Summary
ここで提示されるプラスミドDNA送達およびアジェンジモグリア細胞標識のエレクトロポレーション方法は、成人ゼブラフィッシュテレンセファロンにおける。このプロトコルは、個々のエペンディモグリア細胞を視覚化し、トレースするための迅速かつ効率的な方法であり、遺伝子操作の広い範囲にエレクトロポレーションを適用するための新しい可能性を開きます。
Abstract
エレクトロポレーションは、細胞膜内に一時的な細孔を作り、透過性を高めるために電界を細胞に適用するトランスフェクション法であり、それによって異なる分子を細胞に導入することができます。本論文では、エレクトロポレーションを用いて、成体ゼブラフィッシュテレンセファロンの心室ゾーンに並ぶエペンディモグリア細胞にプラスミドを導入する。これらの細胞の一部は幹細胞特性を示し、ゼブラフィッシュ脳に新しいニューロンを生成します。したがって、神経新生および再生における彼らの役割を決定するためには、彼らの行動を研究することが不可欠です。エレクトロポレーションを介したプラスミドの導入は、単一のエペンディモグリア細胞の長期表示および追跡を可能にする。さらに、Cre recombinaseやCas9などのプラスミドを単一のエペンディモグリア細胞に送達することができ、遺伝子組み換えや遺伝子編集を可能にし、制御された自然な細胞の自律遺伝子機能を評価するユニークな機会を提供します。環境。最後に、この詳細な、ステップバイステップのエレクトロポレーションプロトコルは、多数の単一のエペンディモグリア細胞へのプラスミドの正常な導入を得るために使用される。
Introduction
ゼブラフィッシュは、刺し傷の損傷後の脳再生を調べる優れた動物モデルです。哺乳類と比較して、進化のはしごでは、ゼブラフィッシュのようなあまり進化した種は、一般的に構成的神経新生の高い率と成体神経幹細胞滞留のより広い領域を示し、全体で新しいニューロンの一定の生成につながります成人生活のほとんどの脳領域。この特徴は、ゼブラフィッシュが研究されたほとんどの脳損傷モデルで新しいニューロンを効率的に生成する顕著な可能性を有するように、哺乳類1と比較してゼブラフィッシュの著しく高い再生能力と相関しているように見える2、 3,4,5,6,7,8.ここでは、成人期に顕著な神経新生を有する脳領域であるため、ゼブラフィッシュテレンスファロンが研究される。成人神経新生のこれらのゾーンは、成人哺乳動物脳9、10、11における神経原ゾーンに相同である。
ゼブラフィッシュテレスファロン中の豊富な神経原領域は、細胞またはエペンディモリア細胞のような放射状グリアの存在に起因する。エペンディモグリア細胞は、常駐成人神経幹細胞として機能し、無傷および再生脳3、5の両方で新しいニューロンの生成を担当しています。系統トレース実験は、心室のエペンディモリアが傷害に反応し、増殖し、病変部位5に移行する新しい神経芽細胞を生成することを示している。ゼブラフィッシュテレスファロンの絶え間ない性質のために、エペンディモグリア細胞は心室表面に並び、心室壁を構築する。後部心室壁は、後頭形前形細胞層によって形成される(図1A)。重要なことに、ゼブラフィッシュエペンディモリアは、哺乳類の放射状グリアおよびエペンディマル細胞の両方の特性を具体化する。長い放射状プロセスは、放射状グリア細胞の典型的な特徴であるのに対し、細胞拡張およびタイトジャンクション(ならびにその心室位置)は、エペンディマル細胞12、13、14の典型的な特徴である。したがって、これらの細胞は、エペンディモグリア細胞と呼ばれる。
再生中の単一のエペンディモグリア細胞の生体内挙動に従うには、確実に標識する必要があります。蛍光顕微鏡検査用の生体内細胞標識における種々の方法は、内因性レポーターまたは親油性染料15など、以前に記載されている。これらの方法は、エレクトロポレーションとは対照的に、より長い期間の時間を必要とし、多くの場合、単一細胞標識または永久的な長期トレースの可能性を提供しない。しかし、エレクトロポレーションは(単一細胞標識の他に)、宿主細胞に新しいDNAを導入する可能性を提供する。また、細胞へのDNA移植の他の方法と比較して、エレクトロポレーションは、最も効率的な方法の一つであることが実証されている16、17、18、19。
ここで提示されるエレクトロポレーションプロトコルは、成体ゼブラフィッシュテレンセファロン中の単一のエペンディモグリア細胞を標識する目的で精製された。このプロトコルは、長期期間20にわたってそれらに従うか、または細胞自律的な方法で特定の経路を操作するために、単一のエペンディモグリア細胞の標識を可能にする21,22。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべての動物は、標準的な畜産条件の下で保持され、実験は、EUおよびアッパーバイエルン州政府(AZ 55.2-1-54-2532-0916)の取り扱いガイドラインおよび規制に従って行われました。
1. エレクトロポレーション用プラスミド混合物の調製
- 無菌水に関心のあるプラスミドを希釈し、速い緑色の汚れストック溶液[1mg/mL]を追加します。プラスミドの最終的な濃度が1 μg/μLであることを確認してください、 3%以下の濃度で染色を追加します。
- 準備したら、上下に数回ピペッティングするか、指タップでプラスミド溶液を混ぜます。使用するまで室温(RT)で保管してください。
注:2つのプラスミドを同じ細胞に同時にエレクトロポレーションする場合は、混合物に使用される個々のプラスミドの濃度が少なくとも0.8 ng/μLであり、モル比が1:1であることを確認し、80%~90%の共エレクトロポレーション効率を得ます。
2. 注入・エレクトロポレーション手順の準備
- 針引き装置での注射に必要なガラス毛細血管(外径1mm、内径0.58mm)を調製する。
- プラスミドの正しい量を注入するために(上記を参照)、2つの軽いと2つの重い重量で68.5 °Cの温度で毛細血管を引っ張る(引き手の仕様のための材料の表を参照)。
注:別の引き手を使用する場合は、キャピラリーをキャリブレーションして、適切な体積のエレクトロポレーションミックスを提供します。 - 手動で注入装置を200 hPaの注入圧力(ピノブを回すことによって)および0 hPaの一定圧力に設定する。手動で手動モードに注入時間を設定し、フットペダルで圧力を制御します。
- 54~57V(それぞれ1秒間隔で25ミリ秒)で5パルスの「LVモード」に設定します。電極をデバイスに接続します。
- きれいな魚の水で1つの魚のタンクを準備, 魚は、電気ポレーション手順の後に麻酔から目覚めされます.魚が完全に目覚めるまで、全体の回復期間の間、空気ポンプに取り付けられた空気石を維持することにより、水を通気します。
- 通常のキッチンスポンジを取り、注射とエレクトロポレーション手順中に魚を保持するためにスポンジに縦方向のカットを行います(前の出版物3を参照)。
注:潜在的な有毒化学物質を除去するために、キッチンスポンジを定期的に洗浄または交換する必要があります。 - 注射およびエレクトロポレーションのセットアップの隣に、導電性の高い多目的超音波ゲルを少量置きます。
注:これにより、十分な電気伝導性が確保され、その結果、テレスファロン全体に電気ポレートされた細胞が分布します。
3. ゼブラフィッシュ麻酔
- 麻酔の前に、蒸留水中で0.2%MS222で麻酔のストック溶液を調製し、Tris-HClバッファーでpHを7に調整します。このストックを1:10(すなわち、0.02%MS222に)魚水を使用して希釈します。
- 体とエラの動きが治まるまで、この作業溶液中に魚を麻酔します(通常、数分間)。
4. プラスミド溶液注入
- マイクロローダーの先端を使用してプラスミド溶液の10 μLで準備されたガラスキャピラリーを充填します。毛細血管内の気泡の形成を避けてください。
- インジェクションデバイスでメニュー/キャピラリーを押します。針ホルダーに針を挿入して固定します。
- 3.2倍または4倍の倍率の立体顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して毛細血管の先端だけをカットする。注入装置を変更キャピラリーモードから注入モードに切り替え、フットペダルで圧力を加えて、プラスミド溶液が針から簡単に動き、障害がないようにします。
- 産袋から麻酔液で容器(プラスチックボックス)に魚を移します。エラの動きが落ち着くまで数分待ちます。
- 魚を濡らしたスポンジの中に入れ、後ろ側を上に向けて置きます。手順の正確さを確保するために、立体顕微鏡の下で以下のすべての注入ステップを実行します。
- 40mmの刃先と厚さ0.5mmのステンレス鋼から解剖したマイクロナイフを使用して、視神経殻との境界のすぐ隣にあるテレンスファロン(図1B)の後側に魚の頭蓋骨に小さな穴を作ります。
注:このステップは、脳の損傷を避けるために、穴が非常に小さく、表面的で、頭蓋骨だけを貫通する必要があるため、慎重に行われるべきです。 - 必要に応じて魚を傾け、ガラス毛細血管の先端を正しい角度で頭蓋骨に向け、穴を通して毛細血管の先端の浸透を容易にします。
- 頭蓋の穴を通して毛細血管の先端を慎重に挿入し、心脳心室に到達します(図1Bを参照)。これは、後部前形細胞層を介した浸透を必要とします。脳組織との接触を避けるために毛細血管を深く挿入しないように特に注意してください。毛細血管を半球の間に正確に保ち、後部位のエピディマル層を突き刺した直後に心室内に残る。
注:これは非常にデリケートなステップです。この手順の精度は、真鍮24などの色素変異線を使用して改善され、注射中のガラス毛細血管位置のより良い可視化を可能にする。 - 心室の内側の毛細血管先端を用いて、約10sのフットペダルで圧力をかけてプラスミド溶液を注入し、約1μLのプラスミド溶液に相当する。
注:針の引き手、毛細血管または注入器を変更する場合は、常にプラスミド溶液の1 μLを提供するために、システムを校正する必要があります。較正は、鉱物油(例えば、パラフィン油)に排出されるプラスミド液滴の直径を測定し、その後液滴の体積を計算することによって行うことができる。10sの注射の後、鉱物油に排出されるプラスミド液体の〜1 μLがあるべきである。 - 心室全体に液体の広がりを観察することにより、前のステップの成功を確認してください。
5. エレクトロポレーション
- スポンジに入れたまま、注射セットから魚を取り出します。
- 電極の先端の内側を超音波ゲルに浸します。
- 少量の超音波ゲルで魚のテレンサロンをカバーします。
- 魚の頭部を電極の間に置き、魚の頭部の腹部側に正極を配置し、背側に負極を配置します(図1C)。これは、電気ポレートエペンディモリアに必要な電流の流れの方向を設定します。
- 電極をテレスファロンに対して穏やかに正確に押します(図1C)。フットペダルで電流を管理します。5つのパルスがすべて終わるまで、電極を所定の位置に保持します。
6. 魚の回復
- 魚は、それが目を覚ますまで、以前に準備された、継続的に通気タンクで回復してみましょう。リドカインゲルは、おそらく開発された痛みを和らげるために頭蓋骨に適用することができます。
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Representative Results
記載されたエレクトロポレーション法は、ゼブラフィッシュテレスファロンおよびちょうど後頭平形細胞層の下に表面的に位置するエピデンジモグリア細胞へのプラスミドDNAの送達を可能にする(図1A)。
エレクトロポレーションの結果が陽性の場合、標識された単一エペンディモグリア細胞(図2A、Bの赤色細胞)は、他のエペンディモグリア細胞の間で観察することができる(図2A、Bの白色)。エレクトロポレーションプロセスの効率に応じて、より高い(図2A)またはそれ以下の(図2B)エペンディモグリア細胞数を標識してもよい。それにもかかわらず、このプロトコルは、図3Aおよびビデオ1で明らかである、以前に公開された20よりも多くの標識細胞を得る。標識細胞の最も高密度は、注入されたプラスミド液体が半球間に分配する方法のために、両半球の内側、心室側(図3A)に主に出現する傾向があることは言及する価値がある。ビデオ1では、ゼブラフィッシュテレンセファロンの半球が3Dで提示され、放射状のプロセスを持つエペンディモグリア細胞が側面から見ることができます。細胞は、共電起され、2つのプラスミド、tdTomato-mem(細胞膜に固定された赤色蛍光タンパク質)およびH2B-YFPプラスミド(標識核)で標識される。黄色の円で囲まれた2つの核の細胞分裂に留意すべきである。
失敗したエレクトロポレーションは、非常に低い数または標識されたエペンディモグリア細胞で生じます。この結果は、一般的に、毛細血管の先端が背中の前平細胞層に浸透しない不正確な注射によって説明することができる。この場合、プラスミド溶液は、心脳心室を充填する代わりに、後頭平端細胞層の上に広がる。これにより、単に標識されるエペンディマル細胞が生じる(図3B)。ドーサル形質細胞(図3Bの青い矢印)は、エペンディモグリア細胞と形態的に異なる(図3Aの黄色の矢印)。彼らのソマは大きく、立方体であり、彼らは放射状の、細長いプロセスを持っていません。これは、エペンディモグリア細胞層の側面図を比較したことから明らかである(図4A,B)。TdTomato-mem標識細胞は、エペンディモリアの層の上に位置する最も可能性の高いエペンディマル細胞である(図4B)。これに対し、図4Aでは、プラスミドを発現するtdTomato-memが個々のエペンディモグリア細胞に導入される。したがって、彼らは最初の標識に加えてtdTomato-memを発現する(この場合、トランスジェニックgfap:GFP魚ライン、ここでは白で見られる)。
このプロトコルは、短い21または長期の3期間にわたって損傷した後のゼブラフィッシュテレスファロンにおけるエペンディモグリア細胞の挙動の標識およびその後のフォローを可能にする。これは、生体内イメージングを通じて達成され、再生と神経新生における彼らの役割の問題に対処するのに役立ちます.
図1:エバーテッドゼブラフィッシュテレンスファロンの冠状断面の概略表現。(A)ゼブラフィッシュテレンセファロンの冠状動脈セクションのスキームは、心室表面を裏打ちし、心室壁を構築しているエペンディモグリア細胞の位置を強調する。ドーサル形位素層は、2つの半球を橋渡しし、2つの細胞層の間に位置する心室(V)を覆っている:エペンディモグリアとエペンディマル。図 2および図 3に黒い矢印と目の表示を示します。(B)左のゼブラフィッシュヘッドの写真は、上から撮影し、白い破線でテレスファロンの位置を強調しています。ガラス毛細血管は、毛細血管挿入の標的部位と共に赤で描かれている。右の写真は、赤でプラスミド注射の位置を示すゼブラフィッシュ脳の概略図です。ガラス毛細血管はテレンスファロンに触れず、プラスミドは心室にテレンスファロンのすぐ上に注入されることに留意すべきである。T = テレンスファロン、OT =光学系。(C)左に描かれているのはゼブラフィッシュヘッド(側面図)の写真で、右側はテレンスファロンを標的にするために電極の位置を示す頭部(側面図)の描写である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:有効なエレクトロポレーション結果を示す顕微鏡写真。成体ゼブラフィッシュテレンセファロンにおける(A)より大きいまたは(B)より少ない数の電気起電型エペンジモグリア細胞の3次元表現は、上から見た。エレクトロポレーションは、すべてのエペンディモグリア細胞においてGFP蛍光タンパク質(白色で描かれた)を発現するTg(gfap:GFP)魚株で行った。個々の電ポレート細胞は、pCS2-tdTomato-memプラスミド3で標識されている。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成功したエレクトロポレーションと失敗したエレクトロポレーションの違いを示す共焦点顕微鏡写真。(A)多数のpCS-tdTomato-memを用いたBABBクリアゼブラフィッシュテレンセファロン(REF)の3次元共焦点画像を用いた。長く細長いプロセス(黄色の矢印)を持つエペンディモグリア細胞の形態に留意すべきである。黄色の破線で強調表示された両方のテレンスファリック半球が観察されます。(B)pCS2-tdTomato-memプラスミドの電ポレーションに失敗した共焦点画像。主に後頭形の表皮細胞が標識され、tdTomato-memプラスミドを発現するエペンディモグリア細胞はほとんどない。表記細胞(青い矢印)の形態の明らかな違いに注意する必要があります。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:電気起電および非電解エペンディモグリア細胞の3D横図。(A)三次元横表現電素電光は、Tg(gfap:GFP)およびpCS2-tdTomato-mem(黄色の矢印)の両方に対して陽性である。(B)失敗したエレクトロポレーションの3D横表現。Tg(gfap:GFP)エペンディモリア層の上のpCS2-tdTomato-mem陽性細胞の位置に留意すべきである。最も可能性の高い後膜形位膜層細胞は、電気ポレートされた(青い矢印)。スケールバー = 30 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:ゼブラフィッシュテレンセファロンと電ポレートされたエペンジモグリア細胞の3Dムービー。ビデオは、3Dでゼブラフィッシュテレンスファロンの1つの半球を示しています。エペンジモグリア細胞は、tdTomato-mem(細胞膜に固定された赤色蛍光タンパク質)とH2B-YFPプラスミド(標識核)の2つのプラスミドと共電する。別に観察することができる放射状のプロセスと個別にラベル付けされたエペンディモリア。黄色の円は、H2B-YFPラベルクロマチンによって視覚化された滑水性の数字を持つエペンディモグリア細胞を強調表示します。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
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Discussion
このエレクトロポレーションプロトコルは、個々のエペンディモグリア細胞を標識する生体内で信頼性の高い方法である。プロトコルは、ニューロンやオリゴデンドロサイトなどの他の細胞型にラベルを付けるために、さらなる適応が必要な場合があります。ラベリングを成功させるために、異なるプロモーターを含むプラスミドを使用することができます。チキンβアクチンプロモーターは、eF1α、CMVおよびユビキチンプロモーターが以前にエペンディモリアおよびその子孫23における異なるトランス遺伝子の発現を駆動するために使用されてきた。しかし、トランスジーン発現の異なる運動学が観察され、これは考慮に入れるべきである。例えば、CMVプロモーター駆動トランスジーン発現は非常に速い(発現は24時間後に見ることができた)が、eF1αは時間がかかる。標識とは別に、エレクトロポレーションプロトコルは、Cre recombinaseまたはCRISPR Cas9技術22を使用して遺伝子編集の高速かつ簡単なプラットフォームとして使用することができます。さらに、フリップカセット25-含有プラスミドおよび細胞型特異的Creラインにおけるそのエレクトロポレーションの使用は、後に生成された前駆体における標識または遺伝子編集を可能にする方法の明確な拡張として役立つかもしれないエレクトロポレーション。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。まず、注入工程中に、注入されたプラスミド量が個々の魚類に対して等しく、標識細胞の数が同等に等しいままであることを実験に注意する必要があります。これは、ガラスキャピラリー開口部のサイズを制御することによって達成することができ、各先端の切断は、異なるキャピラリー間で一定である必要があることを意味するか、キャリブレーションは、個々のキャピラリーごとに実行する必要があります。さらに、フットペダルによって調節される注入の持続時間は、個々の注入ごとに同じでなければならない。第二に、マイクロナイフで作られた頭蓋骨の穴の適切な位置は、テレンスファロン全体にプラスミド液体の適切な分散のために重要です。プロトコルに記載されているように、毛細血管先端を持つ後部形形形細胞層に浸透することは同様に重要である。また、プラスミド混合物と脳脊髄液がテレンスファロンから漏出するのを防ぐために、作成された穴が大きすぎないことも重要です。もう一つの重要なステップは、印加電流の強さです。電ポレーションデバイスが可能な限り正確に動作していることを確認することが重要です。これらの値が一貫していない場合は、推奨される54〜57Vより高い投与電流が魚の生存を損なう可能性があるため、エレクトロポレーション装置上の電流の強度を調整する必要がある。
この分野で一般的に使用されるプラスミド送達および細胞標識の他の方法と比較して、エレクトロポレーションは明らかな利点を有する。上記の重要なステップにもかかわらず、電化細胞が観察できないか、または後部代位細胞が誤って電気的に電化されることは非常にまれに起こります。一般的に、このエレクトロポレーションプロトコルの成功率は90%~95%であり、エレクトロポレーション後のTUNEL+細胞はほとんど観察しません。例えばリポフェクションとは対照的に、エレクトロポレーション中に、カチオン性リポソーム(例えば、リポフェクタミン)は使用されず、したがってその使用法に関連する毒性は完全に回避される26。脂肪離とエレクトロポレーションは、同じ効率率(テレンスファロン当たり20〜50細胞)27を有すると以前に報告された。しかし、この最適化されたプロトコルは、一般に、テレンスファロンあたり100〜200セルを生み出します。ウイルスベクターと比較して、バイオセーフティはエレクトロポレーションの問題ではない。
さらに、一般的に使用されるAAVまたはレンチウイルスは、ゼブラフィッシュ脳17、28におけるトランスジーンの検出可能な発現を生成することができない。最後に、Cre-loxシステムは、今日ゼブラフィッシュで一般的に使用されているが、プラスミドエレクトロポレーションは、魚の繁殖と成長に必要な長い待ち時間を必要とせず、個々の細胞の標識とトレースを可能にするので、より速いです。しかし、このような技術は、実験動物のエレクトロポレーションと高い生存率を達成するために高度に熟練した科学者を必要とします(我々は通常、約70%-80%の生存率を経験します)。この速度はまた、実験者によって変動する傾向がある。手順を学ぶには練習が必要で、通常は3回の試行が必要です。しかし、これは個人の手作業に依存し、場合によっては時間がかかることがあります。
提示されたエレクトロポレーションプロトコルは、最適な結果を得るために必要な予防措置を用いて多数のエペンディモグリア細胞を電気ポアする高速で非常に効率的な方法です。成体ゼブラフィッシュテレンセファロンのエレクトロポレーションは、個々のエペンディモグリア細胞を可視化し、神経新生および再生プロセスにおけるその役割を研究するために重要である。近年、エレクトロポレーションおよびStagR-Cas9技術22を介した遺伝子編集を介した成体ゼブラフィッシュテランセファロンの複数の遺伝子の同時破壊において成功が達成されている。これは遺伝子操作の広い範囲のためのエレクトロポレーションの多くの可能性および未来の適用を開く。
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Disclosures
著者は何も開示する必要はありません。
Acknowledgments
原稿の編集のためのジェームズ・コプティに特別な感謝。我々はまた、SFB 870とSPPによるドイツ研究財団(DFG)からのJNへの資金を感謝し、「オルファクションの統合分析」とSPP 1738「神経系の発達、可塑性および疾患における非コーディングRNAの新たな役割」、SPP1757グリアの異質性」、およびシステム神経学のためのミュンヘンクラスターの枠組みの中での卓越性戦略(EXC 2145 SyNergy – ID 390857198)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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