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Immunology and Infection

人类S100A12及其用于免疫细胞刺激的Ion诱导寡聚物的纯化

Published: September 29, 2019 doi: 10.3791/60065
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

Summary

该协议描述了一种用于重组无标记标记的钙结合蛋白S100A12及其用于人类单核细胞刺激测定的由水因诱导的寡聚物的纯化方法。

Abstract

在此协议中，我们描述了一种从大肠杆菌培养中纯化人体钙结合蛋白S100A12及其由水因诱导的寡聚物以进行免疫细胞刺激的方法。该协议基于两步色谱策略，其中包括在一个海龙交换色谱柱上的蛋白质预纯化，以及随后对疏水性相互作用柱的抛光步骤。该策略以可管理的成本生产高纯度和产量的 S100A12 蛋白质。对于免疫细胞的功能检测，最终残留内毒素污染需要仔细监测和进一步清洁步骤，以获得无内毒素蛋白质。大多数内毒素污染可以通过电一孔交换色谱法排除。为了消耗残留污染，此协议描述了使用离心过滤器的去除步骤。根据可用的抗子强体 S100A12 可以排列成不同的同源体。为了研究结构和功能之间的关系，本方案进一步描述了S100A12蛋白的电处理，然后化学交联以稳定S100A12寡聚物及其随后通过尺寸排除分离相 色 谱 法。最后，我们描述了一种基于细胞的测定，它证实了纯化蛋白的生物活性，并证实了LPS的无制备。

Introduction

S100A12是一种钙结合蛋白，主要由人类粒细胞产生。蛋白质在（全身）炎症期间过度表达，其血清水平，特别是在（自动）炎症疾病，如全身性青少年特发性关节炎（sJIA），家族地中海热（FMF）或川崎病（KD）可以通知疾病活动和对治疗的反应。根据模式识别受体 （PRRs），如收费受体 （TPR），先天免疫系统可以通过病原体相关分子模式 （PAMPs）（如脂多糖 （LPS） 或损害相关分子模式 （DamPs;也称为"报警器"）。DAM是内源性分子，如细胞蛋白、脂质或核酸1。DAMP 功能很好地描述了钙素蛋白家族 S100A8/A9 和 S100A122的成员，据报告，它们还作为二价金属-氢合抗菌肽3、4、 5，6.根据可用的抗气强度 S100A12 可以像 S100 系列的其他成员一样，排列成不同的同源体，直到最近，S100A12-寡头化对 PRR 相互作用（尤其是 TLR4）的影响还不得而知。

蛋白质的单体形式（92个氨基酸，10.2 kDa）由两个EF-手螺旋环螺旋结构组成，通过柔性连结器连接。C-终端 EF 手包含经典的 Ca2+绑定主题，而N端 EF 手则具有 S100 蛋白质特异性扩展环路结构（"伪 EF-手"），并揭示了减少的 Ca2+- 亲和力。S100A12 结合的 Ca2+可诱导蛋白质的 C-终点体发生重大构象变化，从而导致每个单体上接触疏水性斑块，并形成二分界面。因此，在生理条件下，由S100A12形成的最小四元结构是一种非共价二元结构（约21 kDa），其中单个单体处于反平行方向。当被安排为二聚体时，S100A12被报告给隔离Zn2+以及其他二价金属离子，例如，Cu2+具有高亲和力7。这些离子在S100A12二聚体界面由一个亚单位的氨基酸H15和D25以及抗平行的其他亚单元8、9、10的H89协调。虽然早期的研究表明，Zn2+负载 S100A12 可能诱导蛋白质的组织到同质四元体 （44 kDa） 和导致增加 Ca2+- 亲和力11，12，最近的金属滴定研究6建议Ca2+结合S100A12，以增加蛋白质对Zn2+的亲和力。一旦 S100A12 EF 指针被 Ca2+完全占用，则额外的 Ca2+被认为在二聚物之间结合，触发六项机形成（约 63 kDa）。六甲四聚体结构的结构与四合体结构明显不同。建议四联体接口被中断，产生新的二聚体-二聚体接口，有利于六项机形成10。S100A12几乎完全由人类粒细胞表达，约占所有细胞蛋白的5%。在其DAMP功能S100A12在历史上被描述为高级糖化最终产品（RAGE）的多配体受体的激动剂，然后称为细胞外新发现的RAGE结合蛋白（EN-RAGE）14。尽管我们早先报告生化S100A12对RAGE和TLR415结合，但我们最近证明人类单核细胞以TLR4依赖方式对S100A12刺激作出反应。这需要将S100A12排列到其Ca2+/Zn2+-诱导的六甲体结构16中。

在这里，我们描述了重组人类S100A12及其免疫细胞刺激的孔诱导寡聚物的纯化程序16，17。这是基于两步色谱策略，最初包括一个电一体交换柱，以分离和浓缩蛋白质，并去除散装污染（例如，内毒素/脂多糖）18。电一交换色谱树脂根据不同的净表面电荷分离蛋白质。对于酸性蛋白质，如S100A12（等电点5.81），pH值为8.5的缓冲系统和强的黄极交换树脂可产生良好的分离。结合蛋白用高盐缓冲梯度洗脱。随着洗脱缓冲液中离子强度负离子的增加，与树脂表面的蛋白质竞争。蛋白质根据其净电荷单独洗出，因此，本文描述的缓冲液允许分离和浓缩过度表达的S100A12蛋白。由于脂多糖中的带负电荷，这些分子还与阴极交换树脂结合。然而，其较高的净电荷导致在应用高盐梯度的后期洗脱。为抛光目的介绍了纯化程序的第二步。这利用S100A12的钙结合能力，并去除疏水相互作用柱上剩余的杂质。S100A12 的钙结合会导致形成变化和在蛋白质表面接触疏水性斑块。在这种情况下，S100A12 与树脂的疏水表面相互作用。当EDTA的钙合合后，这种相互作用被逆转。在离子（尤其是钙和锌）存在的情况下，S100A12 可排列成同质寡聚物。为了研究不同寡聚物的结构-功能关系，我们用化学交联器稳定了二聚体、四甲和六甲重孔S100A12，并在尺寸排除色谱柱上分离了复合物。最后，对纯化蛋白及其电子诱导寡聚物的功能和生物活性进行了分析，对S100A12和LPS刺激的单核细胞的细胞因子释放进行了比较。

到目前为止，已经描述了各种净化S100A12的方法。例如，Jackson等人19日通过一个电子交换柱和随后的尺寸排除色谱，发表了一种纯化协议。在大小排除列上纯化抛光可产生良好的效果，但由于加载量有限等原因，可伸缩性不够灵活。由Kiss等人20号发表的另一种方法，将通过Ni2+亲和柱纯化标记蛋白描述为第一步，然后是酶裂解，以去除标记和进一步纯化步骤。与上述研究19、20相反，本协议中描述的所产生的蛋白质被确定为免疫细胞实验。因此，细菌培养的残留内毒素污染是一个挑战。虽然到目前为止已经描述了不同的内毒素去除方法，但没有统一的方法对任何给定的蛋白质溶液21，22同样有效。

总之，我们的协议将细菌系统中无标签表达的优点与高效的内毒素去除和纯蛋白的高产量相结合。

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Protocol

注：有关准备缓冲液和库存解决方案，请参阅补充表 1。

1.大肠杆菌中的蛋白质表达

  1. 克隆
    1. 将无标记的人类S100A12（NCBI参考序列：NP_005612.1）克隆成细菌表达载体pET11b。为了表达蛋白质，将结构转换为大肠杆菌BL21（DE3）。
  2. 文化
    1. 通过在 14 mL 圆底管中接种 1mL 生长培养基（LB 溴与 100 μg/mL 阿霉素）中的单个菌落，制备起动机培养体。在 37°C 下孵育过夜，在 220 rpm 下摇动。在 2 L Erlenmayer 烧瓶中将 2⁄4 mL 的隔夜培养剂转移到 400 mL 的生长介质中，并在 37°C 下孵育培养基，在 220 rpm 转速下摇动。
      注：主要培养基的初始密度应为600nm（OD600）=0.1的光学密度。
    2. 在生长过程中监控 OD600。在OD600 = 0.5_0.6时，通过加入1M异丙基-D-硫拉多霉素（IPTG）至1 mM的最终浓度诱导蛋白质表达。在 37°C 和 220 rpm 下孵育，额外孵育 4 小时。
      注：通常，在 37°C 下，1.5~2.5 小时后，将到达 0.6 的 OD600。
    3. 通过在40 mL的去离子水中溶解50 mM Tris、50 mM NaCl和1 mM乙烯二甲酸（EDTA）来制备50 mL声波缓冲液。使用 HCl 将 pHH 调节到 8.0，并构成高达 50 mL 的 pH。加入蛋白酶抑制剂（每50mL溶液1片），并将缓冲液平衡至4°C。
    4. 将细菌培养物转移到合适的离心机瓶中，在4°C下以3，200 x g收获细胞30分钟。丢弃上清液，在25 mL的冰冷的声波缓冲液中重新悬浮颗粒。从此以后，把细胞放在冰上。
      注：悬浮细胞可短期储存在-20°C，长期储存在-80°C。
  3. 声波/分化
    1. 在冰上对细胞进行6个周期的30s的声波。在每个周期后，将细胞休息30-60s，以防止细胞过热。
    2. 将电池悬浮液转移到预冷却的50 mL高速离心管中，并在15，000 x g的固定角度转子中离心30分钟，在4°C下。将含有可溶性细胞蛋白的透明溶酶放入新鲜的50 mL管中，并丢弃颗粒。

2. 蛋白质纯化

  1. Anion 交换色谱
    1. 透析
      1. 通过在去离子水中溶解 20 mM Tris、1 mM EDTA 和 1 mM 乙二醇-二聚糖（2-氨基乙二醇-乙二醇）-N、N、N'-四乙酸 （EGTA）中的乙烷交换色谱 （EGTA），将 pHH 调节到 8.5。用于透析准备 2 x 5 L 和色谱 2x 1 L AIEX 缓冲液 A。
        注：透析量应约为样品体积的100倍。所有用于色谱的缓冲液都应过滤（0.45 μm 或更小）和脱气（例如，通过超声波浴或真空脱气）。
      2. 将透析管（分子量切断 [MWCO]： 3.5 kDa）切成适当的长度，并增加空气空间，以确保旋转搅拌棒上方的样品浮力。
        注：甘油可保留膜，在使用前必须去除。
      3. 为了降低步骤 1.3.2 中清除的蛋白质溶液的粘度，使用 25 mL 的 AIEX 缓冲液 A 稀释溶液，以便随后应用于色谱柱。将第一个闭合连接到管上，将样品装载到膜中，并将第二个闭合从油管的顶端连接至少 1 厘米。
      4. 将带有AIEX缓冲液A的5L容器放在搅拌板上，加入搅拌棒和充满蛋白质溶液的膜。通过避免对旋转搅拌棒的干扰，调整速度以旋转样品。在4°C下透析12~24小时，然后用新的预冷却制剂代替透析液缓冲液（AIEX缓冲液A），并持续至少4小时。将透析蛋白溶液转移到 50 mL 管中，并通过 0.45 μm 过滤单元进行过滤。
        注：可存储。
    2. 相 色 谱 法
    3. 启动液相色谱系统 （FPLC）进行常规维护，连接柱缓冲液 A A 和 AIEX B（AIEX 缓冲液 A，带 1 M NaCl）和包含柱的阴孔交换树脂。有关一般色谱参数，请参阅表 1。
      注：缓冲器、柱和FPLC设备在开始运行前应平衡到相同的温度（参见表1、表2、表3、表4和表5中的色谱参数）。
    4. 使用 AIEX 缓冲液 A 对列进行平衡，随后将样品加载到柱上，并将蛋白质的线性梯度从 0% 到 100% 高盐缓冲液 （AIEX B） 排空。有关详细方法协议，请参阅表 2。
    5. 在洗脱过程中收集2 mL分数，并在库马西染色的15%硫酸二甲酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分析每个馏分的10 μL。将含有S100A12蛋白的分数汇集用于透析。
      注：S100A12的分子量为10，575 Da。
  2. 钙依赖性疏水性-相互作用色谱（HIC）
    1. 透析
      1. 按照第 2.1.1 节中所述的步骤，对 20 mM Tris、140 mM NaCl、pH 7.5 进行蛋白质溶液的透析。
    2. 相 色 谱 法
      1. 通过在去离子水中溶解 20 mM Tris、140 mM NaCl 和 25 mM CaCl2，制备 1 L 色谱缓冲液 HIC A，并将 pH 度调整到 7.5。对于 HIC 缓冲液 B，溶解 20 mM Tris、140 mM NaCl 和 50 mM EDTA。将 pH 调整到 7.0，并过滤和消除缓冲液的气体。将CaCl2添加到样品中，最终浓度为25 mM，并通过0.45 μm过滤。 将HIC缓冲液和样品平衡到4°C（柱温度）。
      2. 启动液相色谱系统，进行一般维护，连接柱缓冲器 HIC A 和 B 以及柱。有关进一步的色谱参数，请参阅表 3。
      3. 平衡柱，加载样品并扩展"清洗未绑定样品"块，直到 UV 信号再次达到基线水平。然后开始洗脱含有缓冲液（EDTA）的钙合合剂。有关详细方法协议，请参阅表 4。
        注：以前的实验表明，过量的钙似乎有利于将S100A12与色谱树脂结合。
      4. 收集 2 mL 的峰值分数，并在库马西染色的 15% SDS-PAGE 上分析每个分数的 10 μL。池纯 S100A12 分数和对海带缓冲盐水的透析 （HBS; 20 mM 海带， 140 mM NaCl， pH 7.0）， 如第 2.1.1 节所述。
        注：单体S100A12的消光系数为2980M-1 cm-1。

3. 内毒素的检测与去除

  1. 内毒素的检测
    1. 要确定内毒素污染，请测量步骤 2.2.2.4 中稀释蛋白的浓度。（例如，在HBS中1：10和1：100），使用基于酶的免疫吸附剂测定（ELISA），荧光内毒素检测测定（材料表）。按照制造商的协议执行此测定。
      注：使用溶解在超纯脱离子水中的新鲜制备的HBS溶液，以避免缓冲液对（新的）内毒素污染。
  2. 内毒素的去除和蛋白质的浓度
    1. 将 15 mL 样品装载到 50 kDa 离心滤芯单元上，并在 3，200 x g和 10 °C 下将离心机装载约 10 分钟。将流量转移到新鲜容器（冰上），并根据需要经常重新加注和离心机 50 kDa 滤管。用HBS清洗过滤膜两次，在每一步后恢复尽可能多的蛋白质。
    2. 使用 3 kDa 离心滤波器浓缩含 S100A12 的流量，直到体积减少到初始载荷量的五分之一（在 3，200 x g时离心，10°C 约 30 分钟）。根据需要经常重新加注过滤器，冲洗膜，每次重新加注后将浓缩溶液转移到新管中。丢弃流通过。如上所述，通过 50 kDa 再次过滤。
      注：在此过程中，蛋白质的流失显著（高达50%），但剩余的蛋白质制剂完全耗尽了LPS。这种方法产生约10-15毫克蛋白质从400mL培养。
    3. 使用不含内毒素的HBS将蛋白质溶液调整至1mg/mL，并测量步骤3.1.1所述的LPS含量。如果蛋白质溶液仍未测试为无LPS（<0.1 EU/mL），则使用内毒素去除树脂消除残留污染。
      注：蛋白质浓度为1mg/mL，0.1欧/mL LPS的污染等于大约0.01皮克LPS/μg蛋白质。

4. 化学交联和寡聚物分离

  1. 化学交联
    1. 在超纯脱离子水（材料表）中制备1M CaCl2和100 mM ZnCl2的超纯（无内毒素）库存溶液。下一步，使用此新制作的缓冲区。
    2. 在室温 （RT） 下孵育 10 mL 纯化内毒素 S100A12（HBS 中浓度为 1 mg/mL）30 分钟，其中 25 mM CaCl2用于二分体/四分体，或 25 mM CaCl2和 1 mM ZnCl2用于六分体/四分之一体 S100A12齐聚 物。
    3. 在使用前直接溶解500 μL无内毒素水中的8mg BS3，制备交联剂（10 mL的环联剂10 ml的环状蛋白溶液等于1.4 mM的最终浓度）。通过移液混合和样品混合，在RT.Quench反应中再孵化30分钟，在50mM的最终浓度中加入1M Tris-HCl，pH 7.5，并过滤通过0.45 μm。
  2. 尺寸排除色谱
    1. 将交联样品平衡到12~15°C（柱温），并启动液相色谱系统，进行一般维护。连接列缓冲区 （HBS） 和大小排除列。有关详细信息，请参阅表 5。
    2. 在运行过程中平衡 HBS 中的柱，加载采样并收集峰值分数（1⁄2 mL）。在 4-20% 梯度 SDS-PAGE 和池分数上分析这些分数，这些分数具有所需蛋白质复合物的主要波段。
      注：NHS 酯试剂（如 BS3）在水溶液中的水解在280nm处产生强吸收性。无界交联剂（分子量：572克/摩尔）在运行结束时洗脱，并产生强峰。
    3. 使用具有 10 kDa（二聚体）、30 kDa（四联体）或 50 kDa（六聚体）的 MWCO 的离心滤波器单元来浓缩解决方案。确定第 3.1 节中所述的内毒素污染。如有必要，根据制造商的建议（材料表），用内毒素去除树脂去除剩余的LPS。

5. 单核细胞的功能测试

  1. 单核细胞的制备
    1. 使用磁珠分离套件（材料表），通过密度梯度离心和随后的单核细胞富集，从人类乳衣中分离单核细胞。
      注：该协议将产生大约5×7 x 107个单核细胞（一个布皮涂层），纯度为83-95%。由于细胞的数量，但细胞的响应性也在很大程度上取决于捐赠者，因此可能需要扩大协议（取决于所需的细胞计数）。
    2. 对于密度离心，将分离溶液（密度 = 1.077 g/mL）与RT平衡，并将20 mL转移到50 mL离心管中（每布2管）。用汉克的缓冲盐溶液（HBSS）将人类乳衣的血液稀释至60 mL的总体积，并在分离介质顶部小心地稀释该混合物的30 mL层。在 RT 下以 550 x g离心 35 分钟，禁用离心制动器。
    3. 离心后，单核外周血细胞（PBMC）直接位于分离介质的顶部。将这些细胞转移到一个新的50 mL离心管中，用HBSS组成50 mL，在170 x g下离心10分钟。
    4. 将管填充至50 mL，以290 x g离心10分钟。再次吸气上清液，重新悬浮在HBSS（50 mL）中的细胞，以170 x g离心10分钟。计数细胞并将其重新悬浮在细胞分离缓冲液中（材料表]/c9+） 至浓度为 5 x 107细胞/mL。
      注：磷酸盐缓冲盐水（PBS）可用于洗涤细胞，而不是HBSS。
    5. 对于从 PBMC 分离的单核细胞，请使用磁性负细胞隔离套件并遵循制造商的协议。在单核细胞培养基（RPMI 1640，15%热灭活胎儿小牛血清[FCS]，4 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素/链霉素）中计数和重新悬浮至2 x 106细胞/mL浓度。
    6. 培养单核细胞，涂覆培养皿（例如100毫米），用疏水性、透气膜，适合悬浮细胞（材料表）。使用紫外线对板进行消毒约30分钟。将细胞转移到这些培养板，让细胞在37°C和5%CO2下过夜休息。
      注：每个涂层盘使用15~25 mL的细胞悬浮液。
  2. 单细胞刺激
    1. 使用 S100A12 刺激（野生型）
      注：为了区分未经处理的S100A12（2.2.2节的终端产品）与交联蛋白，以下S100A12称为"野生型"。
      1. 将休息的细胞转移到50 mL离心管中，以350 x g离心管和离心机10分钟。 在刺激培养基中吸气和重新悬浮细胞颗粒（RPMI 1640，5%热灭活FCS，4 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素/链霉素）浓度为2 x 106细胞/mL。
      2. 刺激时，使用24孔悬架板，每孔加入250μL细胞悬浮液（0.5 x 106细胞/孔）。将50微克/mL多霉毒素B加入预定的井中，然后加入不同浓度（25、50、100和200皮克/mL）的LPS或野生型S100A12（10、20、40、60微克/mL）。此外，将未经处理或热变性的蛋白质（99°C，10分钟）以不同浓度应用于细胞。
        注：短热处理使S100A12蛋白变性，但对LPS的影响较小。
      3. 在37°C和5%CO2下孵育板4小时。通过将每口井的细胞悬浮液转移到1.5 mL反应管，收获细胞。以500 x g离心10分钟，将上生子转移到新鲜管中，并按照制造商的建议，使用人TNF® ELISA试剂盒测量不同稀释剂（例如1：2、1：5、1：10）中的TNF®释放。
    2. 使用 S100A12 寡聚物进行刺激
      1. 如上文所述，在 24 个井悬板中准备并播种单核细胞。从步骤 4.2.3 中添加 S100A12 寡聚物来刺激细胞。在不同的摩尔浓度（125 nM， 250 nM， 500 nM， 1000 nM） 中。
        注：为了比较不同寡聚物刺激单核细胞的能力，寡聚物被应用到具有可比摩尔浓度的细胞上。
      2. 在37°C和5%CO2下孵育4小时，收获细胞，并测量上述上生子中的TNF®释放。

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Representative Results

在AIEX列（图1A-C）和随后的钙依赖性HIC（图2A，B）上预纯后，获得高纯蛋白（图2C）。此外，内毒素的测量显示LPS去除成功。AIEX 之后的 LPS 含量在高于测定检测限值（即高于 500 EU/mL）的 1：10 稀释度下测量。通过 50 kDa 过滤单元进行第一次过滤后，LPS 含量降至 1 欧/mL。在使用 3 kDa 滤光片和通过 50 kDa 进行额外过滤后，测得的 LPS 污染为 0.08 欧/升。

作为额外的控制，人类单核细胞被刺激与产生的野生型蛋白（图3A，B）。多霉毒素B治疗从LPS刺激的单核细胞中废除TNF®释放，S100A12无法观察到。另一方面，LPS和S100A12的热处理会消除蛋白质刺激细胞的能力，而这并不影响细胞对LPS刺激的反应。

蛋白质暴露于不同的离子导致不同S100A12寡聚物的排列（图4A）。化学交联允许捕获定义的复合物，如二聚体、四联体和六重体以及过渡状态（例如，"修剪器"，带在大约 30 kDa 处）。为了在交联之前诱导寡聚物平衡的明显变化，施加了过量的离子（图4B）。

然后，将等摩尔浓度的分离寡聚物（图5A-C）用于单细胞刺激，通过PRR比较信号能力。 与六甲体S100A12的单细胞刺激导致明显的TNF®释放（图6).从四聚体S100A12刺激的细胞中检测到残余细胞因子释放，而用二分蛋白治疗不会诱导TNF®释放。

Figure 1
图1：网相交换色谱的结果。（A） 具有280nm（A280）的吸光度和洗脱缓冲液B（虚线）百分比的色谱图。方法块用A = 洗涤未结合样品，B = 带洗脱液位（缓冲液B）的线性梯度表示，C = 用缓冲液B洗掉，D =缓冲液A中重新平衡。（C） 在 15% 库姆马西染色的 SDS-PAGE 上对选定的分数进行了分析.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：疏水相互作用色谱的结果。（A） 具有280nm（A280）的吸光度和洗脱缓冲液B（虚线）百分比的色谱图。方法块用A = 洗涤未结合样品，B = 洗脱与缓冲器B，C = 在缓冲器A重新平衡. （B） 聚焦于具有红色分数管数的相关峰。（C） 分析 15% 库姆马西彩色 SDS-PAGE 的分数。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：在指示浓度下刺激原发性人单核细胞。LPS （A） 或 S100A12 （野生型， B） 未经处理或热变性 （99 °C， 10 分钟）。这两种情况都测试了在存在和不存在多霉毒素B。请点击这里查看这个数字的较大版本。

Figure 4
图4：S100A12蛋白在含有5 mM Ca2+的HBS缓冲液中孵育后与BS3交联，并指示Zn2+浓度。（A） 增加锌2+浓度，在4~20%的Coomassie染色SDS-PAGE上分离后，将S100A12的浓度诱导成四联体和六合体。（B） 交叉连接寡聚物的代表性结果，其条件用于在大小排除列上分离。S100A12 在存在 25 mM Ca2+（通道 1） 或 25 mM Ca2+和 1 mM Zn2+（通道 2）的情况下是交联的。（S100A12）2 = 二分器;（S100A12）4 = 四元体;（S100A12）6 = 六塞默。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：S100A12寡聚物在大小排除列上分离。（A） 在 HBS 缓冲液中交联 25 mM CaCl 2 和 1 mM ZnCl2后，六项体/四联体分离的色谱图。（B） 在 HBS 缓冲液中用于四联体/二聚体分离的色谱图，带 25 mM CaCl2。（C） 在库马西染色的 4-15% 梯度 SDS-PAGE 上分离后的集中和浓缩寡聚物示例。车道 1 = 二分器;车道 2 = 四元体;车道 3 = 六甲机。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：用纯化S100A12寡聚物刺激单核细胞。ELISA对4小时孵育后的TNF®释放进行了量化。数据显示了两个独立实验的平均值。请点击此处查看此图的较大版本。

床容量 （CV） 75 mL
监控 280 nM 时吸收
最大压力 3 巴
列缓冲区 A 20 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， 1 mM EGTA， pH 8.5
列缓冲区 B 20 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， 1 mM EGTA， 1 M NaCl， pH 8.5
样本体积 变量
流量 1⁄2 mL/分钟
温度 4 °C

表1：关于电一孔交换色谱应用参数的详细信息。

块 体积 缓冲区 出口
平衡 1⁄2 列卷 （CV） A 浪费
样本负载 不适用 A 浪费
洗掉未绑定的样品 1 CV A 大容量插座
渐变_洗脱 1 CV 中的 0±100% 缓冲区 B A 到 B 分数收集器
冲洗 -缓冲 B 1 CV B 浪费
重新平衡 2 辆简历 A 浪费

表2：关于使用电子网交换色谱法的详细信息。

床容量 （CV） 125 mL
监控 280 nM 时吸收
最大压力 4 巴
列缓冲区 A 20 mM Tris， 140 mM NaCl， 25 mM CaCl2， pH 7.5
列缓冲区 B 20 mM Tris， 140 mM NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.5
样本体积 变量
流量 1⁄2 mL/分钟
温度 4 °C

表3：关于疏水-相互作用色谱应用参数的详细信息。

块 体积 缓冲区 出口
平衡 1⁄2 列卷 （CV） A 浪费
样本负载 不适用 A 浪费
洗掉未绑定的样品 1⁄2 CV A 大容量插座
洗 脱 100 % 缓冲区 B B 分数收集器
冲洗 -缓冲 B 1 CV B 浪费
重新平衡 2 辆简历 A 浪费

表4：关于疏水-相互作用色谱法使用方法的详细信息。

床容量 （CV） 320 mL
监控 280 nm 时吸收
最大压力 3 巴
列缓冲区 A 20 mM 海平， 140 mM NaCl， pH 7.2
样本体积 高达 13 mL
流量 1~1.5升/分钟
温度 12~15 °C

表5：尺寸排除色谱应用参数的详细信息。

补充表1：缓冲液和库存溶液的准备。请点击此处下载此文件。

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Discussion

在此协议中，我们描述了人类S100A12的无标记细菌表达及其纯化以及分离成不同的由水因诱导的寡聚物，用于免疫细胞刺激。与发表论文的S100A12蛋白质纯化8，23，24，使用高CaCl2（25 mM）在疏水-相互作用色谱是对我们的知识的独特。应用浓度为 1 到 5 mM 的几种方案确实会产生纯蛋白质，但我们观察到，使用 25 mM CaCl2的方法，其产量提高了数倍。这可以通过蛋白质与柱材料相互作用的层次来解释：S100A12 可以直接与柱材料结合，但 C2+的过量也有助于将 S100A12-dimers 与已入栏的蛋白质间接结合8.因此，高Ca2+浓度可扩大可用于S100A12纯化的表面。从 HIC 到早期（间接绑定 S100A12）和一个非常晚的峰值（柱材料结合蛋白）的 S100A12 的洗脱（通过使用线性梯度）可能支持这种推测（未显示数据）。

对于以高产量和可管理成本生产重组剂S100A12（以及其他蛋白质），大肠杆菌中的蛋白质表达仍然是首选方法。然而，当蛋白质被确定用于细胞培养实验时，特别是在涉及先天免疫细胞的研究中，细菌内毒素不可避免的污染仍然是一个问题。根据我们的经验，即使是明确声明用于细胞培养使用的商业蛋白质，也含有高达1欧/μg蛋白质的内毒素污染，这可显著扭曲测定。因此，必须彻底去除内毒素。溶液中的内毒素单体分子的分子量为10至20 kDa，但它们可以形成分子量较高的云母和结构。例如，通过双价离子21、25促进非常大的结构的形成。

根据我们的方案，我们将高灵敏度内毒素测量与单核细胞刺激测定相结合，验证S100A12蛋白的无内毒素生产。我们认为这种组合特别有意义，因为 a） 低水平内毒素污染可能难以评估取决于测定的敏感性和 b） 使用多霉毒素 B 作为 LPS 抑制剂在单核细胞可能会导致难以解释数据到期对细胞的排他性多霉毒素B效应26，27。据报道，多霉毒素B以及其他阳离子肽通过带负电荷的脂质A28结合LPS。由于S100A12的溶剂暴露表面也含有大带负电荷的贴片，观察到的TNF®释放从S100A12刺激的人类单核细胞存在多霉毒素B（图3B）可能是由于a）非特异性直接结合多霉毒素B至S100A12和/或b）多霉毒素B对刺激细胞的直接影响26，27。由于低水平内毒素污染检测以及非特异性多霉毒素B效应的已知局限性，我们的协议进一步包含热失活步骤，以明确区分LPS和蛋白质介导的TLR4信号。

使用不含LPS的S100A12来生成和纯化定义的电一致寡聚物至关重要，因此应特别注意其后续纯化，以避免最终通过缓冲液或柱状材料重新引入内毒素，从而通过内毒素去除树脂进一步消耗蛋白质的LPS。

寡聚物与蛋白质生物功能的相关性可以通过不同的方法来评估。在S100A12的情况下，我们使用表面质子共振以及目标氨基酸交换在电结合位点和[最精确地定义蛋白质复合能够结合和信号通过TLR4]我们采用了化学交联Ca2+/Zn2*-脉冲重组S100A1216.S100A12在不同离子条件下的化学交联可捕捉瞬时状态，包括几种处于过渡中的寡聚形式。从电离滴定实验中，我们确定了可以确定为主要寡聚物16的条件。此外，以前的实验表明，过量的离子有利于可比较、稳定的交联和随后的纯化，尽管在显著降低离子浓度时也可以诱导寡聚。然而，通过尺寸排除色谱法净化这些寡聚物会产生良好的，但不是绝对分离。尽管如此，寡聚物的选择性浓缩允许可靠的下游分析。

总之，该协议提供了一种纯化不含LPS的人类S100A12或相关的钙结合蛋白的方法。为了修复由电子引起的构象变化，通过大小排除色谱法实现化学交联和随后的复杂分离是了解蛋白质寡聚与下游生物过程相关性的有用工具。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了蒙斯特大学医学院（KE121201至C.K.）和德国研究基金会（DFG，Fo354/3-1到D.F.）的校内创新医学研究项目的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET11b vector Novagen    
BL21(DE3) competent E. coli New England Biolabs C2527  
       
100x Non-essential amino acids Merck K 0293
25% HCl Carl Roth X897.1
4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels BioRad 4561093
Ampicillin sodium salt Carl Roth HP62.1
BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg ThermoFisher Scientific 21580
Calciumchlorid Dihydrat Carl Roth 5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution BioRad 1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution BioRad 1610436
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit Stemcell 19059 Magnetic negative cell isolation kit
EDTA disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.3
EndoLISA Hyglos 609033 Endotoxin detection assay
Endotoxin-Free Ultra Pure Water Sigma-Aldrich TMS-011-A Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers
EndoTrap red Hyglos 321063 Endotoxin removal resin
FBS (heat-inactivated) Gibco 10270
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14175053
Hepes Carl Roth 9105
Hepes (high quality, endotoxin testet) Sigma-Aldrich H4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA Set BD 555212
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) Carl Roth CN08.1
L-Glutamine (200 mM) Merck K 0282
LB-Medium Carl Roth X968.1
Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 Merck L6529
Pancoll, human PAN Biotech P04-60500 Separation solution (density gradient centrifugation)
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) Merck A 2212
Phenyl Sepharose High Performance GE Healthcare 17-1082-01 Resin for hydrophobic interaction chromatography
Polymyxin B Invivogen tlrl-pmb
Protease inhibitor tablets Roche 11873580001
Q Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0510-01 Resin for anion-exchange chromatography
RoboSep buffer Stemcell 20104 Cell separation buffer (section 5.1.4)
RPMI 1640 Medium Merck F 1215
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth 3957.2
Sodium hydroxide Carl Roth P031.1
Tris Base Carl Roth 4855.3
Zinc chloride Carl Roth T887
Labware
0,45 µm syringe filter Merck SLHA033SS
14 mL roundbottom tubes BD 352059
2 L Erlenmyer flask Carl Roth LY98.1
24 well suspension plates Greiner 662102
5 L measuring beaker Carl Roth CKN3.1
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430829
50 mL high-speed centrifuge tubes Eppendorf 3,01,22,178
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa Merck UFC900324
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa Merck UFC905024
Culture dish (100 mm) Sarstedt 83.3902
Dialysis Tubing Closures Spectrum 132738
EasySep magnet 'The Big Easy` Stemcell 18001
Fraction collector tubes 5 mL Greiner 115101
Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m Sarstedt 94,60,77,316 Film for monocyte culture plates
Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) Spectrum 132724
Steritop filter unit Merck SCGPT01RE
Equipment
37 °C Incubator (with shaking) New Brunswick Scientific Innova 42
ÄKTA purifier UPC 10 GE Healthcare FPLC System
Fraction collector GE Healthcare Frac-920
Centrifuge (with rotor A-4-81) Eppendorf 5810R
Fixed angle rotor Eppendorf F-34-6-38
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU
NanoPhotometer Implen P330
Sonicator Brandelin UW2070
Fluorescence reader Tecan infinite M200PRO
pH meter Knick 765

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References

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免疫学和感染，第151期，S100A12，DAMP，蛋白质纯化，色谱，环交色谱，疏水-相互作用色谱，大小排除色谱，化学交联，单细胞刺激
人类S100A12及其用于免疫细胞刺激的Ion诱导寡聚物的纯化
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Fuehner, S., Foell, D., Kessel, C. Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation. J. Vis. Exp. (151), e60065, doi:10.3791/60065 (2019).

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