Summary
Ce protocole décrit une méthode de purification pour la protéine recombinante sans étiquette de liaison de calcium S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des essais humains de stimulation de monocyte.
Abstract
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour purifier la protéine sététicire-contraignante humaine S100A12 et ses oligomères ion-induits de la culture d'Escherichia coli pour des stimulations de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend la pré-purification des protéines sur une colonne de chromatographie d'échange d'anion et une étape de polissage ultérieure sur une colonne hydrophobe-interaction. Cette stratégie produit des protéines S100A12 d'une grande pureté et d'un rendement à des coûts gérables. Pour les essais fonctionnels sur les cellules immunitaires éventuelle contamination endotoxine résiduelle nécessite une surveillance attentive et d'autres étapes de nettoyage pour obtenir des protéines sans endotoxine. La majorité des contaminations à l'endotoxine peuvent être exclues par la chromatographie d'échange d'anions. Pour épuiser les contaminations résiduelles, ce protocole décrit une étape d'élimination avec des filtres centrifuges. Selon la résistance aux ions disponible S100A12 peut organiser en différents homomultimers. Pour étudier la relation entre la structure et la fonction, ce protocole décrit davantage le traitement ionique de la protéine S100A12 suivi d'un raccordement chimique pour stabiliser les oligomères S100A12 et leur séparation subséquente par exclusion de taille Chromatographie. Enfin, nous décrivons un essai cellulaire qui confirme l'activité biologique de la protéine purifiée et confirme la préparation Sans LPS.
Introduction
S100A12 est une protéine de liaison de calcium qui est principalement produite par les granulocytes humains. La protéine est surexprimée pendant l'inflammation (systémique) et ses niveaux de sérum, particulièrement dans les maladies (auto)inflammatoires telles que l'arthrite idiopathique juvénile systémique (sJIA), la fièvre méditerranéenne familiale (FMF) ou la maladie de Kawasaki (KD) peut informer au sujet de l'activité de la maladie et la réponse à la thérapie. Selon les récepteurs de reconnaissance des modèles (PRR) tels que les récepteurs à péage (TLR), le système immunitaire inné peut être activé par des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) comme les lipopolysaccharides (LPS) ou des modèles moléculaires associés à des dommages (DAMP; également appelé «alarmins»). Les DAMP sont des molécules endogènes telles que les protéines cellulaires, les lipides ou les acides nucléiques1. DAMP-fonctions sont bien décrits pour les membres de la famille des protéines calgranuline, S100A8/A9 et S100A122, qui sont également signalés pour fonctionner comme métal divalent ion-chelating peptides antimicrobiens3,4, 5,6. Selon la force d'ion disponible S100A12 peut, comme d'autres membres de la famille S100, organiser dans différents homomultimers et jusqu'à récemment l'impact de S100A12-oligomerisation sur PRR-interaction, en particulier TLR4, était inconnu.
La forme monomérique de la protéine (92 acides aminés, 10,2 kDa) se compose de deux structures d'hélice-boucle-boucle EF reliées par un lien flexible. Le C-terminalEF-hand contient le motif classique Ca2 -contraignant tandis que le N-terminalEF-hand présente une structure de boucle étendue spécifique aux protéines S100 ('pseudo-EF-hand') et révèle une affinité Ca2'. La liaison Ca2MDpar S100A12 peut entraîner un changement conformationnel majeur dans le terminus Cdes protéines, qui entraîne l'exposition d'un patch hydrophobe sur chaque monomère et forme l'interface de dimerisation. Ainsi, dans des conditions physiologiques, la plus petite structure quaternaire formée par S100A12 est un dimère non covalent (environ 21 kDa) dans lequel les monomères individuels sont en orientation antiparallèle. Lorsqu'il est disposé comme dimère, S100A12 est signalé à séquestreZ2 ainsi que d'autres ions métalliques divalents, par exemple, Cu2 avec une forte affinité7. Ces ions sont coordonnés à l'interface dimère S100A12 par les acides aminés H15 et D25 d'une sous-unité et H85 ainsi que H89 de l'autre sous-unité anti-parallèle8,9,10. Tandis que des études antérieures suggèrent que Zn2 -chargéS100A12 peut induire l'organisation de la protéine en homo-tetramers (44 kDa) et pour avoir comme conséquence l'augmentation De Ca2- affinité11,12, titration métallique récente les études6 suggèrent Ca2-contraignant par S100A12 pour augmenter l'affinité de la protéine à Zn2. Une fois que les mains EF S100A12 sont entièrement occupées par Ca2,on pense que le Ca2 supplémentaire se lie entre les dimères, déclenchant la formation d'hexamer (environ 63 kDa). L'architecture de la structure hexameric quarternary est clairement différente de celle du tétramer. Il est proposé que l'interface tétramer est perturbée pour donner lieu à de nouvelles interfaces dimer-dimer qui bénéficie formation hexamer10. S100A12 est presque exclusivement exprimé par les granulocytes humains où il constitue environ 5% de toute la protéine cytosolique13. Dans sa fonction DAMP S100A12 a été historiquement décrit comme agoniste du récepteur multi-ligand pour les produits finaux avancés de glycation (RAGE), alors appelé protéine extracellulaire nouvellement identifiée rage-contraignante (EN-RAGE)14. Bien que nous ayons précédemment rapporté biochimique S100A12-contraignant à la fois RAGE et TLR415, nous avons récemment démontré monocytes humains pour répondre à la stimulation S100A12 d'une manière TLR4-dépendante16. Cela nécessite l'arrangement de S100A12 dans sa ca2/Zn2 -induitstructure hexameric quarternary16.
Ici nous décrivons une procédure de purification pour l'homme recombinant S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des stimulations de cellules immunitaires16,17. Ceci est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend initialement une colonne d'échange d'anions pour isoler et concentrer la protéine et éliminer les contaminations en vrac (par exemple, les endotoxines/lipopolysaccharides)18. Les résines de chromatographie ion-échange séparent les protéines sur la base de différentes charges de surface nettes. Pour les protéines acides comme S100A12 (point isoélectrique de 5,81), un système tampon avec un pH de 8,5 et une forte résine d'échange d'anion conduit à une bonne séparation. Les protéines liées ont été élucées avec un gradient tampon à haute teneur en sel. Avec une augmentation de la force ionique des ions négatifs dans le tampon d'élution concurrencent les protéines pour les charges sur la surface de la résine. Les protéines s'éliment individuellement en fonction de leur charge nette et, par conséquent, les tampons décrits ci-dessus permettent d'isoler et de concentrer la protéine S100A12 surexprimée. En raison de groupes chargés négativement dans les lipopolysaccharides, ces molécules se lient également aux résines d'échange d'anion. Cependant, leur charge nette plus élevée entraîne une élution ultérieure dans le gradient de haute teneur en sel appliqué. La deuxième étape de la procédure de purification a été introduite à des fins de polissage. Cela permet d'utiliser la capacité de liaison de calcium de S100A12 et élimine les impuretés restantes sur une colonne hydrophobe-interaction. La liaison calcique de S100A12 entraîne un changement conformationnel et une exposition de plaques hydrophobes à la surface de la protéine. À cette condition, S100A12 interagit avec la surface hydrophobe de la résine. Sur le calcium-chelating par EDTA, cette interaction est inversée. En présence d'ions, en particulier de calcium et de zinc, S100A12 s'arrange en oligomères homoméricagris. Pour étudier les relations structure-fonction des différents oligomères, nous avons stabilisé le sadicycle, le tétramérique et le recombinant hexamérique S100A12 avec un crosslinker chimique et avons séparé les complexes sur une colonne de chromatographie d'exclusion de taille. Enfin, pour analyser la fonctionnalité et l'activité biologique de la protéine purifiée et de ses oligomères induits par les ions, la libération de cytokine du monocyte stimulé S100A12 et du LPS peut être comparée.
Diverses méthodes de purification du S100A12 ont été décrites jusqu'à présent. Jackson et coll.19, par exemple, ont publié un protocole avec purification par l'intermédiaire d'une colonne d'échange d'anion et d'une chromatographie d'exclusion de taille ultérieure. Le polissage de la purification sur une colonne d'exclusion de taille donne de bons résultats, mais, en raison par exemple des volumes de chargement limités, il est moins flexible en matière d'évolutivité. Une approche différente, publiée par Kiss et coll.20, décrit la purification des protéines étiquetées par la colonne d'affinité Ni2 comme la première étape de purification, suivie d'un clivage enzymatique pour enlever l'étiquette et d'autres étapes de purification. Contrairement aux études précitées19,20, la protéine produite telle que décrite dans ce protocole est déterminée pour des expériences sur les cellules immunitaires. Par conséquent, la contamination résiduelle d'endotoxine de la culture bactérienne est un défi. Bien que différentes approches pour l'élimination de l'endotoxine ont été décrites jusqu'à présent, il n'existe aucune méthode uniforme qui fonctionne aussi bien pour une solution de protéines donnée21,22.
En résumé, notre protocole combine les avantages d'une expression sans étiquette dans un système bactérien avec l'élimination efficace de l'endotoxine et un rendement élevé de protéines pures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau supplémentaire 1 pour la préparation des tampons et des solutions de stock.
1. Expression protéique dans E. coli
-
clonage
- Clone sans étiquette humaine S100A12 (NCBI Reference Sequence: NP-005612.1) dans l'expression bactérienne vecteur pET11b. Pour exprimer la protéine, transformez la construction en E. coli BL21(DE3).
-
culture
- Préparer une culture de démarrage en inoculé une seule colonie dans 5 ml de milieu de croissance (bouillon LB avec une ampicilline de 100 g/mL) dans un tube à fond rond de 14 ml. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 220 tr/min. Transférer 2 à 4 ml de culture de nuit dans 400 ml de milieu de croissance dans un flacon Erlenmayer de 2 L et incuber la culture à 37 oC en secouant à 220 tr/min.
REMARQUE: La densité initiale de la culture principale devrait être la densité optique à 600 nm (OD600) - 0,1. - Surveillez l'OD600 pendant la croissance. Induire l'expression des protéines en s'ajoutant 1 M d'isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration finale de 1 mM à600 OD 0,5 à 0,6. Incuber à 37 oC et 220 tr/min pour 4 h supplémentaires.
REMARQUE: En général, un OD600 de 0,6 sera atteint après 1,5 à 2,5 h à 37 oC. - Préparer un tampon de sonication de 50 ml en dissolvant 50 mM De Tris, 50 mM de NaCl et 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylènediamine (EDTA) dans 40 mL d'eau déionisée. Ajuster le pH avec HCl à 8,0 et faire jusqu'à 50 ml. Ajouter l'inhibiteur de la protéase (1 comprimé par solution de 50 ml) et réquilibrer le tampon à 4 oC.
- Transférer la culture bactérienne dans des bouteilles de centrifugeuses appropriées et récolter les cellules à 3 200 x g pendant 30 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 25 ml de tampon de sonication glace-froid. Désormais, gardez les cellules sur la glace.
REMARQUE : Les cellules suspendues peuvent être stockées à -20 oC à court terme et à -80 oC à long terme.
- Préparer une culture de démarrage en inoculé une seule colonie dans 5 ml de milieu de croissance (bouillon LB avec une ampicilline de 100 g/mL) dans un tube à fond rond de 14 ml. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 220 tr/min. Transférer 2 à 4 ml de culture de nuit dans 400 ml de milieu de croissance dans un flacon Erlenmayer de 2 L et incuber la culture à 37 oC en secouant à 220 tr/min.
-
Sonication/lysis
- Sonicate les cellules pour 6 cycles de 30 s sur la glace. Après chaque cycle, les cellules de repos pour 30 à 60 s pour protéger les cellules contre la surchauffe.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation à grande vitesse préréfrigéré de 50 ml et une centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 15 000 x g pendant 30 min à 4 oC. Décantez le lysate défriché qui contient les protéines cytosoliques solubles dans un tube frais de 50 ml et jetez la pastille.
2. Purification des protéines
- Chromatographie d'échange d'anion
- dialyse
- Préparer la chromatographie d'échange d'anion (AIEX) tampon A en dissolvant 20 mM Tris, 1 mM EDTA et 1 mM d'éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acid (EGTA) dans de l'eau déionisée et ajuster le pH à 8,5 avec HCl. Pour la dialyse préparer 2 x 5 L et pour la chromatographie 2x 1 L de tampon AIEX A.
REMARQUE: Le volume de dialysate doit être environ 100 fois le volume de l'échantillon. Tous les tampons utilisés pour la chromatographie doivent être filtrés (0,45 m ou plus petit) et dégazés (p. ex., par bain à ultrasons ou dégazage sous vide). - Couper les tubes de dialyse (coupure de poids moléculaire [MWCO] : 3,5 kDa) dans une longueur appropriée avec un espace supplémentaire pour l'air afin d'assurer la flottabilité de l'échantillon au-dessus de la barre d'agitation rotative.
REMARQUE: Le glycérol préserve la membrane et doit être enlevé avant utilisation. - Pour réduire la viscosité de la solution protéique défrichée de l'étape 1.3.2, diluer la solution avec 25 ml de tampon A d'AIEX pour faciliter l'application ultérieure à la colonne de chromatographie. Fixez la première fermeture sur le tube, chargez l'échantillon dans la membrane et attachez la deuxième fermeture à au moins 1 cm de l'extrémité supérieure du tube.
- Placer le récipient de 5 L avec le tampon A d'AIEX sur une plaque d'agitation, ajouter une barre d'agitation et la membrane remplie de solution protéinée. Ajuster la vitesse pour faire pivoter l'échantillon en évitant les interférences avec la barre tournante. Dialyser pendant 12 à 24 h à 4 oC, puis remplacer le tampon de dialysate (amortiaaa a) par une préparation fraîche pré-refroidie et continuer pendant au moins 4 heures supplémentaires. Transférer la solution de protéines dialysées dans un tube de 50 ml et filtrer à travers une unité de filtre de 0,45 m.
REMARQUE: Stockage possible.
- Préparer la chromatographie d'échange d'anion (AIEX) tampon A en dissolvant 20 mM Tris, 1 mM EDTA et 1 mM d'éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acid (EGTA) dans de l'eau déionisée et ajuster le pH à 8,5 avec HCl. Pour la dialyse préparer 2 x 5 L et pour la chromatographie 2x 1 L de tampon AIEX A.
- Chromatographie
- Démarrez le système de chromatographie liquide (FPLC) avec un entretien général, connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B (amorti adème A avec 1 M NaCl) et la colonne contenant de la résine d'échange d'anions. Consultez le tableau 1 pour les paramètres chromatographiques généraux.
REMARQUE : Les tampons, les colonnes et l'équipement FPLC doivent être récalcitrés à la même température avant de commencer la course (se référer aux paramètres chromatographiques du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du tableau 4et du tableau 5). - Équilibrez la colonne avec le tampon A de l'AIEX, chargez ensuite l'échantillon sur la colonne et élichez les protéines avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de tampon de haute teneur en sel (AIEX B). Consultez le tableau 2 pour un protocole de méthode détaillé.
- Recueillir 2 fractions de mL pendant l'élution et analyser 10 L de chaque fraction sur un Coomassie-stained 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Mettre en commun les fractions contenant de la protéine S100A12 pour la dialyse.
REMARQUE: Le poids moléculaire de S100A12 est de 10 575 Da.
- dialyse
- Chromatographie hydrophobique-interaction dépendante du calcium (HIC)
- dialyse
- Dialysez la solution protéique contre 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 suivant la procédure décrite dans la section 2.1.1.
- Chromatographie
- Préparer 1 L de chromatographie tampon HIC A en dissolvant 20 mM Tris, 140 mM NaCl et 25 mM CaCl2 dans de l'eau déionisée et ajuster le pH à 7,5. Pour le tampon B HIC, dissoudre 20 mM Tris, 140 mM NaCl et 50 mM EDTA. Ajuster le pH à 7,0 et filtrer et dégazer les tampons. Ajouter le CaCl2 à l'échantillon à une concentration finale de 25 mm et filtrer à travers 0,45 m. Equilibrate hic buffers et échantillon à 4 oC (température de colonne).
- Démarrez le système de chromatographie liquide avec l'entretien général, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne. Consultez le tableau 3 pour d'autres paramètres chromatographiques.
- Équilibrez la colonne, chargez l'échantillon et prolongez le bloc « laver l'échantillon non lié » jusqu'à ce que le signal UV atteigne à nouveau le niveau de référence. Ensuite, commencez l'élution avec un chélateur de calcium contenant tampon (EDTA). Consultez le tableau 4 pour un protocole de méthode détaillé.
REMARQUE: Des expériences antérieures ont montré qu'un excès de calcium semble être bénéfique pour la liaison de S100A12 à la résine de chromatographie. - Recueillir des fractions de pointe de 2 ml et analyser 10 L de chaque fraction sur un SDS-PAGE teinté de Coomassie de 15 %. Piscine pure S100A12 fractions et dialyser contre Hepes tamponné saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) comme décrit dans la section 2.1.1.
REMARQUE: Le coefficient d'extinction du monomeric S100A12 est de 2980 M-1 cm-1.
- dialyse
3. Détection et élimination de l'endotoxine
-
Détection de l'endotoxine
- Pour déterminer la contamination par l'endotoxine, mesurez les concentrations de protéines diluées à partir de l'étape 2.2.2.4. (p. ex., 1:10 et 1:100 dans HBS) utilisant un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) à base d'analyse fluorescente de détection d'endotoxine(tableau des matériaux). Effectuez cet exemple en suivant le protocole du fabricant.
REMARQUE: Utilisez des solutions HBS fraîchement préparées dissoutes dans de l'eau désionisée ultrapure pour éviter la (nouvelle) contamination par l'endotoxine par le tampon.
- Pour déterminer la contamination par l'endotoxine, mesurez les concentrations de protéines diluées à partir de l'étape 2.2.2.4. (p. ex., 1:10 et 1:100 dans HBS) utilisant un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) à base d'analyse fluorescente de détection d'endotoxine(tableau des matériaux). Effectuez cet exemple en suivant le protocole du fabricant.
-
Enlèvement de l'endotoxine et concentration de protéines
- Chargez 15 ml d'échantillon sur une unité de filtre centrifugeuse de 50 kDa et une centrifugeuse à 3 200 x g et 10 oC pendant environ 10 min. Transférer le flux dans un récipient frais (sur la glace) et remplir et centrifuger le tube filtrant de 50 kDa aussi souvent que nécessaire. Laver la membrane du filtre deux fois avec HBS pour récupérer autant de protéines que possible après chaque étape.
- Concentrez le flux s100A12 en utilisant un filtre centrifuge de 3 kDa jusqu'à ce que le volume soit réduit à un cinquième jusqu'à un dixième du volume de chargement initial (centrifugation à 3 200 x g, 10 oC pendant environ 30 min). Remplissez le filtre aussi souvent que nécessaire, rincez la membrane et transférez la solution concentrée dans un nouveau tube après chaque recharge. Jetez le flux à travers. Filtrer à nouveau à travers 50 kDa comme décrit ci-dessus.
REMARQUE: Au cours de cette procédure, la perte de protéines est remarquable (jusqu'à 50%), mais la préparation de protéines restantes est complètement épuisée de LPS. Cette méthode produit environ 10 à 15 mg de protéines provenant de la culture de 400 ml. - Ajustez la solution protéique à 1 mg/mL avec hbS sans endotoxine et mesurez la teneur en LPS telle que décrite à l'étape 3.1.1. Dans le cas où la solution protéique n'est toujours pas testée comme sans LPS (lt;0.1 EU/mL), éliminez les contaminations résiduelles en utilisant une résine d'élimination de l'endotoxine.
REMARQUE: Avec une concentration en protéines de 1 mg/mL, la contamination de 0,1 UE/mL LPS équivaut à environ 0,01 pg de protéines LPS/g.
4. Croisement chimique et séparation d'Oligomer
-
Liaison sylencelle chimique
- Préparer des solutions de stock très pures (sans endotoxine) de 1 M CaCl2 et 100 mM ZnCl2 dans de l'eau déionisée ultrapure (Table des Matériaux). Utilisez ce tampon, fraîchement préparé, pour l'étape suivante.
- Incubate 10 ml de S100A12 purifié sans endotoxine (concentration 1 mg/mL en HBS) pendant 30 min à température ambiante (RT) avec 25 mM CaCl2 pour dimérique/tétramérisme, ou 25 mM CaCl2 et 1 mM ZnCl2 pour hexameric/tetrameric S100A12 Oligomères.
- Préparer le crosslinker en dissolvant 8 mg de BS3 dans 500 l d'eau sans endotoxine directement avant utilisation (8 mg de liaison croisée pour une solution de protéines ioniques de 10 mL équivaut à une concentration finale de 1,4 mM). Mélanger le crosslinker et l'échantillon par pipetting et incuber pendant 30 min supplémentaires à RT. Quench la réaction en ajoutant 1 M Tris-HCl, pH 7,5 à une concentration finale de 50 mM et filtrer à travers 0,45 m.
-
Chromatographie de taille-exclusion
- Équilibrez l'échantillon relié à 12'15 oC (température de colonne) et démarrez le système de chromatographie liquide avec un entretien général. Connectez le tampon de colonne (HBS) et la colonne taille-exclusion. Consultez le tableau 5 pour obtenir des renseignements détaillés.
- Équilibrez la colonne dans HBS, chargez l'échantillon et collectez des fractions de pointe (1/2 ml) pendant la course. Analysez ces fractions sur un gradient de 4 à 20 % SDS-PAGE et mettez en commun les fractions avec les principales bandes du complexe protéique désiré.
REMARQUE: L'hydrolyse des réactifs d'ester de NHS comme BS3 dans les solutions aqueuses a comme conséquence une absorption forte à 280 nm. Le lien croisé non lié (poids moléculaire : 572 g/mol) élit à la fin de la course et donne un pic fort. - Concentrez les solutions en utilisant des unités de filtre centrifuge avec des MWCO de 10 kDa (dimer), 30 kDa (tétramer) ou 50 kDa (hexamer). Déterminer la contamination par l'endotoxine telle que décrite à la section 3.1. Si nécessaire, retirer le Reste de LPS avec une résine d'élimination de l'endotoxine suivant les recommandations du fabricant (Tableau des matériaux).
5. Tests fonctionnels sur les monocytes
- Préparation des monocytes
- Isoler les monocytes des manteaux bouffi humains par centrifugation de gradient de densité et enrichissement monocyte subséquent à l'aide d'un kit de séparation de perles magnétiques (Tableau des matériaux).
REMARQUE: Ce protocole donnera environ 5 à 7 x 107 monocytes (une couche bouffie) d'une pureté de 83 à 95 %. Étant donné que le nombre, mais aussi la réactivité des cellules dépend fortement du donneur, le protocole peut devoir être mis à l'échelle (selon le nombre de cellules requis). - Pour la centrifugation de densité, équilibrez la solution de séparation (densité de 1,077 g/mL) vers RT et transférez 20 mL en tubes centrifugeuses de 50 ml (2 tubes par pelage bouffi). Diluer le sang du pelage buffy humain avec la solution de sel tamponné de Hank (HBSS) à un volume total de 60 ml et une couche de 30 ml de ce mélange soigneusement sur le dessus du milieu de séparation. Centrifugeuse à 550 x g pendant 35 min à RT. Désapire le frein de centrifugeuse.
- Après centrifugation, les cellules sanguines périphériques mononucléaires (PBMC) sont situées directement au-dessus du milieu de séparation. Transférer ces cellules dans un tube frais de centrifugeuse de 50 ml, faire jusqu'à 50 ml avec HBSS, et centrifugeuse à 170 x g pendant 10 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans un petit volume de HBSS par pipetting.
- Remplissez le tube jusqu'à 50 ml et la centrifugeuse à 290 x g pendant 10 min. Aspirez à nouveau le supernatant, suspendez les cellules en HBSS (50 ml) et centrifugeoire à 170 x g pendant 10 min. Comptez les cellules et resuspendez-les dans un tampon de séparation cellulaire (Tableau des matériaux /c9) à une concentration de 5 x 107 cellules/mL.
REMARQUE: Au lieu de HBSS, saline tamponnée de phosphate (PBS) peut être employée pour laver les cellules. - Pour l'isolement des monocytes des PBMC, utilisez un kit magnétique d'isolement cellulaire négatif et suivez le protocole du fabricant. Compter les monocytes et le resuspendre dans le milieu monocyte (RPMI 1640, 15% sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur [FCS], 4 mM L-glutamine, 100 U/mL pénicilline/streptomycine) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
- Pour les monocytes de culture, enrober les plats de culture (p. ex., 100 mm) d'un film hydrophobe perméable au gaz, adapté aux cellules de suspension(Tableau des matériaux). Stériliser les plaques en utilisant la lumière UV pendant environ 30 min. Transférer les cellules à ces plaques de culture et les laisser reposer toute la nuit à 37 oC et 5 % de CO2.
REMARQUE: Utilisez 15 à 25 ml de suspension cellulaire par plat enduit.
- Isoler les monocytes des manteaux bouffi humains par centrifugation de gradient de densité et enrichissement monocyte subséquent à l'aide d'un kit de séparation de perles magnétiques (Tableau des matériaux).
- Stimulation monocyte
- Stimulation avec S100A12 (type sauvage)
REMARQUE: Pour distinguer le S100A12 non traité (produit final de la section 2.2.2) de la protéine reliée croisée, S100A12 dans ce qui suit est appelé «type sauvage».- Transférer les cellules reposées dans un tube centrifugeur de 50 ml et une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans un milieu de stimulation (RPMI 1640, 5 % DE FCS inactivé par la chaleur, 4 mM L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline/ streptomycine) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
- Pour la stimulation, utilisez 24 plaques de suspension de puits et ajoutez 250 l de suspension cellulaire par puits (0,5 x 106 cellules/puits). Ajouter 50 g/mL de polymyxine B aux puits prévus, suivi s'il le faut soit en LPS à différentes concentrations (25, 50, 100 et 200 pg/mL) soit par le wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 g/mL). De plus, appliquez la protéine non traitée ou dénaturée par la chaleur (99 oC, 10 min) en différentes concentrations sur les cellules.
REMARQUE: Un traitement thermique court dénature la protéine S100A12, mais a moins ou moins d'effet sur Le LPS. - Incuber les plaques pendant 4 h à 37 oC et 5 % de CO2. Récoltez les cellules en transférant la suspension cellulaire de chaque puits à des tubes de réaction de 1,5 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Transférer les supernatants sur des tubes frais et mesurer la libération de TNFMD dans différentes dilutions (p. ex. 1:2, 1:5, 1:10) avec un kit humain TNFMD ELISA suivant les recommandations du fabricant.
- Stimulation avec oligomères S100A12
- Préparer et ensemencer les monocytes dans 24 plaques de suspension de puits comme décrit ci-dessus. Stimulez les cellules en ajoutant des oligomères S100A12 à partir de l'étape 4.2.3. en différentes concentrations molaires (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
REMARQUE: Afin de comparer les capacités des différents oligomères pour stimuler les monocytes, des oligomères ont été appliqués aux cellules dans des concentrations molaires comparables. - Incuber pendant 4 h à 37 oC et 5 % de CO2,récolter les cellules et mesurer la libération de TNFMD dans les supernatants comme décrit ci-dessus.
- Préparer et ensemencer les monocytes dans 24 plaques de suspension de puits comme décrit ci-dessus. Stimulez les cellules en ajoutant des oligomères S100A12 à partir de l'étape 4.2.3. en différentes concentrations molaires (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Stimulation avec S100A12 (type sauvage)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Après la prépurification sur la colonne AIEX (figure 1A-C) et le HIC dépendant du calcium(figure 2A,B),des protéines hautement pures ont été obtenues (Figure 2C). En outre, les mesures de l'endotoxine ont indiqué l'enlèvement réussi de LPS. Le contenu LPS suivant AIEX a été mesuré dans une dilution 1:10 au-dessus de la limite de détection d'analyse, c'est-à-dire au-dessus de 500 EU/mL. Après la première filtration par une unité de filtre de 50 kDa, le contenu LPS a été réduit à 1 UE/mL. Après concentration avec une unité de filtre de 3 kDa et une filtration supplémentaire à travers 50 kDa, la contamination mesurée de LPS était 0.08 EU/mL.
Comme un contrôle supplémentaire, les monocytes humains ont été stimulés avec la protéine de type sauvage produite (Figure 3A,B). Le traitement de polymyxine B abroge la libération de TNFMD des monocytes LPS-stimulés, qui ne peuvent pas être observés avec S100A12. D'autre part, le traitement thermique de LPS et S100A12 abolit la capacité de la protéine à stimuler les cellules, alors que cela n'affecte pas la réponse cellulaire à LPS-stimulation.
L'exposition aux protéines à différents ions entraîne l'arrangement de différents oligomères S100A12 (figure 4A). Le raccordage chimique permet de capturer des complexes définis tels que les douilleurs, les tétratiers et les hexamers ainsi que les états de transition (p. ex., «trimers», bande à environ 30 kDa). Afin d'induire un déplacement prononcé de l'équilibre oligomère avant de se croiser, un excès d'ions a été appliqué (Figure 4B).
Des oligomères isolés à concentrations molaires égales(figure 5A-C)ont ensuite été utilisés pour la stimulation des monocytes afin de comparer les capacités de signalisation par l'intermédiaire de RCR. Monocyte-stimulation avec s100A12 hexameric a donné lieu à une libération prononcée de TNMMD(figure 6 ). La libération de cytokine résiduelle pourrait être détectée à partir de cellules stimulées par le tétramérisme S100A12, tandis que le traitement par protéine dimérique n'induit pas la libération de TNFMD.
Figure 1 : Résultats de la chromatographie d'échange d'anion. (A) Un chromatogramme avec absorption à 280 nm (A280) et le pourcentage de tampon d'élution B (ligne pointillée). Les blocs de méthodes sont indiqués avec un échantillon non lié A ' wash, B ' gradient linéaire avec tampon d'élution (tampon B), C ' laver avec tampon B, et D ' ré-équilibrage dans le tampon A. (B) Concentrez-vous sur les pics pertinents avec des nombres de tubes de fraction en rouge. (C) Des fractions sélectionnées ont été analysées sur 15 % de SDS-PAGE tachés de Coomassie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats de la chromatographie hydrophobe-interaction. (A) Un chromatogramme avec absorption à 280 nm (A280) et le pourcentage de tampon d'élution B (ligne pointillée). Les blocs de méthodes sont indiqués avec un échantillon non lié, une suppression B et une suppression de tampon s'il y a du tampon B et du rééquilibrage c. dans le tampon A. (B) Concentrez-vous sur les pics pertinents avec des nombres de tubes de fraction en rouge. (C) Fractions analysées sur 15% DeSD-PAGE tachés de Coomassie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les monocytes humains primaires ont été stimulés à des concentrations indiquées. LPS (A) ou S100A12 (type sauvage, B) n'ont pas été traités ou dénaturés par la chaleur (99 oC, 10 min). Les deux conditions ont été testées en présence et absence de polymyxine B. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La protéine S100A12 a été reliée à BS3 après l'incubation dans un tampon HBS contenant 5 mM Ca2 et a indiqué des concentrations de Zn2. (A) L'augmentation des concentrations de Zn2 ' induisent l'arrangement de S100A12 dans les tétramers et les hexamers lors de la séparation sur 4-20% Coomassie-stained SDS-PAGE. (B) Résultat représentatif des oligomères reliés entre croisés avec des conditions utilisées pour la séparation sur une colonne d'exclusion de taille. Le S100A12 a été relié en présence de 25 mM Ca2 (voie 1) ou de 25 mM Ca2 et de 1 mM Zn2 (voie 2). (S100A12) 2 - dimer; (S100A12) 4 tétramer; (S100A12) 6 et hexamer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Les oligomères S100A12 ont été séparés sur une colonne d'exclusion de taille. (A) Chromatogramme de séparation hexamer/tétramer après croisement dans le tampon HBS avec 25 mM CaCl2 et 1 mM ZnCl2. (B) Chromatogramme pour la séparation tétramer/dimer dans le tampon HBS avec 25 mM CaCl2. (C) Exemple d'oligomères mis en commun et concentrés après la séparation sur un Gradient SDS-PAGE de 4 à 15 % taché de Coomassie. Voie 1 et dimère; voie 2 tétramer; voie 3 - hexamer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Stimulation des monocytes avec des oligomères S100A12 purifiés. La libération de TNFMD après 4 h d'incubation a été quantifiée par ELISA. Les données montrent la valeur moyenne de deux expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Volume de lit (CV) | 75 ml |
| contrôler | Absorption à 280 nM |
| Pression Max | 3 barres |
| Tampon de colonne A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Tampon de colonne B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Volume d'échantillons | variable |
| Débit | 1 ml/min |
| température | 4 oC |
Tableau 1 : Informations détaillées sur les paramètres appliqués de la chromatographie d'échange d'anion.
| bloc | volume | tampon | prise de courant |
| Équilibrage | Volumes de colonnes (CV) | un | gaspillage |
| Charge d'échantillon | ne s'applique pas | un | gaspillage |
| Laver l'échantillon non lié | 1 CV | un | Sortie à volume élevé |
| Gradient-Elution | 0 à 100 % Tampon B en 1 CV | A à B | Collecteur de fractions |
| Laver le tampon B | 1 CV | B | gaspillage |
| Rééquilibrité | 2 CV | un | gaspillage |
Tableau 2 : Informations détaillées sur la méthode utilisée de chromatographie d'échange d'anions.
| Volume de lit (CV) | 125 ml |
| contrôler | Absorption à 280 nM |
| Pression Max | 4 barres |
| Tampon de colonne A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Tampon de colonne B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Volume d'échantillons | variable |
| Débit | 1 ml/min |
| température | 4 oC |
Tableau 3 : Informations détaillées sur les paramètres appliqués de la chromatographie hydrophobe-interaction.
| bloc | volume | tampon | prise de courant |
| Équilibrage | Volumes de colonnes (CV) | un | gaspillage |
| Charge d'échantillon | ne s'applique pas | un | gaspillage |
| Laver l'échantillon non lié | 1/2 CV | un | Sortie à volume élevé |
| Élution | 100 % Tampon B | B | Collecteur de fractions |
| Laver le tampon B | 1 CV | B | gaspillage |
| Rééquilibrité | 2 CV | un | gaspillage |
Tableau 4 : Informations détaillées sur la méthode utilisée de chromatographie hydrophobe-interaction.
| Volume de lit (CV) | 320 ml |
| contrôler | Absorption à 280 nm |
| Pression Max | 3 barres |
| Tampon de colonne A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Volume d'échantillons | Jusqu'à 13 ml |
| Débit | 1,5 ml/min |
| température | 12 à 15 oC |
Tableau 5 : Renseignements détaillés sur les paramètres appliqués de la chromatographie de taille-exclusion.
Tableau supplémentaire 1 : Préparation des tampons et des solutions de stock. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons l'expression bactérienne tag-free de S100A12 humain et sa purification aussi bien que la séparation dans différents oligomères ion-induits pour la stimulation de cellules immunitaires. Comparé à la littérature éditée sur la purification de protéine de S100A128,23,24, l'utilisation du CaCl2 élevé (25 mM) dans la chromatographie hydrophobe-interaction est à notre connaissance unique. Plusieurs protocoles appliquant des concentrations de 1 à 5 mM produisent des protéines pures, mais nous avons observé un rendement plusieurs fois plus élevé suivant notre approche en utilisant 25 mM CaCl2 à la place. Cela peut s'expliquer par une hiérarchie de l'interaction des protéines avec le matériau de colonne: S100A12 peut se lier directement au matériau de colonne, mais l'excès de Ca2 peut également faciliter la liaison indirecte de S100A12-dimers à la protéine déjà liée à la colonne 8. Ainsi, des concentrations élevées de Ca2 peuvent agrandir la surface disponible pour la purification S100A12. L'élution (en utilisant un gradient linéaire) de S100A12 de HIC comme un début (indirectement lié S100A12) et un pic très tardif (protéine liée de matériel de colonne) peut soutenir cette spéculation (données non montrées).
Pour la production de S100A12 recombinant (ainsi que d'autres protéines) à des rendements élevés et des coûts gérables, l'expression des protéines dans E. coli est toujours la méthode de choix. Cependant, la contamination inévitable avec des endotoxines bactériennes reste un problème, quand les protéines sont déterminées pour des expériences de culture cellulaire, particulièrement dans les études impliquant les cellules immunitaires innées. D'après notre expérience, même les protéines disponibles dans le commerce explicitement déclarées pour l'utilisation de la culture cellulaire peuvent contenir des contaminations à l'endotoxine jusqu'à 1 protéine de l'UE/g, ce qui peut considérablement fausser les essais. Par conséquent, un retrait complet des endotoxines est obligatoire. Les monomères d'endotoxine dans la gamme de solution de poids moléculaires de 10 à 20 kDa, mais ils peuvent former des micelles et des structures avec des poids moléculaires plus élevés. La formation de très grandes structures est, par exemple, promue par des ions bivalents21,25.
Selon notre protocole, nous vérifions la production sans endotoxine de la protéine S100A12 en combinant des mesures d'endotoxine à haute sensibilité avec des tests de stimulation monocyte. Nous considérons une telle combinaison particulièrement significative car a) la contamination à faible teneur en endotoxine peut être difficile à évaluer en fonction de la sensibilité de l'analyse et b) l'utilisation de la polymyxine B comme inhibiteur de LPS sur les monocytes peut entraîner difficile à interpréter les données dues aux effets exclusifs de polymyxine B sur des cellules26,27. La polymyxine B ainsi que d'autres peptides cationic sont rapportés pour lier LPS par l'intermédiaire du lipide chargé négativement A28. Comme la surface exposée au solvant de S100A12 contient également de grandes corrections chargées négativement, la réduction observée de la libération de TNFMD des monocytes humains stimulés par S100A12 en présence de polymyxine B (figure 3B) peut être due à une) liaison directe non spécifique de polymyxine B à S100A12 et/ou b) effets directs de la polymyxine B sur les cellules stimulées26,27. En raison des limitations connues de la détection de la contamination à faible teneur en endotoxine ainsi que des effets non spécifiques de polymyxine B, notre protocole contient en outre une étape d'inactivation de la chaleur pour distinguer clairement entre l'enclens lPS et la protéine-négociée TLR4-signaling.
L'utilisation de S100A12 sans LPS pour la production et la purification d'oligomères définis induits par les ions est essentielle et une attention particulière devrait être accordée à leur purification ultérieure afin d'éviter une éventuelle réintroduction de l'endotoxine par l'intermédiaire de tampons ou de matériel de colonne et donc d'autres résines d'élimination de LPS exigeantdes en protéines par l'intermédiaire des résines d'élimination de l'endotoxine.
La pertinence de l'oligomerisation pour la fonction biologique des protéines peut être évaluée par différents moyens. Dans le cas de S100A12, nous avons utilisé la résonance plasmon de surface ainsi que des échanges d'acides aminés ciblés à des sites ion-contraignants et pour définir le plus précisément le complexe protéique capable de lier et de signaler par TLR4-nous avons employé le crosslinking chimique de Ca2 /Zn2 -pulsé recombinant S100A1216. Le raccordé chimique de S100A12 dans différentes conditions ioniques fige un état momentané comprenant plusieurs formes oligomeric qui sont en transition. À partir d'expériences de titration d'ions, nous avons défini des conditions dans lesquelles les oligomères dimériques, tétrapoles ou hexamériques pouvaient être déterminés comme les oligomères prédominants16. En outre, des expériences antérieures ont montré qu'un excès d'ions est bénéfique pour des liaisons croisées comparables et stables et une purification subséquente, bien que l'oligomerisation puisse également être induite à des concentrations ioniques significativement plus faibles. Cependant, purifier ces oligomères par chromatographie d'exclusion de taille a comme conséquence la séparation bonne, mais pas absolue. Pourtant, l'enrichissement sélectif des oligomères permet des analyses fiables en aval.
En résumé, ce protocole fournit une méthode pour la purification des protéines humaines Sans LPS S100A12 ou de liaison sciique s'y retit. Pour fixer les changements conformationnels induits par les ions, le raccordement chimique et la séparation complexe suivante par chromatographie de taille-exclusion est un outil utile pour comprendre la pertinence de l'oligomerization de protéine pour des processus biologiques en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du programme de recherche médicale innovante intra-muros de la faculté de médecine de l'Université De Muenster (KE121201 à C.K.) et de la Fondation allemande de recherche (DFG, Fo354/3-1 à D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
