Summary
Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.
Abstract
Elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekler oluşturmak ve geçirgenliğini artırmak için hücrelere elektriksel bir alanın uygulandığı ve böylece hücreye farklı moleküllerin sokulmasını sağlayan bir transfeksiyon yöntemidir. Bu yazıda, elektroporasyon ependymoglial hücrelere plazmidler tanıtmak için kullanılır, hangi yetişkin zebrabalığı telencephalon ventriküler bölge hattı. Bu hücrelerin bir kısmı kök hücre özelliklerini gösterir ve zebra balığı beyninde yeni nöronlar üretir; bu nedenle, nörogenez ve rejenerasyon rollerini belirlemek için davranışlarını incelemek esastır. Plazmidlerin elektroporasyon yoluyla piyasaya sürülmesi, tek bir ependymoglial hücrenin uzun süreli etiketlemesini ve izlenmesini sağlar. Ayrıca, Cre rekombinaz veya Cas9 gibi plazmidler tek ependymoglial hücrelere teslim edilebilir, bu da gen rekombinasyonunu veya gen düzenlemesini sağlar ve hücrenin otonom gen fonksiyonunu kontrollü, doğal Ortam. Son olarak, bu ayrıntılı, adım adım elektroporasyon protokolü tek ependymoglial hücrelerin çok sayıda içine plazmidlerin başarılı giriş elde etmek için kullanılır.
Introduction
Zebra balığı bir bıçak yarası yaralanması sonra beyin rejenerasyon incelemek için mükemmel hayvan modelleri vardır. Memelilere kıyasla, evrim merdiveninde, zebra balığı gibi daha az gelişmiş türler genellikle daha yüksek kurucu nörogenez ve yetişkin nöral kök hücre ikamet alanlarının daha yüksek oranlarını göstererek, sürekli olarak yeni nöronların yetişkin hayatında en beyin alanları. Bu özellik memelilere göre zebra balığının önemli ölçüde daha yüksek rejeneratif kapasitesi ile ilişkili görünüyor1, zebra balığı verimli bir şekilde en beyin hasarı modellerinde yeni nöronlar oluşturmak için olağanüstü bir potansiyele sahip olduğu gibi2, 3,4,5,6,7,8. Burada, zebra balığı telensefalon çalışılır, yetişkinlikte belirgin nörogenezi olan bir beyin alanı olduğu için. Erişkin nörogenezin bu bölgeleri yetişkin memeli beyninde nörojenik bölgelere homolog vardır9,10,11.
Zebrabalığı telensefalon bol nörojenik alanlar hücreleri veya ependymoglia hücreleri gibi radyal glia varlığı nedeniyle mevcuttur. Ependymoglial hücreler yerleşik yetişkin nöral kök hücreleri olarak hareket ve bozulmamış ve yenileyici beyin hem de yeni nöronların nesil sorumludur3,5. Soy izleme deneyleri ventriküler ependymoglia yaralanmatepki göstermiştir, daha sonra çoğalır ve lezyon sitesine göç yeni nöroblastlar üretmek5. Zebrabalığı telensefalon everted doğası nedeniyle, ependymoglial hücreler ventriküler yüzey hattı ve ventral ventriküler duvar inşa. Dorsal ventriküler duvar dorsal ependimal hücre tabakası ile oluşur (Şekil 1A). Daha da önemlisi, zebra balığı ependymoglia hem memeli radyal glia ve ependymal hücrelerin özelliklerini somutlaştırmak. Uzun radyal süreçler radyal glia hücrelerinin tipik bir özelliğidir, hücresel uzantıları ve sıkı kavşaklar ise (yanı sıra ventriküler pozisyonlar) ependimal hücrelerin tipik özellikleri12,13,14. Bu nedenle, bu hücreler ependymoglial hücreler olarak adlandırılır.
Rejenerasyon sırasında tek ependymoglial hücrelerin in vivo davranışını takip etmek için, güvenilir bir şekilde etiketlenmiş olması gerekir. Floresan mikroskopi için in vivo hücre etiketleme çeşitli yöntemler daha önce tarif edilmiştir, endojen muhabirler veya lipophilic boyalar gibi15. Bu yöntemler, elektroporasyon aksine, daha uzun süre ler gerektirebilir ve genellikle tek hücre etiketleme veya kalıcı uzun vadeli izleme imkanı sunmuyoruz. Elektroporasyon, ancak (tek hücre etiketleme yanı sıra), konak hücreiçine yeni DNA girme imkanı sunuyor. Ayrıca, hücrelere DNA transferi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyon en verimli yöntemlerden biri olduğu gösterilmiştir16,17,18,19.
Burada sunulan yetişkin zebrabalığı telencephalon tek ependymoglial hücreleri etiketleme amacıyla rafine edilmiş bir elektroporasyon protokolüdür. Bu protokol, uzun vadeli bir süre20 onları takip etmek veya hücre özerk bir şekilde belirli yolları işlemek için tek ependymoglial hücrelerin etiketleme sağlar21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm hayvanlar standart hayvancılık koşullarında muhafaza edilmiş ve deneyler AB ve Yukarı Bavyera Hükümeti'nin (AZ 55.2-1-54-2532-0916) kullanım yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Elektroporasyon için Plazmid Karışımı hazırlanması
- Steril su ilgi plazmid seyreltmek ve hızlı yeşil leke stok çözeltisi ekleyin [1 mg/mL]. Plazmidin son konsantrasyonunun (1 μg/μL) olduğundan emin olun.
- Hazırlandıktan sonra, plazmid çözeltisini birkaç kez yukarı ve aşağı boruyla veya parmak dokunarak karıştırın. Kullanıma kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
NOT: Aynı hücreye iki plazmidin birlikte elektroporasyonu için, karışımda kullanılan her plazmidin konsantrasyonunun en az 0,8 ng/μL olduğundan ve molar oranının 1:1 olduğundan %80-90 eş elektroporasyon verimi elde edilmesini sağlayın.
2. Enjeksiyon ve Elektroporasyon Prosedürü Için Hazırlıklar
- İğne çekme aparatının enjeksiyonu için gerekli olan cam kılcal damarları (dış çap 1 mm, iç çap 0,58 mm) hazırlayın.
- Doğru miktarda plazmid enjekte etmek için (yukarıya bakınız), kılcal damarı 68,5 °C sıcaklıkta iki hafif ve iki ağır ağırlıkla çekin (çekmece spesifikasyonları için Malzeme Tablosu'na bakın).
NOT: Farklı bir çekmece kullanılması durumunda, uygun elektroporasyon karışımı hacmini sunmak için kılcal damarı kalibre edin. - Enjeksiyon cihazını 200 hPa enjeksiyon basıncına (Pi buzunu çevirerek) ve 0 hPa sabit basınca manuel olarak ayarlayın. Enjeksiyon süresini manuel modda manuel olarak ayarlayın ve ayak pedalı ile basıncı kontrol edin.
- Elektroporasyon cihazını 54-57 V'da beş darbeyle "LV moduna" ayarlayın (her biri 1 s aralıklı 25 ms). Elektrotları cihaza bağlayın.
- Temiz balık suyu ile bir balık tankı hazırlayın, burada balık elektroporasyon işleminden sonra anestezi den uyandırılacaktır. Balık tamamen uyanana kadar tüm kurtarma dönemi boyunca hava pompasına bağlı hava taşını tutarak suyu aerate.
- Düzenli bir mutfak süngeri alın ve enjeksiyon ve elektroporasyon işlemi sırasında içine balık tutmak için sünger uzunlamasına kesim yapmak (önceki yayın3bakınız).
NOT: Mutfak süngeri, potansiyel toksik kimyasalları gidermek için düzenli olarak yıkanmalı veya değiştirilmelidir. - Enjeksiyon ve elektroporasyon kurulum yanında son derece iletken çok amaçlı ultrason jel küçük bir miktar yerleştirin.
NOT: Bu yeterli elektrikiletkenlik sağlayacak, ve sonuç olarak, tüm telencephalon boyunca elektroporated hücrelerin dağılımı.
3. Zebrabalığı Anestezisi
- Anesteziden önce, distile suda %0,2 MS222 ile anestezi stok çözeltisi hazırlayın ve Tris-HCl tamponu ile pH'ı 7'ye ayarlayın. Balık suyunu kullanarak bu stoğu 1:10'u (yani %0,02 MS22'ye kadar) seyreltin.
- Vücut ve solungaçların hareketi (genellikle birkaç dakika için) yatışana kadar bu çalışma çözüm onları tutarak balık anestezik.
4. Plazmid Çözeltisi Enjeksiyonu
- Hazırlanan cam kılcal damarı mikroyükleyici uçlarını kullanarak 10 μL plazmid çözeltisi ile doldurun. Kılcal damar içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek.
- Enjeksiyon cihazında Menü/Değişiklik Kılcal damarına basın. İğneyi iğne tutucuya takın ve sabitle.
- 3.2x veya 4x büyütme ile bir stereomikroskop altında, ince uç forceps kullanarak kılcal sadece ucu kesti. Enjeksiyon cihazını Değişim Capillary modundan Inject moduna geçin, ardından plazmid çözeltisinin iğneden kolayca dışarı akmasını ve engel teşkil etmeden çalışmasını sağlamak için ayak pedalı ile basınç uygulayın.
- Balıkları hayvancılık tankından anestezik solüsyonla konteynere (plastik kutu) aktarın. Solungaçların hareketi dinilene kadar birkaç dakika bekleyin.
- Sırt tarafı yukarı bakacak şekilde önceden ıslak sünger içine balık yerleştirin. Prosedürün doğruluğunu sağlamak için stereomikroskop altında aşağıdaki enjeksiyon adımlarını gerçekleştirin.
- 40 mm kesme kenarı ve 0,5 mm kalınlığında paslanmaz çelikten bir kesme mikro-bıçak kullanarak, telencephalon arka tarafında balık kafatası küçük bir delik oluşturmak(Şekil 1B),optik tektum ile sınırın hemen yanında.
NOT: Delik çok küçük ve yüzeysel olmalıdır, beyin hasarı önlemek için, sadece kafatası nüfuz bu yana bu adım dikkatle yapılmalıdır. - Balığı gerektiği gibi yatırın ve cam kılcal damarUcunu doğru açıyla kafatasına doğru yönlendirerek kılcal ucun delikten nüfuz etmesini kolaylaştırın.
- Kılcal damar ucunu, telensefalik ventriküle ulaşana kadar dikkatlice kafatasındaki delikten geçirin (Bkz. Şekil 1B). Bu dorsal ependymal hücre tabakası ile penetrasyon gerektirir. Özellikle beyin dokusu ile temas önlemek için çok derin kılcal sokmak için dikkatli olun. Sadece dorsal ependymal tabakası piercing sonra ventrikül içinde kalan, hemisfer arasında tam olarak kılcal tutun.
NOT: Bu çok hassas bir adım. Bu prosedürün doğruluğu pirinçgibi pigmentasyon mutant hatları kullanılarak geliştirilmiş24, enjeksiyon sırasında cam kılcal pozisyonudaha iyi görselleştirme sağlayan. - Ventrikül içinde kılcal ucu ile, yaklaşık 1 μL plazmid çözeltisi karşılık gelen yaklaşık 10 s, ayak pedalı ile basınç uygulayarak plazmid çözeltisi enjekte.
NOT: İğne çekmecesi, kılcal damarlar veya enjektör değiştirilmelidir, sistem her zaman 1 μL plazmid çözeltisi sunmak için kalibre edilmelidir. Kalibrasyon, bir mineral yağa (örneğin, parafin yağı) atılan plazmid damlacığının çapının ölçülmesi ve daha sonra damlacık hacminin hesaplanması ile gerçekleştirilebilir. 10 s enjeksiyondan sonra mineral yağa ~1 μL plazmid sıvısı atılmalıdır. - Ventrikül boyunca sıvı yayılmasını gözlemleyerek önceki adımın başarısını onaylayın.
5. Elektroporasyon
- Hala sünger tutarak enjeksiyon kurulum balık çıkarın.
- Ultrason jel elektrotların ucuiç tarafı batırın.
- Ultrason jel küçük bir miktar ile balık telencephalon kapağı.
- Balık kafasını elektrotlar arasına yerleştirin, pozitif elektrotı balığın başının ventral tarafına ve negatif elektrotu sırt tarafına yerleştirerek(Şekil 1C),balığın vücudunu süngerde tutarken. Bu subventriküler bölgede konumlandırılmış elektroporate ependymoglia için gerekli akımın yönünü ayarlar.
- Elektrotları telensefalona hafifçe ve hassas bir şekilde bastırın (Şekil 1C). Akımı ayak pedalı ile uygulayın. Beş darbe bitene kadar elektrotları yerinde tutun.
6. Balık Kurtarma
- Balıklar uyanana kadar önceden hazırlanmış, sürekli olarak temize çıkarılan tankta iyileşsin. Lidokain jel herhangi bir muhtemelen gelişmiş ağrı rahatlatmak için kafatası üzerinde uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan elektroporasyon yöntemi, zebrabalığı telensefalonsunda yüzeysel olarak bulunan ve dorsal ependymal hücre tabakasının hemen altında bulunan plazmid DNA'sının ependymoglial hücrelere ulaştırılmasını sağlar (Şekil 1A).
Elektroporasyon sonucu pozitif ise, etiketli tek ependymoglial hücreler (Şekil 2A,B'dekikırmızı hücreler) diğer ependymoglial hücreler arasında görülebilir (Şekil 2A,B'debeyaz). Elektroporasyon sürecinin etkinliğine bağlı olarak, ependymoglial hücrelerin daha yüksek(Şekil 2A)veya daha düşük(Şekil 2B)sayısı etiketlenebilir. Bununla birlikte, bu protokol daha önce yayınlanan20daha etiketli hücrelerin daha yüksek sayıda verir , Şekil 3A ve Video 1belirgindir. Bu etiketli hücrelerin en yüksek yoğunluğu çoğunlukla her iki hemisferin iç, ventriküler tarafında ortaya eğilimindedir belirtmeye değer(Şekil 3A),enjekte plazmid sıvı hemisferler arasında dağıtır şekilde nedeniyle. Video 1'de, zebrabalığı telensefalonunun bir hemisferi 3Boyutlu olarak sunulur ve radyal prosese sahip ependymoglial hücreler yandan görülebilir. Hücreler birlikte elektroporated ve iki plazmid, tdTomato-mem (kırmızı floresan protein hücre zarına demirlemiş) ve H2B-YFP plazmid (etiketleme çekirdekleri) ile etiketlenir. Sarı dairelerle çevrili iki çekirdeğin hücre bölünmesi not edilmelidir.
Başarısız elektroporasyon çok düşük sayıda veya hiç etiketli ependymoglial hücreleri ile sonuçlanır. Bu sonuç genellikle kapiller ucu dorsal ependimal hücre tabakası nüfuz etmez yanlış enjeksiyon ile açıklanabilir. Bu durumda plazmid çözeltisi telensefalik ventrikül doldurmak yerine dorsal ependimal hücre tabakasının üzerine yayılır. Bu da ependimal hücrelerin sadece etiketlenmelerine yol açar (Şekil 3B). Dorsal ependymal hücreler (Şekil 3B'dekimavi oklar) ependymoglial hücrelerden morfolojik olarak farklılık gösterir (Şekil 3A'dasarı ok). Onların soma büyük ve kübik, ve radyal, uzun süreçler esahip değildir. Bu durum, ependymoglial hücre tabakasının yan görünümünü karşılaştırarak belirgindir (Şekil 4A,B). TdTomato-mem etiketli hücreler büyük olasılıkla ependymoglia tabakasının üzerinde bulunan ependymal hücrelerdir (Şekil 4B). Buna karşılık, Şekil 4A'da plazmidi ifade eden bir tdTomato-mem bireysel ependymoglial hücrelere tanıtılır. Böylece, tdTomato-mem ilk etiketleme (bu durumda, transgenik gfap:GFP balık hattı, burada beyaz görülen) ek olarak ifade.
Bu protokol, kısa-21 veya uzun süreli3 süre boyunca yaralanma sonrası zebrabalığı telensefalon'daki ependymoglial hücrelerin in davranışını etiketlemeyi ve sonraki takibini sağlar. Bu canlı yoluyla gerçekleştirilir, in vivo görüntüleme ve rejenerasyon ve nörogenez rollerinin soru ele yardımcıolur.
Şekil 1: Everted zebrabalığı telensefalon koronal bölümünün şematik gösterimi. (A) Zebra balığı telencephalon bir koronal bölümünün şeması, ependymoglial hücrelerin konumunu vurgulayarak, hangi ventriküler yüzey astar ve ventral ventriküler duvar bina. Dorsal ependimal tabaka iki hemisfer köprü ve ventrikül kapsayan (V), iki hücre tabakası arasında bulunan: ependymoglial ve ependymal. Siyah ok ve gözün gösterimi Şekil 2 ve Şekil 3'tegösterilmektedir. (B) Solda, zebra balığı kafasının yukarıdan çekilmiş bir fotoğrafı, telensefalonun beyaz kesik çizgili bir çizgiile konumunu vurgular. Bir cam kılcal damar kırmızı tasvir edilir, kılcal ekleme için hedef site ile birlikte. Sağdaki resimde kırmızı plazmid enjeksiyonkonumunu gösteren zebra balığı beynin bir şema olduğunu. Bu cam kılcal telensefalon dokunmaz ve plazmid ventrikül içine telencephalon hemen üzerinde enjekte olduğunu unutulmamalıdır. T = telensefalon, OT = optik tektum. (C) Solda zebra balığı başının bir fotoğrafı (yan görünüm) ve sağda telensefalon hedef için elektrotların konumunu gösteren baş (yan görünüm) bir tasviri dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Etkili elektroporasyon sonuçlarını gösteren mikrograflar. A üç boyutlu gösterimi (A) daha büyük veya (B) yetişkin zebrabalığı telensefalon elektroporated ependymoglial hücrelerin daha az sayıda, yukarıdan bakıldığında. Elektroporasyon Tüm ependymoglial hücrelerde GFP floresan proteini (beyaz olarak tasvir) ifade eden Tg(gfap:GFP)balık hattında yapıldı. Bireysel elektroporated hücreler pCS2-tdTomato-mem plazmid3ile etiketlenir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Başarılı ve başarısız elektroporasyon arasındaki farkı gösteren konfokal mikrograflar. (A) BABB-temizlenmiş zebra balığı telencephalon üç boyutlu konfokal görüntü (REF) pCS-tdTomato-mem elektroporated ependymoglial hücrelerin çok sayıda. Uzun, uzamış proseslere (sarı oklar) sahip ependymoglial hücrelerin morfolojisi not edilmelidir. Her iki telensefalik hemisfer, sarı kesik çizgiler ile vurgulanan, görülebilir. (B) pCS2-tdTomato-mem plazmidin başarısız elektroporasyonunun konfokal görüntüsü. Çoğunlukla dorsal ependymal hücreler etiketli, ve birkaç ependymoglial hücreleri tdTomato-mem plazmid ifade. Ependimal hücrelerin (mavi oklar) morfolojisindeki açık fark unutulmamalıdır. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Elektroporated ve non-elektroporated ependymoglial hücrelerin 3D lateral görünümleri. (A) Üç boyutlu lateral temsil elektroporated ependymoglial hücreler, hem Tg için pozitif(gfap:GFP)ve pCS2-tdTomato-mem (sarı ok). (B) Başarısız elektroporasyonun 3Boyutlu lateral gösterimi. PCS2-tdTomato-mem pozitif hücrelerinTg(gfap:GFP)üzerindeki ependymoglia tabakasının yeri not edilmelidir. Büyük olasılıkla dorsal ependymal tabaka hücreleri elektroporated (mavi ok) idi. Ölçek çubukları = 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Zebra balığı telencephalon ve elektroporated ependymoglial hücrelerin 3D film. Video 3D zebrabalığı telencephalon bir yarımkürede gösterir. Ependymoglial hücreler iki plazmid ile birlikte elektroporated: tdTomato-mem (hücre zarına demirlemiş kırmızı floresan protein) ve H2B-YFP plazmid (etiketleme çekirdekleri). Tek tek kenara gözlemlenebilir radyal süreçleri ile ependymoglia etiketli. Sarı daireler, H2B-YFP tarafından görselleştirilen kromatin etiketli ependymoglial hücreyi vurgular. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu elektroporasyon protokolü tek tek ependymoglial hücreleri etiketleme güvenilir bir in vivo yöntemidir. Protokol nöronlar veya oligodendrocytes gibi diğer hücre tipleri etiketlemek için daha fazla adaptasyon gerekebilir. Başarılı etiketleme elde etmek için, farklı organizatörler içeren plazmidler kullanılabilir. Tavuk-beta aktin organizatörü, eF1alpha, CMV ve ubikitin organizatörü daha önce ependymoglia farklı transgenlerin ekspresyonu ve onların döl23sürücü için kullanılmıştır . Ancak transgen ekspresyonunun farklı kinetikleri gözlenmiştir. Örneğin, CMV promotör tahrikli transgen ekspresyonu çok hızlıdır (ifade 24 saat sonra görülebilir), eF1alpha ise daha uzun sürer. Etiketleme nin yanı sıra, elektroporasyon protokolü Cre rekombinaz veya CRISPR Cas9 teknikleri22kullanımı ile gen düzenleme hızlı ve basit bir platform olarak kullanılabilir. Ayrıca, flip-kasetkullanımı 25-plazmidler içeren ve hücre tipine özgü Cre hatlarında elektroporasyon sonra oluşturulan ependymoglial döl etiketleme veya gen düzenleme sağlayan bir yöntemin açık bir uzantısı olarak hizmet edebilir elektroporasyon.
Bu protokolün birkaç kritik adımı vardır. İlk olarak, enjeksiyon adımı sırasında, enjekte plazmid miktarı her bir balık için eşit olduğunu dikkatli olmak gerekir, etiketli hücrelerin sayısı nispeten benzer kalır gibi. Bu cam kılcal açıklık boyutu kontrol edilerek elde edilebilir, her ucun kesim farklı kılcal damarlar arasında sabit olması gerektiği anlamına gelir veya kalibrasyon her bir kılcal için yapılmalıdır. Ayrıca, enjeksiyon süresi, bir ayak pedalı tarafından düzenlenir, her bir enjeksiyon için aynı olmalıdır. İkinci olarak, mikro bıçak ile yapılan kafatasında bir delik uygun konumu telencephalon boyunca plazmid sıvı uygun dağılım için çok önemlidir. Protokolde belirtildiği gibi, kılcal uç ile dorsal ependimal hücre tabakasınüfuz eşit derecede önemlidir. Ayrıca, oluşturulan delik telorta karışımı ve beyin-omurilik sıvısı telensefalon dışarı sızıntı önlemek için çok büyük olmaması da önemlidir. Bir diğer kritik adım da uygulanan elektrik akımının gücüdür. Elektroporasyon cihazının mümkün olduğunca hassas bir şekilde çalıştığından emin olmak önemlidir, çünkü uygulanan akımın mukavemeti ekranda beliren gerilimden çok fazla sapmaz, ki bu her zaman doğru değildir. Bu değerler tutarlı değilse, elektroporasyon cihazındaki akımın mukavemetini ayarlamak gerekir, çünkü önerilen 54-57 V'den daha yüksek bir akım balıkların hayatta kalmasını tehlikeye atabilir.
Plazmid teslimatı ve yaygın olarak bu alanda kullanılan hücre etiketlemesi için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyonun belirgin avantajları vardır. Yukarıda bahsedilen kritik adımlara rağmen, çok nadiren hiçbir elektroporated hücreleri gözlemlenebilir veya dorsal ependymal hücreleri yanlışlıkla elektroporated olur. Genel olarak bu elektroporasyon protokolünün başarı oranı %90-95 olup, elektroporasyon sonrası neredeyse hiç TUNEL+ hücresi gözlemlemeyiz. Örneğin lipofection'ın aksine, elektroporasyon sırasında katyonik lipozomlar (örneğin, lipofektamin) kullanılmaz ve bu nedenle kullanımı ile bağlantılı toksisite tamamen kaçınılır26. Daha önce lipofection ve elektroporasyon eşit verimlilik oranları (20-50 hücre telensefalon başına)27olduğu bildirilmiştir. Ancak, bu optimize protokol genellikle telencephalon başına 100-200 hücre verir. Viral vektörler ile karşılaştırıldığında, biyogüvenlik elektroporasyon ile ilgili bir sorun değildir.
Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan AAVs veya lentiviruses zebrafish beyin17,28transgenlerin tespit edilebilir ifade üretmek için başarısız . Son olarak, Cre-lox sistemi günümüzde yaygın olarak zebra balıklarında kullanılmasına rağmen, plazmid elektroporasyonu balık yetiştiriciliği ve büyümesi için gerekli uzun bekleme sürelerini gerektirmediği ve bireysel hücre etiketlemeve izleme olanağı sağladığı ndan daha hızlıdır. Ancak, böyle bir teknik başarılı elektroporasyon ve deneysel hayvanların yüksek sağkalım oranları elde etmek için son derece yetenekli bilim adamları gerektirir (biz genellikle ~ 70% -80%) sağkalım oranları deneyim. Bu oran aynı zamanda deneyciye bağlı olarak dalgalanma eğilimindedir. Yordamı öğrenmek pratik gerektirir ve genellikle üç deneme gerektirir. Ancak, bu bireyin el becerisine bağlıdır ve bazı durumlarda daha uzun sürebilir.
Sunulan elektroporasyon protokolü, çok sayıda ependymoglial hücrenin en iyi sonuçları elde etmek için gerekli önlemlerle elektroporating için hızlı ve son derece verimli bir yöntemdir. Erişkin zebra balığı telensefalisinin elektroporasyonu, bireysel ependymoglial hücrelerin görselleştirilmesi ve nörogenez ve rejenerasyon süreçlerindeki rollerinin incelenmesi için çok önemlidir. Son zamanlarda, başarı elektroporasyon ve StagR-Cas9 teknikleri22ile gen düzenleme yoluyla yetişkin zebrabalığı telencephalon birden fazla genin eşzamanlı bozulma elde edilmiştir. Bu genetik manipülasyonlar geniş bir yelpazede için elektroporasyon birçok olasılık ve gelecekteki uygulamalar açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
James Copti'ye el yazmasının düzenlenmesi için özel teşekkürler. Ayrıca SFB 870 ve SPP "Integrative Analysis of Olfaction" ve SPP 1738 "Sinir sistemi gelişiminde kodlamayan RNA'ların ortaya çıkan rolleri" spp1757 tarafından Alman Araştırma vakfından (DFG) JN'ye yapılan finansmanı minnetle kabul ediyoruz. Glial heterojenlik", ve Mükemmellik Stratejisi Münih Küme Sistemleri Nöroloji (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
