S100A12 ادي إلى الإفراج عن tnfα وضوحا (الشكل 6 ). ويمكن الكشف عن بقايا الإفراج السايسيسين من الخلايا المحفزة مع رباعيه S100A12 ، في حين ان العلاج مع البروتين ديميريك لا يحفز الإفراج عن TNFα.
الشكل 1: نتائج الفصل اللوني لتبادل انيون. (ا) الكروماتوغرام مع الامتصاص عند 280 نانومتر (a280) والنسبة المئوية للمخزن العازل B (الخط المتقطع). يتم الاشاره إلى كتل أساليب مع A = غسل عينه غير منضم ، B = التدرج الخطي مع المخزن المؤقت التملص (المخزن المؤقت B) ، C = يغسل مع المخزن المؤقت B ، و D = تاخيرمن في المخزن المؤقت ا. (ب) التركيز علي القمم ذات الصلة مع أرقام أنبوب الكسر باللون الأحمر. (ج) تم تحليل كسور مختاره علي 15 ٪ كوماسي الملونة SDS-الصفحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج التفاعل اللوني المسعور. (ا) الكروماتوغرام مع الامتصاص عند 280 نانومتر (a280) والنسبة المئوية للمخزن العازل B (الخط المتقطع). يتم الاشاره إلى كتل أساليب مع A = غسل عينه غير منضم ، B = التملص مع المخزن المؤقت B ، و C = تاخيرمن في المخزن المؤقت ا. (ب) التركيز علي القمم ذات الصلة مع أرقام أنبوب كسر باللون الأحمر. (ج) تحليل الكسور علي 15 ٪ كوماسي الملون SDS-الصفحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تم تحفيز البويضات البشرية الاوليه عند التركيزات المشار اليها. LPS (A) أو S100A12 (النوع البري ، B) تركت دون علاج أو الحرارة-التشبع (99 درجه مئوية ، 10 دقيقه). تم اختبار كلا الشرطين في وجود وغياب بوليميكسين b. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تم ربط البروتين S100A12 مع BS3 بعد الحضانة في العازلة hbs التي تحتوي علي 5 مم Ca2 + وأشار الزنك2 + تركيزات. (ا) زيادة الزنك2 + تركيزات للحث علي ترتيب S100A12 إلى الترامات والمصافي عند الانفصال علي 4 − 20 ٪ كوماسي-الملونة SDS-الصفحة. (ب) النتيجة التمثيلية لمجموعه الأقليات المتداخلة المرتبطة بالظروف المستخدمة للفصل في عمود استبعاد الحجم. وكان S100A12 المتقاطعة في وجود اما 25 مم Ca2 + (حاره 1) أو 25 مم ca2 + و 1 مم الزنك2 + (حاره 2). (S100A12) 2 = dimer; (S100A12) 4 = رباعيه; (S100A12) 6 = hexamer. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تم فصل S100A12 القلة علي عمود حجم الاستبعاد. (ا) الكروماتوجرام من الفصل الفاصل الذي يربط بين الوصلات المتداخلة في حاجز hbs مع 25 ملم من cacl2 و 1 مم zncl2. (ب) كروماتوجرام للفصل رباعيه/dimer في العازلة hbs مع 25 مم cacl2. (ج) مثال لمجموعه الأقليات المجمعة والمركزة بعد الانفصال علي كوماسي-الملونة 4 − 15 ٪ التدرج SDS-PAGE. حاره 1 = [ديمر]; حاره 2 = رباعيه; حاره 3 = [هاكسمر]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحفيز الخلايا الاحاديه مع الS100A12 المنقية من القلة. TNFα-الإفراج بعد 4 h الحضانة تم قياسها من قبل اليسا. تظهر البيانات القيمة المتوسطة من تجربتين مستقلتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| حجم السرير (CV) | 75 مل |
| رصد | الامتصاص في 280 nM |
| ماكس الضغط | 3 بار |
| المخزن المؤقت للعمود A | 20 مم تريس-HCl ، 1 مم أدتا ، 1 مم EGTA ، pH 8.5 |
| المخزن المؤقت للعمود B | 20 مم تريس-HCl ، 1 مم أدتا ، 1 مم EGTA ، 1 م NaCl ، pH 8.5 |
| حجم العينة | متغير |
| معدل التدفق | 1 − 2 مل/دقيقه |
| درجه الحراره | 4 درجه مئوية |
الجدول 1: معلومات مفصله عن البارامترات التطبيقية للكروات اللوني لتبادل انيون.
| كتله | حجم | المخزن المؤقت | منفذ |
| تاخيرمن | 1 − 2 مجلدات الاعمده (CVs) | علي | النفايات |
| عينه تحميل | n/a | علي | النفايات |
| يغسل عينه غير منضم | 1 سيره ذاتية | علي | منفذ كبير الحجم |
| التدرج – الامتصاص | 0 − 100% العازلة B في 1 CV | الف إلى باء | جامع الكسور |
| يغسل-العازلة B | 1 سيره ذاتية | ب | النفايات |
| أعاده التاخيرمن | 2 سيره ذاتية | علي | النفايات |
الجدول 2: معلومات مفصله عن الطريقة المستعملة للكروات اللوني لتبادل انيون.
| حجم السرير (CV) | 125 مل |
| رصد | الامتصاص في 280 nM |
| ماكس الضغط | 4 بار |
| المخزن المؤقت للعمود A | 20 ملم تريس ، 140 mM كلوريد الصوديوم ، 25 مم CaCl2 ، pH 7.5 |
| المخزن المؤقت للعمود B | 20 مم تريس ، 140 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM أدتا ، pH 7.5 |
| حجم العينة | متغير |
| معدل التدفق | 1 − 2 مل/دقيقه |
| درجه الحراره | 4 درجه مئوية |
الجدول 3: معلومات مفصله عن البارامترات التطبيقية للكروماتوغرافي اللوني للتفاعل المائي.
| كتله | حجم | المخزن المؤقت | منفذ |
| تاخيرمن | 1 − 2 مجلدات الاعمده (CVs) | علي | النفايات |
| عينه تحميل | n/a | علي | النفايات |
| يغسل عينه غير منضم | 1 − 2 سيره ذاتية | علي | منفذ كبير الحجم |
| شطف | 100% المخزن المؤقت B | ب | جامع الكسور |
| يغسل-العازلة B | 1 سيره ذاتية | ب | النفايات |
| أعاده التاخيرمن | 2 سيره ذاتية | علي | النفايات |
الجدول 4: معلومات مفصله عن الطريقة المستخدمة في التفاعل اللوني المسعور.
| حجم السرير (CV) | 320 مل |
| رصد | الامتصاص في 280 نانومتر |
| ماكس الضغط | 3 بار |
| المخزن المؤقت للعمود A | 20 مم Hepes ، 140 mM NaCl ، pH 7.2 |
| حجم العينة | حتى 13 مل |
| معدل التدفق | 1 − 1.5 مل/دقيقه |
| درجه الحراره | 12 − 15 درجه مئوية |
الجدول 5: معلومات مفصله عن البارامترات التطبيقية للكروماتوغرافي اللوني للاستبعاد الحجم.
الجدول التكميلي 1: اعداد المخازن المؤقتة وحلول المخزون. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف خاليه من العلامات البكتيرية التعبير عن S100A12 الإنسان وتنقيتها ، فضلا عن الانفصال في مختلف الأيونات الناجمة عن الايونيه لتحفيز الخلايا المناعية. بالمقارنة مع المؤلفات المنشورة علي S100A12 تنقيه البروتين8،23،24، واستخدام عاليه cacl2 (25 ملم) في اللوني التفاعل مسعور هو لمعرفتنا فريدة من نوعها. العديد من البروتوكولات تطبيق تركيزات من 1 إلى 5 ملم لا تنتج البروتين النقي ، ومع ذلك لاحظنا عده مرات اعلي الغلة اتباع نهجنا باستخدام 25 مم CaCl2 بدلا من ذلك. وهذا يمكن تفسيره من قبل التسلسل الهرمي للتفاعل البروتين مع ماده العمود: S100A12 يمكن ربط مباشره إلى ماده العمود ولكن الزائدة من Ca2 + قد تسهل أيضا ملزمه غير المباشرة من S100A12 إلى البروتين العمود المرتبطة بالفعل 8. التالي ، ارتفاع Ca2 + تركيزات قد تكبير السطح المتاحة لتنقيه S100A12. الشطف (باستخدام التدرج الخطي) من S100A12 من الائتلاف باعتبارها واحده في وقت مبكر (ملزمه بشكل غير مباشر S100A12) وواحده في وقت متاخر جدا الذروة (عمود المواد البروتين ملزمه) قد تدعم هذه المضاربة (البيانات لم تظهر).
لإنتاج S100A12 المؤتلف (وكذلك البروتينات الأخرى) في غله عاليه وتكاليف يمكن التحكم فيها ، والتعبير عن البروتين في كولاي لا يزال هو الأسلوب المفضل. ومع ذلك ، لا يزال التلوث لا مفر منه مع السموم الجرثومية البكتيرية مشكله ، عندما يتم تحديد البروتينات لتجارب ثقافة الخلية ، وخاصه في الدراسات التي تنطوي علي الخلايا المناعية الفطرية. لتجربتنا ، حتى البروتينات المتاحة تجاريا معلنه صراحة لاستخدام ثقافة الخلية يمكن ان تحتوي علي اندوتوكسين تلوث تصل إلى 1 الاتحاد الأوروبي/ميكروغرام البروتين ، والتي يمكن ان تشوه بشكل كبير المقايسات. ولذلك ، فان الازاله الكاملة للذيفان الفطري إلزاميه. وتتراوح الجزيئات الاحاديه الكلور في المحلول من الأوزان الجزيئية من 10 إلى 20 ده ، ولكنها يمكن ان تشكل المذيلات والهياكل ذات الأوزان الجزيئية العالية. التشكيل من بني كبيره جدا, مثلا, يروج كليا أيونات [بيوتكافؤ]21,25.
وفقا لبروتوكول لدينا ، ونحن نتحقق من إنتاج خاليه من السموم من S100A12 البروتين عن طريق الجمع بين القياسات العالية الحساسية اندوتوكسين مع اختبارات التحفيز الأحادي. ونحن نعتبر هذا الجمع ذات مغزى بشكل خاص باعتبارها) منخفضه المستوي التلوث اندوتوكسين قد يكون من الصعب تقييم اعتمادا علي حساسية الفحص و ب) استخدام بوليميكسين ب كما مثبط lps علي الخلايا الاحاديه قد يؤدي إلى صعوبة في تفسير البيانات المستحقة إلى [بولميكسين] حصريه [ب] تاثيرات علي خلايا26,27. وذكرت polymyxin ب فضلا عن غيرها من الببتيدات موجب لربط lps عبر الدهون مشحونة سلبا28. كما المذيبات السطح المكشوف من S100A12 يحتوي أيضا علي بقع كبيره مشحونة سلبا الحد المرصود من tnfα-الإفراج عن S100A12-حفزت الخلايا البشرية في وجود بوليميكسين ب (الشكل 3b) قد يكون بسبب) الربط المباشر غير محدده من بوليميكسين ب إلى S100A12 و/أو ب) الآثار المباشرة من بوليميكسين ب علي الخلايا المحفزة26,27. بسبب القيود المعروفة لكل من الكشف عن التلوث اندوتوكسين منخفض المستوي ، فضلا عن تاثيرات بوليميكسين بي غير محدده ، يحتوي بروتوكولنا كذلك علي خطوه للحرارة للتمييز بوضوح بين LPS-والبروتين بوساطة TLR4-الإشارات.
استخدام S100A12 خاليه من LPS لتوليد وتنقيه المحددة التي يسببها الأيونات اوليمرات أمر بالغ الاهميه وينبغي إيلاء اهتمام إضافي لتنقيه اللاحقة لتجنب في نهاية المطاف أعاده إدخال اندوتوكسين عن طريق المخازن المؤقتة أو ماده العمود التالي مزيد من البروتين المطالبة LPS-استنزاف عبر راتنجات أزاله اندوتوكسين.
ويمكن تقييم اهميه قله الأقليات للوظيفة البيولوجية للبروتينات بوسائل مختلفه. في حاله S100A12 ، استخدمنا صدي البلازما السطحية وكذلك التبادلات المستهدفة من الأحماض الامينيه في مواقع ملزمه الأيونات و-لتحديد الأكثر دقه البروتين المعقدة قادره علي ربط واشاره من خلال TLR4-استخدمنا الكيميائية تشابك من Ca2 +/الزنك2 + -نابض المؤتلف S100A1216. الكيميائية تشابك من S100A12 تحت ظروف أيونيه مختلفه المفاجئة تجمد حاله لحظه بما في ذلك عده اشكال القلة التي هي في مرحله انتقاليه. من تجارب المعايرة الايونيه ، قمنا بتعريف الشروط التي يمكن بموجبها تحديد الديميريك أو رباعيه السن أو سداسي الكلور باعتبارها الاقليه المهيمنة16. الاضافه إلى ذلك ، أظهرت التجارب السابقة ان وجود فائض من الأيونات مفيد للمقارنة ومستقره العابرة وتنقيه اللاحقة ، علي الرغم من ان القلة يمكن أيضا ان يكون مستحثا في تركيزات أيون اقل بكثير. ومع ذلك ، فان تنقيه هذه القلة بواسطة الفصل اللوني لاستبعاد الحجم ينتج عنه انفصال جيد ولكن ليس مطلقا. ومع ذلك ، فان الإثراء الانتقائي لقله المواليد يسمح باجراء تحليلات موثوقه في المصب.
وباختصار ، يوفر هذا البروتوكول طريقه لتنقيه الS100A12 البشرية الخالية من LPS أو بروتينات ربط الكالسيوم ذات الصلة. لإصلاح التغيرات المرتبطة الناجمة عن الأيونات ، والربط الكيميائي العابر والانفصال المعقد اللاحق بواسطة الفصل اللوني للاستبعاد الحجم هو أداه مفيده لفهم اهميه قله البروتين للعمليات البيولوجية المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكانت هذه الدراسة مدعومة بمنح من برنامج البحوث الطبية المبتكرة داخل كليه الطب بجامعه مونستر (KE121201 إلى سي كي) ومؤسسه البحوث المانيه (DFG ، Fo354/3-1 إلى D.F).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
