Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.
Abstract
La surface oculaire (OS) se compose d'une feuille épithéliale avec trois parties reliées : conjonctive palpébrale, conjonctive bulbar et épithélium cornéen. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Dans les modèles animaux expérimentaux avec certaines modifications génétiques ou opérations artificielles, il est utile d'examiner toutes les parties de la feuille épithéliale OS pour évaluer les changements pathogénétiques relatifs de chaque partie en parallèle. Cependant, la dissection du tissu d'OS dans son ensemble sans distorsion ou dommages a été difficile, principalement en raison de la douceur et la minceur de l'OS apposé sur les paupières physiquement séparées mais mobiles et globe oculaire. En outre, la douille oculaire profonde formée par le crâne dur / os orbitaux est entièrement occupé par le globe oculaire laissant un espace limité pour l'exploitation des dissections. En conséquence, la dissection directe du globe oculaire avec les tissus associés os du côté facial conduirait souvent à des dommages de tissu, particulièrement la conjonctive palpébrale et bulpale. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement d'une tête de souris coupée en deux, laissant des paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tout à fait en une seule pièce. L'intégrité de la feuille d'OS était bien préservée et pouvait être examinée par histologie ou immunostaining dans une seule section.
Introduction
La surface oculaire se compose d'une feuille continue d'épithélium régionalisé comprenant la conjonctive palpébrale, la conjonctive bulbar et la cornée1. Beaucoup de structures glandulaires sont associées à l'épithélium de surface oculaire et génèrent ensemble une couche de film lacrymal protégeant la surface de cornée du séchage et des invasions environnementales2. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Les facteurs génétiques et les irritants environnementaux ou leurs interactions contribuent à des altérations pathologiques de l'OS3,4. En conséquence, une variété de modèles animaux génétiquement modifiés et d'origine physique ou chimique ont été utilisés pour étudier les processus de la maladie de l'OS humain.
La structure et la fonction de l'OS de souris est similaire à celle des humains à bien des égards. Les composants du film lacrymal sécrétépar par les glandes oculaires sont également similaires entre les souris et les humains. Une multitude d'études a été menée à l'aide de modèles murins pour élucider les mécanismes des maladies humaines OS5,6,7. Dans de nombreuses occasions, il est essentiel d'analyser les changements moléculaires globaux au lieu des changements moléculaires locaux de l'OS pour obtenir des informations complètes sous le même traitement expérimental. Par conséquent, la préparation de l'échantillon avec une bonne intégrité est nécessaire pour s'assurer que chaque partie du système d'exploitation doit être analysée simultanément.
Le système d'exploitation de souris s'associe étroitement avec le globe oculaire qui a été incorporé dans la prise/orbite d'oeil (une tasse osseuse faite de plusieurs os différents de crâne) et se connecte à lui par des tissus conjonctifs minces. Il existe d'énormes défis pour disséquer toute la surface oculaire sans endommager la conjonctive palpébrale ou bulbe. Ces défis descendent de: (i) l'OS est doux et mince et apposé sur les paupières et les globes oculaires physiquement séparés mais mobiles, donc vulnérables pour la distorsion et les dommages; et (ii) l'espace limité entre les os orbitaux et le globe oculaire limitent les opérations de dissection. Les défis sont beaucoup plus grands pour la souris adulte. Chez la souris embryonnaire, l'ossification orbitale osseuse n'est pas complète et les tissus environnants sont relativement lâches8. La tête peut être enlevée et coupée en deux, puis directement soumise à la fixation du paraformaldéhyde (PFA) et à l'intégration9. En revanche, les os orbitaux postnatals et adultes de souris sont entièrement ossifiés avec les tissus environnants épais, rendant la pénétration des fixatifs moins efficace. En outre, les os orbitaux/crâne sont durs et cassants, facilement cassés en les sectionnant dans les composés mous d'embedding tels que la paraffine. Les morceaux cassés d'os déchireront unanimement les tissus voisins ayant pour résultat la morphologie inférieure de tissu.
Beaucoup d'études éditées ont souvent montré la surface oculaire partielle, qui peut être suffisante pour leurs buts particuliers de recherche10,11. Un examen brut des littératures a trouvé seulement peu d'études montrant la surface oculaire intacte entière étant démontrée sans description détaillée des protocoles de dissection12,13. Dans ce protocole, nous avons détaillé une méthode de dissection pour obtenir la surface oculaire postnatale intégrale, dans laquelle les os orbitaux et de crâne ont été ordonnés enlevés, laissant la surface oculaire intacte avec le globe oculaire et les paupières, minimisant les dommages physiques. Nous avons examiné en outre l'histologie d'OS et avons exécuté l'immunohistochimie utilisant les sections de tissu préparées avec ce protocole.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant l'utilisation de souris ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux, zhongshan Ophthalmic Center, et ont adhéré à l'énoncé ARVO pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Dissection du globe oculaire avec la surface oculaire intacte et les paupières
- Disséquer la tête.
- Euthanasier les souris postnatales 10 (P10) et P28 (voir le Tableau des matériaux pour les souches de souris) par luxation cervicale, couper la tête du cou par une paire de ciseaux pointus.
- Tête de bisect avec une paire de ciseaux droits le long de la ligne médiane sagittale commençant à l'os interpariétal rostalement au nasillard (Figure 1A,B).
REMARQUE: L'os du crâne durcit avec le vieillissement de la souris, attention à garder les ciseaux de coupe le long de la ligne médiane autant que possible. - Placer chaque moitié de la tête coupée dans un plat Petri propre, couper la mâchoire et la langue d'abord à l'aide de ciseaux pointus. Libérez le nerf optique en le coupant du cerveau avant l'emplacement du chiasme optique, et enlevez tous les tissus cérébraux, y compris l'ampoule olfactive attachée à la paroi du crâne.
- Maintenant, les tissus restants doivent avoir tous les os du crâne / orbitale associée à la globe oculaire (Figure 1C,D). Laver la partie restante avec PBS pour nettoyer le sang et les débris de cheveux.
- Préfixe des tissus avec 4% de paraformaldéhyde (PFA, en saline tamponnée de phosphate [PBS], pH 7.4) dans un tube conique de 50 ml à température ambiante (RT) avec rotation. Le temps de fixation approximatif est le suivant : 10 min pour P0 à P7 ; 20 min pour P8 à P28; et 30 min pour P29 et plus.
REMARQUE : La préfixation offre la rigidité de tissu rendant la dissection suivante plus facile. En outre, la préfixation évite de laisser les tissus frais non fixés trop longtemps avant que la dissection soit terminée.
CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin.
- Enlever le crâne/les os orbitaux.
- Après la préfixation, lavez rapidement la tête disséquée dans PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs afin de procéder à une dissection ultérieure.
CAUTION: L'exposition aux fixatifs pendant la dissection peut être préjudiciable à la santé. - Placez le tissu dans un plat Petri de 10 cm, coupez le crâne en trois parties le long des plans indiqués dans la figure 1D, E. Le globe oculaire dans la douille est caché dans la partie centrale du crâne sous les os éthmoïdes, frontaux et maxillaires (Figure 1D,E).
- Utilisez deux paires de forceps droits no 4 pour décoller l'os éthmoïde afin d'exposer pleinement les os frontaux et maxillaires (Figure 1F).
- Diviser géographiquement la surface du crâne (y compris les os maxillaires et les os frontaux) en 4 zones (figure 1F). Insérer l'extrémité des forceps incurvés horizontalement dans chaque zone pour enlever les os maxillaires et frontaux de façon séquentielle (Figure 1F).
REMARQUE : Les os maxillaires ne peuvent pas tous être enlevés en même temps. Disséquez patiemment les pièce par pièce. L'os frontal est directement relié au globe oculaire par des tissus conjonctifs mous. Soyez prudent lorsque vous le retirez du globe oculaire pour éviter d'étirer le globe oculaire et d'endommager la conjonctive. - Après l'ablation de l'os maxillaire partiel et de tous les os frontaux, les os lacrymaux et jugal sous-jacents seraient exposés (Figure 1G). Enlever les deux os et les muscles sous-cutanés et les graisses qui entourent le globe oculaire, couper le globe oculaire avec les paupières et la peau attachées dans un petit bloc de forme carrée pour réduire le volume des tissus et faciliter l'orientation du tissu lors de l'intégration(figure 1 H).
- Placez le globe oculaire et les tissus associés dans 4 % de PFA et continuez à fixer toute la nuit à 4 oC. Le tissu fixe peut être conservé pendant au moins un mois à 4 oC en PBS avec l'ajout de 0,02% NaN3. Alternativement, procéder à l'analyse histologique immédiatement.
REMARQUE : Si le tissu doit être stocké pendant de plus longues périodes, il peut facilement être stocké dans 70% d'éthanol.
- Après la préfixation, lavez rapidement la tête disséquée dans PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs afin de procéder à une dissection ultérieure.
2. Analyse histologique
- Section de paraffine et hématoxylin et éosine (H et E) coloration
- Suivez le protocole standard décrit ailleurs9 pour effectuer l'encastrage et la sectionnement de paraffine.
- Immunohistochimie (IHC)
- Décire les sections de paraffine avec xylène et réhydrater les sections par série d'alcool (100%, 95%, 80%) dans l'eau distillée (dH2O).
- Effectuer la récupération d'antigène par le traitement par micro-ondes des diapositives de tissu dans un tampon d'acide citrique de 0,01 M (3 g de citrate trisodique, 0,4 g d'acide citrique par 1 L double distillé H2O) dans un pot de glissière en verre à faible puissance (120 W). L'énergie doit être livrée par intermittence pendant un total de 5-10 min avec chaque intervalle d'une durée d'environ 2 min.
REMARQUE : Le micro-ondes de haute puissance ou le chauffage constant conduirait au détachement des sections de tissu de la glissière. - Choisissez les diapositives dans un bocal en verre, essuyez soigneusement le liquide résiduel entourant chaque section à l'aide de tissus faciaux et placez-les sur le porte-diapositives dans une boîte d'histologie. Dessinez un carré autour de chaque section avec un stylo histologique imperméable à l'eau. Placer 100 l de tampon de blocage (0,1 % de triton X-100 et 10 % de sérum d'âne dans 1 x PBS) sur chaque carré, et couver pendant 30 min à RT.
- Retirez soigneusement la solution de blocage avec le vide, ajoutez l'anticorps primaire (voir le tableau des matériaux)avec la dilution désirée dans le tampon de blocage, et continuez à couver les diapositives à 4 oC pendant 24 h ou plus.
REMARQUE : La concentration de chaque anticorps primaire utilisé pour le CSI varie et doit être testée dans le le but d'effectuer des expériences pilotes. - Laver les lames de tissu avec pBST (0,1% Triton en PBS) trois fois, pendant 10 min chacun. Répétez l'étape 2.2.4 à l'aide de l'anticorps secondaire (voir Tableau des matériaux) avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) remplaçant le tampon de blocage. Continuer à couver pendant au moins 4 h ou plus à température ambiante (RT).
- Retirer l'anticorps secondaire, laver les sections de tissu avec la solution PBST trois fois, pendant 10 min chacun, puis laver avec du PBS propre pendant encore 5 min.
- Essuyez les sections résiduelles de PBS entourant les tissus, montez les couvertures sur les sections avec le milieu de montage. Effectuer une microscopie fluorescente pour obtenir des images (voir le Tableau des matériaux).
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Representative Results
Les principaux os du crâne vus sous différents angles ont été illustrés dans la figure 1A-E, avec des couleurs dénotant différents os. Nous avons utilisé un animal de quatre semaines pour la démonstration des processus de dissection. Après les étapes de dissection 1.1.1-1.1.3 et une préfixation courte (étape 1.1.4), le globe oculaire avec les os faciaux associés sont démontrés dans la figure 1E. D'autres coupes pour enlever les os antérieurs (nasal et prémaxillaire) et postérieurs (p. ex., pariétal) ainsi que les os éthmoïdes ont généré un bloc tissulaire avec principalement des os maxillaires et frontaux au sommet du globe oculaire (figure 1F). L'ablation séquentielle de ces os selon les zones désignées de la figure 1F a exposé les os lacrimalins et jugal sous-jacents ainsi que la glande Harderin (Figure 1G). La glande Harderin attachée au globe oculaire a servi de repère (Figure 1G), et doit être maintenue en place en tout temps. L'isolement du globe oculaire a été complété par l'ablation de tous les os et des graisses et tissus musculaires environnants (Figure 1H).
Après l'encastrement de la paraffine, le globe oculaire a été sectionné et taché de H et E. Les images représentatives sont affichées à la figure 2. Les positions relativement intactes des paupières, de la surface cornéenne et conjonctive ont été visualisées dans une section (figure 2A),dont certaines parties ont été agrandies à la figure 2B,C. La morphologie de la lentille est difficile à maintenir (Figure 2A) en raison de sa rigidité et de sa fragilité. Nous avons appliqué cette méthode de dissection à d'autres âges postnatals et avons montré un exemple d'histologie de H et E de la section de globe oculaire de P10 (figure 3). En général, plus la souris est jeune, meilleure est la morphologie du globe oculaire. Les sections de paraffine immunostained des âges postnatals de série sont montrées dans la figure 4, avec la kératine 12 (K12) ( figure4A-F) et la kératine 14 (K14) (figure 4G-L) tacher la cornée et l'épithélium entier d'OS, respectivement.
Figure 1 : Illustration de la dissection de globe oculaire dans la souris adulte de 4 semaines. (A-D) Le diagramme schématique de la composition du crâne vu du haut (A), du bas (B), du côté (C) et du plan moyen (D), respectivement. Les lignes en pointillés dans (A) et (B) indiquent des plans coupés en deux. (E) Crâne de demi-biséqué à l'âge de 4 semaines qui correspond exactement (D). (F) Vue médiale du tissu disséqué entre les deux plans transversaux dans (D) et (E). Le globe oculaire (cercle en pointillé) était principalement encastré sous le front (Fron) et le maxillaire (Max). Les lignes pointillées colorées divisent géographiquement le plan coupé en 4 zones, dans lesquelles les os ont été grossièrement enlevés selon l'ordre ou les nombres. Notez que l'os ethmoïde (Eth) a été enlevé. (G) Après l'ablation des os frontaux et maxillaires partiels, la glande de Harderin (Har) et les os de jugal (Jug) et lacrimal (La) ont été exposés. Les lignes pointillées de cercle indiquent la position de globe oculaire. (H) Globe oculaire isolé vu de l'intérieur après la dissection terminée. Flèche pointe vers le nerf optique (On). E - Oeil, Na , Nasal, Prémaxilla, Maxillary, La , Lacrimal, Fron - Frontal, Ali - Alisphenoid, Jug - Jugal, Pal , Palatine, Ptery - Pterygoid, Squamosal, Parietal, Eth - Ethmoid. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Histologie de H et E du tissu oculaire de surface à l'âge de 4 semaines postnatal. (A) Les paupières, la conjonctive et la cornée sont visualisées dans une section tissulaire. Les zones en boîte de « b » et de « c » ont été agrandies dans (B) et (C), respectivement. (B) L'épithélium de cornée, le stroma et l'endothélium. (C) La conjonctive avec des cellules de gobelet. ce - épithélium de cornée, st ' stroma, ed 'endothélium, gc ' cellule de gobelet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Histologie de H et E du tissu oculaire de surface au jour postnatal 10. (A) Ballon d'oeil intact à P10. Les zones en boîte de « b » et de « c » ont été agrandies dans (B) et (C), respectivement. (B) La cornée. (C) La conjonctive. Ce - épithélium de cornée, st ' stroma, ed 'endothélium, cj 'conjonctiva. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Immunostaining de la surface oculaire de P5 à P15. La surface carrée de chaque panneau a été agrandie à leur droite. (A-F) La kératine 12 a été exprimée spécifiquement dans l'épithélium de cornée (flèches). (G-L) La kératine 14 exprimée dans la surface oculaire. ac - chambre antérieure, pc et conjonctive palpébrale. Ce chiffre a été modifié à partir d'une publication précédente Guo et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un rappel critique pour la préparation du globe oculaire intact est que tous les os orbitaux doivent être enlevés complètement, en particulier les os juga et lacrimal, qui sont petits et situés près du fond de la douille oculaire. Les os restants peuvent compliquer l'histologie qui s'ensuit. Dans le cas où un petit morceau d'os n'a pas été complètement enlevé de la dissection par accident, il peut être choisi à partir du bloc de paraffine d'emcasterie utilisant une paire de sharptweezers. Le trou laissé derrière doit être rempli de paraffine fondue après cette opération.
Une prudence supplémentaire doit être exercée lors de la manipulation de la lentille. Les morceaux cassés de lentille sont habituellement dispersés par toute la section. Cela affectera considérablement l'examen de la microscopie et l'analyse d'images. Les tentatives d'enlever la lentille endommageraient soit la surface oculaire (si l'opération a été effectuée du côté facial) ou la rétine (si l'opération était du côté du disque optique de la rétine). Une autre façon de réduire l'impact négatif de la présence de tissu de lentille sans dissection est de changer les directions de sectionnement. Par exemple, pour enregistrer la morphologie de surface oculaire, le sectionnement du bloc de paraffine doit être effectué de l'antérieur du globe oculaire au postérieur, autrement, de la direction opposée.
Une note utile à faire pour la section de paraffine PFA-fixe est que la récupération d'antigène est habituellement nécessaire pour immunostaining tel que l'utilisation des anticorps K12 et K14. Cependant, il y a beaucoup d'exceptions que la récupération d'antigène générerait des signaux non spécifiques augmentant la coloration de fond. Ainsi, il faut être prudent lors de l'utilisation de la technologie de récupération d'antigène, et devrait tester des anticorps dans des expériences pilotes si possible, à l'avance.
En général, il existe deux méthodes pour isoler le globe oculaire du crâne/os orbitaux : (i) disséquer directement le globe oculaire du côté facial ; et (ii) enlever le crâne intérieur / os orbitaux pour libérer le globe oculaire. Le défi pour la première méthode est que le globe oculaire s'enfonce profondément dans la prise orbitale avec un espace étroit entre les deux pour la dissection. En outre, le globe oculaire mobile étirerait l'épithélium de conjonctive à un moment donné quand les outils de dissection le touchent, créant des dommages involontaires. En revanche, la deuxième méthode commence par la dissection des os du crâne/orbital, qui sont plus éloignés du globe oculaire et du tissu de surface oculaire associé, réduisant ainsi le risque d'endommager la conjonctive. En outre, il n'y a aucune constrictions spatiales pour effectuer des dissections. Même si la première méthode peut fonctionner si de grandes précautions ont été prises, la seconde est certainement plus facile et mieux.
En résumé, nous avons décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière intacte et la surface oculaire associée des souris postnatales. Le protocole décrit convient à l'isolement du globe oculaire avec la paupière intacte et les tissus oculaires associés chez les souris postnatales. Le protocole est particulièrement utile lorsque l'intégrité du système d'exploitation ou des tissus oculaires entiers est nécessaire. Nous avons utilisé cette méthode pour préparer des échantillons de tissus pour l'examen des marqueurs de kératine dans os dans des conditions normales et pathologiques. Nous concluons que les tissus oculaires de ces préparations sont particulièrement utiles pour examiner les règlements différentiels d'une protéine dans différentes parties du système d'exploitation sur une seule section.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Rong Ju pour la lecture critique du manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, Chine), le Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), « Plan 100 personnes » de l'Université Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), et le financement de la recherche du State Key Laboratory of Ophthalmology du Zhongshan Ophthalmic Center (30306020202400339; Guangzhou, province du Guangdong, Chine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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