Summary
Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.
Abstract
Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.
Introduction
S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a padrões moleculares (DAMPs; também denominado ' alarmins '). Os DAMPs são moléculas endógenas, como proteínas celulares, lipídios ou ácidos nucleicos1. As funções húmidas são bem descritas para os membros da família de proteínas calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, quetambém são relatados para operar como peptídeos antimicrobianos de quelaçãode íonsmetálicos divalentes3,4, 5,6. Dependendo da força disponível do íon S100A12 lata, como outros membros da família S100, arranja em homomultimers diferentes e até recentemente o impacto de S100A12-oligomerisation no PRR-interação, particular TLR4, era desconhecido.
A forma monomérica da proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste em duas estruturas de hélice-loop-hélice da EF-mão conectadas por um vinculador flexível. O C-Terminal EF-Hand contem o clássico CA2 +-o motivo obrigatório visto que o N-Terminal EF-Hand exibe uma estrutura prolongada proteína-específica do laço S100 (' pseudo-EF-mão ') e revela a afinidade reduzida de CA2 +-. CA2 +-a ligação por S100A12 pode induzir uma mudança conformacional principal no C-Terminus das proteínas, que conduz à exposição de um remendo hydrofóbico em cada monómero e dá forma à relação do dimerização. Assim, condições fisiológicas, a menor estrutura quaternária formada por S100A12 é um dímero não covalente (aproximadamente 21 kDa), no qual os monómeros individuais estão em orientação antiparalela. Quando arranjado como dímero, S100A12 é relatado para seqüestro Zn2 + , bem como outros íons metálicos divalentes, por exemplo,2 + com alta afinidade7. Estes íons são coordenados na interface de dímero S100A12 por aminoácidos h15 e D25 de uma subunidade e H85, bem como H89 da antiparalelante outra subunidade8,9,10. Enquanto estudos anteriores propõem que Zn2 +-carregado S100A12 pode induzir a organização da proteína em Homo-tetramers (44 kDa) e para resultar em aumento CA2 +-afinidade11,12, recente titulação de metal estudos6 sugerem CA2 +-ligação por S100A12 para aumentar a afinidade da proteína para Zn2 +. Uma vez que os S100A12 EF-hands são ocupados inteiramente por CA2 +, o CA adicional2 + é pensado para ligar entre dímeros, provocando a formação do hexamer (aproximadamente 63 kDa). A arquitetura da estrutura quarternary forma é claramente diferente daquela do tetramer. Propõe-se que a interface do tetrâmero é interrompida para dar origem a novas interfaces dímero-dímero que beneficia a formação de hexamer10. S100A12 é quase exclusivamente expresso por granulócitos humanos, onde constitui cerca de 5% de toda a proteína citosólica13. Em sua função úmida S100A12 foi historicamente descrita como agonista do receptor multiligante para produtos finais de glicação avançada (RAGE), então denominado proteína de ligação à raiva recém-identificada extracelular (EN-RAGE)14. Embora nós relatado mais cedo S100A12-ligação bioquímica a Rage e a TLR415, Nós demonstramos recentemente monócitos humanos para responder à estimulação S100A12 em uma maneira TLR4-dependente16. Isto exige o arranjo de S100A12 em seu ca2 +/Zn2 +-estrutura quarternary forma induzida16.
Aqui nós descrevemos um procedimento da purificação para o S100A12 humano de recombinação e seus oligômeros íon-induzidos para estimulações imunes da pilha16,17. Isso se baseia em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que inicialmente inclui uma coluna de troca de ânions para isolar e concentrar a proteína e remover contaminações em massa (por exemplo, endotoxinas/lipopolissacarídeos)18. Resinas de cromatografia de troca iónica separam proteínas com base em diferentes encargos de superfície líquida. Para proteínas ácidas como S100A12 (ponto isoelétrico de 5,81), um sistema tampão com um pH de 8,5 e uma resina de troca aniónica forte leva a uma boa separação. As proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente de tampão de alto sal. Com um aumento de íons negativos de força iônica no tampão de eluição competir com proteínas para cargas na superfície da resina. Proteínas individualmente eluir dependendo de sua carga líquida e em conseqüência disso, os bufferes descritos nisto permitem isolar e concentrar a proteína S100A12 overexpressada. Devido a grupos carregados negativamente em lipopolissacarídeos, essas moléculas também se ligam a resinas de troca de ânions. Entretanto, sua carga líquida mais elevada conduz à eluição mais atrasada no inclinação elevado-sal aplicado. A segunda etapa do procedimento de purificação foi introduzida para fins de polimento. Isto faz uso da capacidade de ligação de cálcio de S100A12 e remove as impurezas remanescentes em uma coluna de interação hidrofóbica. O emperramento do cálcio de S100A12 conduz a uma mudança conformacional e a uma exposição de remendos hydrofóbicos na superfície da proteína. Nessa condição, S100A12 interage com a superfície hidrofóbica da resina. Em cima do cálcio-quelante pelo EDTA, esta interação é invertida. Na presença de íons, especialmente cálcio e zinco, S100A12 organiza em oligomers condição. Para estudar relações estrutura-função dos oligomers diferentes, nós estabilizamos o dimeric, tetramérica e o S100A12 de recombinação forma com um chapéu cabeado químico e separamos os complexos em uma coluna da cromatografia do tamanho-exclusão. Finalmente, para analisar a funcionalidade e a atividade biológica da proteína purificada e seus oligomers íon-induzidos, a liberação do citocinas de S100A12 e de LPs estimulou o monocyte pode ser comparada.
Os vários métodos para purificante S100A12 foram descritos até agora. Jackson et al.19, por exemplo, publicaram um protocolo com purificação por meio de uma coluna de troca de ânions e uma posterior cromatografia de exclusão de tamanho. O polimento de purificação em uma coluna de exclusão de tamanho leva a bons resultados, mas ― devido a, por exemplo, volumes de carregamento limitados ― é menos flexível na escalabilidade. Uma abordagem diferente, publicada por Kiss et al.20, descreve a purificação da proteína etiquetada via coluna Ni2 + Affinity como a primeira etapa de purificação, seguida de clivagem enzimática para remover a tag e outras etapas de purificação. Em contraste com os estudos aforecited19,20, aproteína produzida como descrito neste protocolo é determinada para experiências em pilhas imunes. Conseqüentemente, a contaminação remanescente da endotoxina da cultura bacteriana é um desafio. Embora diferentes abordagens para a remoção da endotoxina tenham sido descritas até o momento, não há um método uniforme que funcione igualmente bem para qualquer solução protéica21,22.
Em resumo, nosso protocolo combina as vantagens de uma expressão tag-free em um sistema bacteriano com remoção eficiente da endotoxina e elevado rendimento da proteína pura.
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Protocol
Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque.
1. expressão protéica em E. coli
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Clonagem
- Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3).
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Cultura
- Prepare uma cultura inicial inoculando uma única colônia em 5 mL de meio de crescimento (caldo LB com 100 μg/mL de ampicilina) em um tubo de 14 mL de fundo redondo. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 220 rpm. Transfira 2 − 4 mL de cultura overnight para 400 mL de meio de crescimento num balão de 2 L Erlenmayer e incubar a cultura a 37 ° c com agitação a 220 rpm.
Nota: A densidade inicial da cultura principal deve ser a densidade óptica em 600 nm (OD600) = 0,1. - Monitore o OD600 durante o crescimento. Induzir a expressão protéica por adição de 1 M de isopropílico-ß-D-tiogalactopyranosid (IPTG) a uma concentração final de 1 mM em OD600 = 0,5 − 0,6. Incubar a 37 ° c e 220 rpm para 4 h adicionais.
Nota: Geralmente, um OD600 de 0,6 será alcançado após 1.5 − 2.5 h em 37 ° c. - Prepare 50 mL de tampão sonication dissolvendo 50 mM Tris, 50 mM NaCl e 1 mM de ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) em 40 mL de água desionizada. Ajuste o pH com HCl para 8,0 e faça até 50 mL. Adicionar inibidor da protease (1 comprimido por 50 mL de solução) e equilibrar o tampão a 4 ° c.
- Transfira a cultura bacteriana em frascos apropriados do centrifugador e colha as pilhas em 3.200 x g por 30 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 25 mL de tampão de sonicação gelada. Doravante, mantenha as células no gelo.
Nota: as células resguardadas podem ser armazenadas a-20 ° c para a curto prazo e a-80 ° c para longo prazo.
- Prepare uma cultura inicial inoculando uma única colônia em 5 mL de meio de crescimento (caldo LB com 100 μg/mL de ampicilina) em um tubo de 14 mL de fundo redondo. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 220 rpm. Transfira 2 − 4 mL de cultura overnight para 400 mL de meio de crescimento num balão de 2 L Erlenmayer e incubar a cultura a 37 ° c com agitação a 220 rpm.
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Sonication/lise
- SONICATE as células para 6 ciclos de 30 s no gelo. Após cada ciclo, as células de repouso para 30 − 60 s para proteger as células do superaquecimento.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrifugação de alta velocidade pré-refrigerado 50 mL e Centrifugue num rotor de ângulo fixo a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° c. Decantar o lisado limpo que contém as proteínas citosómicas solúveis em um tubo de 50 mL fresco e descartar a pelota.
2. purificação de proteínas
- Cromatografia de troca aniónica
- Diálise
- Prepare a cromatografia de troca aniónica (AIEX) tampão A dissolvendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 1 mM de etileno glicol-bis (2-aminoetilether)-N, N, N ', n'-ácido tetraacético (EGTA) em água desionizada e ajuste o pH para 8,5 com HCl. Para A diálise Prepare 2 x 5 L e para cromatografia 2x 1 L de tampão AIEX A.
Nota: O volume do dialisato deve estar em aproximadamente 100 vezes o volume de amostra. Todos os buffers utilizados para cromatografia devem ser filtrados (0,45 μm ou menor) e desgaseificados (por exemplo, por banho Ultrassônico ou vácuo degassing). - Corte a tubulação da diálise (corte do peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) em um comprimento apropriado com espaço adicional para que o ar assegure a flutuabilidade da amostra acima da barra de giro do stir.
Nota: O glicerol preserva a membrana e deve ser removido antes do uso. - Para reduzir a viscosidade da solução proteica limpa a partir do passo 1.3.2, diluir a solução com 25 mL de tampão AIEX a para facilitar a aplicação subsequente à coluna de cromatografia. Prenda o primeiro fecho no tubo, coloque a amostra na membrana e prenda o segundo fecho pelo menos 1 cm da extremidade superior da tubagem.
- Coloque o recipiente de 5 L com o tampão AIEX a em uma placa de agitação, adicione uma barra de agitação e a membrana preenchida com solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra evitando interferências com a barra de agitação rotativa. Dialyze para 12 − 24 h em 4 ° c, a seguir substitua o amortecedor do dialisato (amortecedor a de AIex) por uma preparação pre-cooled fresca e continue por pelo menos 4 horas adicionais. Transfira a solução de proteína Dialítica para um tubo de 50 mL e filtre através de uma unidade de filtro de 0,45 μm.
Nota: Armazenamento possível.
- Prepare a cromatografia de troca aniónica (AIEX) tampão A dissolvendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 1 mM de etileno glicol-bis (2-aminoetilether)-N, N, N ', n'-ácido tetraacético (EGTA) em água desionizada e ajuste o pH para 8,5 com HCl. Para A diálise Prepare 2 x 5 L e para cromatografia 2x 1 L de tampão AIEX A.
- Cromatografia
- Inicie o sistema de cromatografia líquida (FPLC) com manutenção geral, conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B (AIEX buffer A com 1 M NaCl) e a resina de troca de ânions contendo coluna. Consulte a tabela 1 para obter parâmetros cromatográficos gerais.
Nota: os buffers, a coluna e o equipamento FPLC devem ser equilibrados com a mesma temperatura antes de iniciar a corrida (consultar os parâmetros cromatográficos na tabela 1, tabela 2, tabela 3, tabela 4e tabela 5). - Equilibrar a coluna com o tampão AIex a, depois carregar a amostra na coluna e eluir as proteínas com um gradiente linear de 0% a 100% tampão de sal alto (AIex B). Consulte a tabela 2 para obter um protocolo de método detalhado.
- Colete 2 mL de frações durante a eluição e analise 10 μL de cada fração em uma eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio de 15% com coloração Coomassie (SDS-PAGE). Pool as frações contendo proteína S100A12 para diálise.
Nota: O peso molecular de S100A12 é 10.575 da.
- Diálise
- Cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio (HIC)
- Diálise
- Dialyze a solução da proteína de encontro a 20 milímetros Tris, 140 milímetro NaCl, pH 7,5 que segue o procedimento descrito na seção 2.1.1.
- Cromatografia
- Prepare 1 L de tampão de cromatografia HIC A dissolvendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 25 mM CaCl2 em água deionizada e ajuste o pH para 7,5. Para HIC tampão B, dissolver 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 50 mM EDTA. Ajuste o pH para 7,0 e filtre e Degas os buffers. Adicionar CaCl2 à amostra a uma concentração final de 25 mm e filtrar por 0,45 μm. equilibram os amortecedores HIC e a amostra a 4 ° c (temperatura da coluna).
- Inicie o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna. Consulte a tabela 3 para obter mais parâmetros cromatográficos.
- Equilibrar a coluna, carregar a amostra e estender o bloco ' lavar amostra não acoplada ' até que o sinal UV atinja o nível basal novamente. Comece então a eluição com um quelante do cálcio que contem o amortecedor (EDTA). Consulte a tabela 4 para obter um protocolo de método detalhado.
Nota: As experiências precedentes mostraram que um excesso do cálcio parece ser benéfico para a ligação de S100A12 à resina da cromatografia. - Colete frações de pico de 2 mL e analise 10 μL de cada fração em uma página de SDS 15% Coomassie manchada. Piscina pura S100A12 frações e Dialize contra HEPES-tampão salino (HBS; 20 mm HEPES, 140 mm NaCl, pH 7,0) como descrito na secção 2.1.1.
Nota: o coeficiente de extinção da S100A12 monomérica é 2980 M-1 cm-1.
- Diálise
3. detecção e remoção de endotoxina
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Detecção de endotoxina
- Para determinar a contaminação da endotoxina, medir as concentrações de proteínas diluídas a partir do passo 2.2.2.4. (por exemplo, 1:10 e 1:100 em HBS) usando um ensaio de detecção de endotoxina fluorescente (tabela de materiais) com base em ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). Realize este ensaio seguindo o protocolo do fabricante.
Nota: Use soluções HBS recém-preparadas dissolvidas em água desionizada ultrapura para evitar (nova) contaminação por endotoxina pelo tampão.
- Para determinar a contaminação da endotoxina, medir as concentrações de proteínas diluídas a partir do passo 2.2.2.4. (por exemplo, 1:10 e 1:100 em HBS) usando um ensaio de detecção de endotoxina fluorescente (tabela de materiais) com base em ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). Realize este ensaio seguindo o protocolo do fabricante.
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Remoção de endotoxina e concentração de proteínas
- Carregar 15 mL de amostra em uma unidade de filtro centrífugo 50 kDa e centrifugar a 3.200 x g e 10 ° c por aproximadamente 10 min. Transfira o fluxo-através em uma embarcação fresca (no gelo) e reabasteça e Centrifugue o tubo do filtro de 50 kda tão frequentemente como necessário. Lave a membrana do filtro duas vezes com HBS para recuperar o máximo de proteína possível após cada passo.
- Concentre o fluxo de contenção de S100A12 usando um filtro centrífugo de 3 kDa até que o volume seja reduzido para um quinto até um décimo do volume de carregamento inicial (centrifugação a 3.200 x g, 10 ° c por aproximadamente 30 min). Encha o filtro sempre que necessário, enxague a membrana e transfira a solução concentrada para um novo tubo após cada recarga. Descarte o fluxo. Filtrar novamente através 50 kDa como descrito acima.
Nota: Durante este procedimento, a perda de proteína é notável (até 50%), mas a preparação restante da proteína é esgotada completamente do LPS. Este método rende cerca de 10 − 15 mg de proteína de 400 mL de cultura. - Ajuste a solução proteica para 1 mg/mL com HBS livre de endotoxina e meça o conteúdo LPS conforme descrito na etapa 3.1.1. Caso a solução proteica ainda não seja testada como livre de LPS (< 0,1 EU/mL), elimine as contaminações remanescentes usando uma resina de remoção de endotoxina.
Nota: Com uma concentração proteica de 1 mg/mL, a contaminação de 0,1 EU/mL LPS equivale a aproximadamente 0, 1 pg de proteína LPS/μg.
4. separação química da reticulação e do Oligomer
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Reticulação química
- Prepare soluções de estoque altamente puras (endotoxina-livres) de 1 M de CaCl2 e 100 mm de ZnCl2 em água desionizada ultrapura (tabela de materiais). Use este buffer, feito recentemente, para a próxima etapa.
- Incubar 10 mL de S100A12 purificados endotoxina-livres (concentração 1 mg/mL em HBS) durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com 25 mM de CaCl2 para dimeric/tetrameric, ou 25 mm CAcl2 e 1 mm ZnCl2 para HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligômeros.
- Prepare o chapéu cabeado dissolvendo 8 mgs de BS3 em 500 μL de água endotoxina-livre diretamente antes do uso (o chapéu cabeado de 8 mg para a solução de proteína íon-cravada de 10 ml iguala uma concentração final de 1,4 milímetros). Misture o chapéu cabeado e a amostra introduzindo com pipeta e incubar por 30 minutos adicionais em RT. extinguir a reacção adicionando 1 M de Tris-HCl, pH 7,5 a uma concentração final de 50 mm e filtrar através de 0,45 μm.
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Cromatografia de exclusão de tamanho
- Equilibrar a amostra reticulada a 12 − 15 ° c (temperatura da coluna) e iniciar o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral. Conecte o buffer de coluna (HBS) e a coluna de exclusão de tamanho. Consulte a tabela 5 para obter informações detalhadas.
- Equilibram a coluna em HBS, carregam a amostra e coletam frações máximas (1 − 2 mL) durante a corrida. Analise essas frações em um gradiente de 4 − 20% de SDS-PAGE e frações de pool com as principais bandas do complexo proteico desejado.
Nota: A hidrólise de reagentes do éster do NHS como BS3 em soluções aquosas conduz a uma absorvância forte em 280 nanômetro. Chapéu cabeado não acoplado (peso molecular: 572 g/mol) elutos no final da corrida e resulta em um pico forte. - Concentre as soluções utilizando unidades filtrantes centrífugas com MWCOs de 10 kDa (dímero), 30 kDa (tetramer) ou 50 kDa (hexamer). Determine a contaminação da endotoxina conforme descrito na seção 3,1. Se necessário, retire os LPS restantes com uma resina de remoção de endotoxina seguindo as recomendações do fabricante (tabela de materiais).
5. testes funcionais em monócitos
- Preparação de monócitos
- Isole monócitos de casacos Buffy humanos por centrifugação de gradiente de densidade e enriquecimento de monócitos subsequente usando um kit de separação de esferas magnéticas (tabela de materiais).
Nota: Este protocolo resultará em aproximadamente 5 − 7 x 107 monócitos (um casaco Buffy) com uma pureza de 83 − 95%. Desde que o número, mas igualmente a compreensibilidade das pilhas depende fortemente do doador, o protocolo pode ter que ser escalado acima (dependendo da contagem de pilha exigida). - Para a centrifugação da densidade, equilibram a solução da separação (densidade = 1, 77 g/mL) a RT e transferem 20 mL em 50 mL de tubos de centrifugação (2 tubos por o revestimento Buffy). Diluir o sangue do casaco Buffy humano com a solução de sal tamponada de Hank (HBSS) para um volume total de 60 mL e camada de 30 mL desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrífuga a 550 x g por 35 min em RT. desative o freio de centrífuga.
- Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMCs) estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Transfira estas pilhas em um tubo de centrifugador fresco de 50 mL, faça até 50 mL com HBSS, e Centrifugue-o em 170 x g por 10 minutos aspirar o sobrenadante e ressuscitar a pelota da pilha em um volume pequeno de HBSS introduzindo com pipting.
- Encha o tubo até 50 mL e centrifugue em 290 x g por 10 min. aspirar o sobrenadante novamente, ressuscite as células em hbss (50 ml) e centrifugar a 170 x g por 10 min. contar as células e ressuscite-los em buffer de separação celular (tabela de materiais < /C9 >) a uma concentração de 5 x 107 células/ml.
Nota: Em vez de HBSS, salina tampão fosfato (PBS) pode ser usado para lavar as células. - Para o isolamento de monócitos de PBMCs, use um kit de isolamento magnético de células negativas e siga o protocolo do fabricante. Contagem de monócitos e ressuscição em meio de monócitos (RPMI 1640, 15% de soro de bezerro fetal inativado por calor [FCS], 4 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) a uma concentração de 2 x 106 células/ml.
- Para os monócitos de cultura, os pratos de cultura de revestimento (por exemplo, 100 mm) com um hidrofóbico, filme permeável a gás, adequado para células de suspensão (tabela de materiais). Esterilize as placas usando a luz UV por aproximadamente 30 min. Transfira as pilhas a estas placas da cultura e deixe-as descansar sobre-noite em 37 ° c e em 5% CO2.
Nota: Use 15 − 25 mL de suspensão celular por prato revestido.
- Isole monócitos de casacos Buffy humanos por centrifugação de gradiente de densidade e enriquecimento de monócitos subsequente usando um kit de separação de esferas magnéticas (tabela de materiais).
- Estimulação de monócitos
- Estimulação com S100A12 (wildtype)
Nota: Para distinguir a S100A12 não tratada (produto final da secção 2.2.2) de proteínas reticuladas, S100A12 a seguir é referida como "wildtype".- Transfira as células descansadas em um tubo centrífugo de 50 mL e centrifugue a 350 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em meio de estimulação (rpmi 1640, 5% de calor-INATIVADO FCS, 4 mm L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina) na concentração de 2 x 106 células/ml.
- Para estimulação, use 24 placas de suspensão bem e adicione 250 μL de suspensão celular por poço (0,5 x 106 células/poço). Adicionar 50 μg/ml de polimixina B aos poços pretendidos, seguidos por LPS em diferentes concentrações (25, 50, 100 e 200 PG/ml) ou tipo selvagem S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/ml). Além disso, aplique a proteína ou não tratada ou calor-desnaturado (99 ° c, 10 min) em diferentes concentrações para as células.
Nota: Um tratamento térmico curto desnatura a proteína S100A12 mas tem menos a nenhum efeito em LPs. - Incubar placas para 4 h a 37 ° c e 5% CO2. Colha as células transferindo a suspensão celular de cada poço para 1,5 mL de tubos de reação. Centrifugador a 500 x g durante 10 min. Transfira os sobrenadantes para tubos frescos e meça a libertação de TNFα em diferentes diluições (por exemplo, 1:2, 1:5, 1:10) com um kit de TNFΑ Elisa humano seguindo as recomendações do fabricante.
- Estimulação com oligômeros S100A12
- Prepare e semeie monócitos em 24 placas de suspensão bem como descrito acima. Estimular células adicionando oligômeros S100A12 da etapa 4.2.3. em diferentes concentrações molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
Nota: A fim comparar as habilidades dos oligômeros diferentes para estimular monocytes, os oligômeros foram aplicados às pilhas em concentrações comparáveis do molar. - Incubar por 4 h a 37 ° c e 5% CO2, colher as células e medir a libertação de TNFα nos sobrenadantes como descrito acima.
- Prepare e semeie monócitos em 24 placas de suspensão bem como descrito acima. Estimular células adicionando oligômeros S100A12 da etapa 4.2.3. em diferentes concentrações molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Estimulação com S100A12 (wildtype)
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Representative Results
Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração através de uma unidade de filtro 50 kDa, o conteúdo LPS foi reduzido para 1 UE/mL. Após a concentração com uma unidade de filtro de 3 kDa e filtração adicional através de 50 kDa, a contaminação de LPS medida foi 0, 8 EU/mL.
Como controle adicional, os monócitos humanos foram estimulados com a proteína tipo selvagem produzida (Figura 3A, B). O tratamento com polimixina B AB roga a liberação de TNFα de monócitos estimulados por LPS, que não pode ser observado com S100A12. Por outro lado, o tratamento térmico de ambos LPs e S100A12 abole a capacidade da proteína para estimular as células, enquanto isso não afeta a resposta celular a LPs-estimulação.
A exposição proteica a diferentes íons resulta em arranjo de diferentes oligômeros S100A12 (figura 4a). A reticulação química permite capturar complexos definidos, como dímeros, tetramers e multi-hexâmeros, bem como Estados de transição (por exemplo, ' trimers ', banda em aproximadamente 30 kDa). Para induzir um deslocamento pronunciado do oligomero-equilíbrio antes da reticulação, aplicou-se um excesso de íons (Figura 4B).
Os oligômeros isolados em concentrações iguais do molar (Figura 5a-C) foram usados então para a estimulação do monocyte comparar habilidades da sinalização através dos PRRS. monocyte-estimulação com S100A12 forma conduziu à liberação pronunciada do TNFα (Figura 6 ). A liberação do citocinas de Remnant podia ser detectada das pilhas estimuladas com S100A12 tetramérica, quando o tratamento com proteína do diméricas não induz a liberação do TNFα.
Figura 1: resultados da cromatografia de troca de ânions. A) umcromatograma com absorbância a 280 nm (a280) e a percentagem de tampão de eluição B (linha tracejada). Os blocos dos métodos são indicados com A = amostra não acoplada da lavagem, B = inclinação linear com amortecedor da eluição (amortecedor B), C = lavagem para fora com amortecedor B, e D = re-equilibration no amortecedor a. (B) foco nos picos relevantes com números do tubo da fração no vermelho. (C) as frações selecionadas foram analisadas em 15% Coomassie-SDS-PAGE manchado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados da cromatografia de interação hidrofóbica. A) umcromatograma com absorbância a 280 nm (a280) e a percentagem de tampão de eluição B (linha tracejada). Os blocos dos métodos são indicados com A = amostra não acoplada da lavagem, B = eluição com amortecedor B, e C = re-equilibration no amortecedor a. (B) foco nos picos relevantes com números do tubo da fração no vermelho. (C) frações analisadas em 15% Coomassie-SDS-PAGE manchado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: os monócitos humanos primários foram estimulados em concentrações indicadas. LPS (A) ou S100A12 (wildtype, B) foram deixados não tratados ou calor-denaturated (99 ° c, 10 minutos). Ambas as condições foram testadas na presença e ausência de polimixina B. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: a proteína S100A12 foi reticulada com BS3 após incubação no tampão HBS contendo 5 mm CA2 + e indicou concentrações de Zn2 + . (A) aumentar o Zn2 + concentrações induzem o arranjo de S100A12 em tetrâmeros e em multi-hexâmeros em cima da separação em 4 − 20% Coomassie-SDS-PAGE manchado. B) resultado representativo de oligomeros reticulados com condições utilizadas para a separação numa coluna de exclusão de dimensão. S100A12 foi reticulado na presença de 25 mM CA2 + (pista 1) ou 25 mm CA2 + e 1 mm Zn2 + (pista 2). S100A12 2 = dímero; S100A12 4 = tetramer; S100A12 6 = hexamer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: os oligômeros S100A12 foram separados em uma coluna de exclusão de tamanho. (A) cromatograma de separação de hexamer/tetramer após reticulação no tampão HBS com 25 mm de CAcl2 e 1 mm de ZnCl2. (B) cromatograma para separação de tetramer/dímero no tampão HBS com 25 mm de CAcl2. (C) exemplo de oligômeros agrupados e concentrados após a separação em um gradiente de 4 − 15% com coloração Coomassie, SDS-PAGE. Pista 1 = dímero; pista 2 = tetramer; Lane 3 = hexamer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: estimulação de monócitos com oligomers S100A12 purificados. A liberação de TNFα após 4 h de incubação foi quantificada por ELISA. Os dados mostram o valor médio de dois experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume da cama (CV) | 75 mL |
| Monitor | Absorvância a 280 nM |
| Pressão máxima | 3 bar |
| Buffer de coluna A | 20 mm Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Buffer de coluna B | 20 mm Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Volume de amostra | Variável |
| Vazão | 1 − 2 mL/min |
| Temperatura | 4 ° c |
Tabela 1: informações detalhadas sobre os parâmetros aplicados da cromatografia de troca de ânions.
| Bloco | Volume | Buffer | Tomada |
| Equilibration | 1 − 2 volumes de colunas (CVs) | Um | Resíduos |
| Carga da amostra | n/a | Um | Resíduos |
| Lave para fora a amostra não acoplada | 1 CV | Um | Saída de alto volume |
| Gradiente – eluição | 0 − 100% tampão B em 1 CV | A a B | Coletor de fração |
| Wash out – tampão B | 1 CV | B | Resíduos |
| Re-equilibration | 2 CVs (CV) | Um | Resíduos |
Tabela 2: informações detalhadas sobre o método utilizado de cromatografia de troca de ânions.
| Volume da cama (CV) | 125 mL |
| Monitor | Absorvância a 280 nM |
| Pressão máxima | 4 bar |
| Buffer de coluna A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Buffer de coluna B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Volume de amostra | Variável |
| Vazão | 1 − 2 mL/min |
| Temperatura | 4 ° c |
Tabela 3: informações detalhadas sobre os parâmetros aplicados da cromatografia de interação hidrofóbica.
| Bloco | Volume | Buffer | Tomada |
| Equilibration | 1 − 2 volumes de colunas (CVs) | Um | Resíduos |
| Carga da amostra | n/a | Um | Resíduos |
| Lave para fora a amostra não acoplada | 1 − 2 CVs | Um | Saída de alto volume |
| Eluição | 100% tampão B | B | Coletor de fração |
| Wash out – tampão B | 1 CV | B | Resíduos |
| Re-equilibration | 2 CVs (CV) | Um | Resíduos |
Tabela 4: informações detalhadas sobre o método utilizado de cromatografia de interação hidrofóbica.
| Volume da cama (CV) | 320 mL |
| Monitor | Absorvância a 280 nm |
| Pressão máxima | 3 bar |
| Buffer de coluna A | 20 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Volume de amostra | Até 13 mL |
| Vazão | 1 − 1,5 mL/min |
| Temperatura | 12 − 15 ° c |
Tabela 5: informações detalhadas para os parâmetros aplicados da cromatografia de exclusão de tamanho.
Tabela suplementar 1: preparação de buffers e soluções de estoque. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A128,23,24, o uso de CAcl elevado2 (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários protocolos aplicando concentrações de 1 a 5 mM produzem proteína pura, mas observamos um rendimento várias vezes maior seguindo nossa abordagem usando 25 mM de CaCl2 em vez disso. Isto pôde ser explicado por uma hierarquia da interação da proteína com a coluna material: S100A12 pode diretamente ligar ao material da coluna mas o excesso de CA2 + pode igualmente facilitar a ligação indireta de S100A12-dímeros à proteína já coluna-ligada 8. assim, as concentrações elevadas de CA2 + podem ampliar a superfície disponível para a purificação S100A12. Eluição (usando um gradiente linear) de S100A12 de HIC como um início (indiretamente ligado S100A12) e um pico muito tardio (coluna de material ligado de proteína) pode apoiar esta especulação (dados não mostrados).
Para a produção de S100A12 recombinantes (assim como outras proteínas) em rendimentos elevados e custos gerenciáveis, a expressão da proteína em E. coli é ainda o método da escolha. Entretanto, a contaminação inevitável com endotoxinas bacterianas permanece um problema, quando as proteínas são determinadas para experiências da cultura de pilha, particular nos estudos que envolvem pilhas imunes inata. A nossa experiência, mesmo as proteínas comercialmente disponíveis declaradas explicitamente para o uso da cultura de pilha podem conter contaminações da endotoxina até 1 proteína de UE/μg, que pode significativamente inclinar ensaios. Portanto, uma remoção completa de endotoxinas é obrigatória. Monômeros de endotoxina em solução variam de pesos moleculares de 10 a 20 kDa, mas eles podem formar micelas e estruturas com pesos moleculares mais elevados. A formação de estruturas muito grandes é, por exemplo, promovida através de íons bivalentes21,25.
De acordo com nosso protocolo, nós verificamos a produção endotoxina-livre da proteína S100A12 combinando medidas da endotoxina da elevado-sensibilidade com ensaios da estimulação do monocyte. Nós consideramos tal combinação particularmente significativa como a) a contaminação de baixo nível da endotoxina pode ser difícil de avaliar dependendo da sensibilidade do ensaio e b) o uso do polimixina b como o inibidor de LPs em monócitos pode conduzir a difícil interpretar dados devidos aos efeitos exclusivos da polimixina B nas células26,27. Polimixina B, bem como outros peptídeos catiônicos são relatados para vincular LPS via lipídios carregados negativamente A28. Como a superfície exposta solvente de S100A12 também contém grandes patches carregados negativamente a redução observada da liberação de TNFα de monócitos humanos estimulados por S100A12 na presença de polimixina B (Figura 3B) pode ser devido a) ligação direta inespecífica de polimixina b a S100A12 e/ou b) efeitos diretos da polimixina b em células estimuladas26,27. Devido às limitações conhecidas da deteção da contaminação de baixo nível da endotoxina assim como efeitos inespecíficos do polimixina B, nosso protocolo contem mais uma etapa da calor-inactivation para distinguir claramente entre LPs-e a TLR4-sinalização proteína-negociada.
O uso de LPs-livre S100A12 para a geração e a purificação de oligômeros íon-induzidos definidos é crítico e a atenção extra deve ser pagada a sua purificação subseqüente para evitar a reintrodução eventual da endotoxina através dos bufferes ou do material da coluna e assim a depleção de LPS mais exigente em proteínas através de resinas de remoção de endotoxina.
A relevância da oligomerização para a função biológica das proteínas pode ser avaliada por diferentes meios. Em caso de S100A12, nós usamos a ressonância de superfície do Plasmon assim como trocas alvejadas do ácido aminado em locais Ion-Binding e ― para definir o mais precisamente o complexo proteico capaz de ligar e sinalizar através de TLR4 ― nós empregamos a reticulação química de CA2 +/Zn2 + -pulsado recombinante S100A1216. A reticulação química de S100A12 diferentes condições iônicas snap-congela um estado momentâneo, incluindo várias formas oligoméricas que estão em transição. A partir de experimentos de titulação de íons, definimos condições as quais oligômeros Dimérico, tetramerico ou hexamérico poderiam ser determinados como os oligômeros predominantes16. Além disso, experimentos anteriores mostraram que um excesso de íons é benéfico para a reticulação comparável, estável e subsequente purificação, embora a oligomerização também possa ser induzida em concentrações de íons significativamente inferiores. No entanto, purificar esses oligômeros por cromatografia de exclusão de tamanho resulta em uma separação boa, mas não absoluta. Ainda assim, o enriquecimento seletivo dos oligômeros permite análises confiáveis a jusante.
Em resumo, este protocolo fornece um método para a purificação de S100A12 humano LPS-livre ou proteínas de ligação de cálcio relacionadas. Para corrigir as alterações conformacionais induzidas por íons, a reticulação química e a subsequente separação complexa por cromatografia de exclusão de tamanho é uma ferramenta útil para compreender a relevância da oligomerização proteica para processos biológicos a jusante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subvenções do programa de pesquisa médica inovadora intramural da faculdade de medicina da Universidade de Muenster (KE121201 a CK) e da Fundação alemã de pesquisa (DFG, Fo354/3-1 para D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
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