Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento della bulbo oculare del topo con palpebra, superficie oculare, segmenti anteriori e posteriori in posizione relativamente intatta.
Abstract
La superficie oculare (OS) è costituita da un foglio epiteliale con tre parti collegate: palpebrale conjunctiva, bulbar conjunctiva ed epitelio corneale. L'interruzione dell'OS porterebbe a cheratite, congiuntivite o entrambi (keratoconjunctiviti). Nei modelli animali sperimentali con determinate modifiche genetiche o operazioni artificiali, è utile esaminare tutte le parti del foglio epiteliale dell'OS per valutare i cambiamenti patogenetici relativi di ogni parte in parallelo. Tuttavia, la dissezione del tessuto OS nel suo complesso senza distorsioni o danni è stata difficile, principalmente a causa della morbidezza e della magrezza dell'OS apposte per separare fisicamente le palpebre e il bulbo oculare. Inoltre, la presa oculare profonda formata dal cranio duro / ossa orbitali è completamente occupata dal bulbo oculare lasciando uno spazio limitato per le dissezioni operative. Di conseguenza, la dissezione diretta del bulbo oculare con tessuti OS associati dal lato facciale spesso porterebbe a danni ai tessuti, in particolare la conjunctiva palpebral e bulbar. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo per rimuovere il cranio e le ossa orbitali in sequenza da una testa di topo sezionato, lasciando palpebre, superficie oculare, lente e retina del tutto in un unico pezzo. L'integrità del foglio OS era ben preservata e poteva essere esaminata dall'istologia o dall'immunostaining in un'unica sezione.
Introduction
La superficie oculare è costituita da un foglio continuo di epitelio regionalizzato tra cui palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva e cornea1. Molte strutture ghiandolari sono associate all'epitelio superficiale oculare e insieme generano uno strato di pellicola di strappo che protegge la superficie della cornea dall'essiccazione e dalle invasioni ambientali2. L'interruzione dell'OS porterebbe a cheratite, congiuntivite o entrambi (keratoconjunctiviti). Sia i fattori genetici che gli irritanti ambientali o le loro interazioni contribuiscono ad alterazioni patologiche dell'OS3,4. Di conseguenza, una varietà di modelli animali geneticamente-ingegnerizzati e fisicamente o chimicamente indotti sono stati utilizzati per studiare i processi di malattia del sistema operativo umano.
La struttura e la funzione del sistema operativo del topo è simile a quella degli esseri umani in molti modi. Anche i componenti della pellicola lacrimale secreti dalle ghiandole oculari sono simili tra i topi e gli esseri umani. Una ricchezza di studi è stata condotta utilizzando modelli murini per chiarire i meccanismi delle malattie del sistema operativo umano5,6,7. In molte occasioni, è fondamentale analizzare i cambiamenti molecolari globali invece che locali del sistema operativo per ottenere informazioni complete sotto lo stesso trattamento sperimentale. Pertanto, la preparazione del campione con buona integrità è necessaria per garantire che ogni parte del sistema operativo venga analizzata contemporaneamente.
Il mouse OS si associa strettamente con il bulbo oculare che è stato incorporato nella presa oculare / orbita (una tazza ossea fatta di diverse ossa del cranio) e si connette ad esso attraverso sottili tessuti connettivi. Esistono enormi sfide per sezionare l'intera superficie oculare senza danneggiare il palpebrale o bulbar conjunctiva. Queste sfide discendono da: (i) il sistema operativo è morbido e sottile e apposto per separare fisicamente le palpebre e il bulbo oculare mobili, quindi vulnerabile per distorsioni e danni; e (ii) lo spazio limitato tra le ossa orbitali e il bulbo oculare limitano le operazioni di dissezione. Le sfide sono molto più grandi per il topo adulto. Nel topo embrionale, l'ossificazione ossea orbitale non è completa e i tessuti circostanti sono relativamente sciolti8. La testa può essere rimossa e sezionato, e poi direttamente soggetta alla fissazione della paraformaldeide (PFA) e all'incorporamento9. Al contrario, le ossa orbitali postnatali e adulte del topo sono completamente ossificate con tessuti circostanti spessi, rendendo meno efficiente la penetrazione dei fissativi. Inoltre, le ossa orbitali/teschie sono dure e fragili, facilmente spezzate quando le seziono nei composti di incorporamento morbido come la paraffina. I pezzi rotti di ossa strapperanno all'unanimità i tessuti vicini con conseguente morfologia dei tessuti inferiori.
Molti studi pubblicati spesso hanno mostrato una superficie oculare parziale, che può essere sufficiente per i loro particolari scopi di ricerca10,11. Un esame grossolano della letteratura ha trovato solo pochi studi che mostrano l'intera superficie oculare intatta dimostrata senza una descrizione dettagliata dei protocolli di dissezione12,13. In questo protocollo, abbiamo dettagliato un metodo di dissezione per ottenere la superficie oculare postnatale integrale, in cui le ossa orbitali e crane sono state rimosse ordinatamente, lasciando una superficie oculare intatta insieme al bulbo oculare e alle palpebre, riducendo al minimo i danni fisici. Abbiamo esaminato ulteriormente l'istologia dell'OS ed eseguito l'immunoistochimica usando le sezioni tissutali preparate con questo protocollo.
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Protocol
Tutte le procedure relative all'uso di topi sono state approvate dall'Animal Care and Use Committee ( ) Ehongshan Ophthalmic Center, e aderitate alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visionaria.
1. Dissezione del bulbo oculare con superficie oculare e palpebre intatte
- Dissezionare la testa.
- Eutanasia giorno postnatale 10 (P10) e P28 topi (vedi la tabella dei materiali per ceppi di topo) da lussazione cervicale, tagliare la testa dal collo da un paio di forbici affilate.
- Testa di bisect con un paio di forbici dritte lungo la linea mediana sagittale a partire dall'osso interparietale sontuosamente al nasale (Figura 1A,B).
NOTA: L'osso del cranio si indurisce con l'invecchiamento del topo, fare attenzione a mantenere le forbici che tagliano lungo la linea mediana il più possibile. - Mettere ogni metà della testa sezionato in un piatto Petri pulito, tagliare la mascella e la lingua prima utilizzando forbici affilate. Liberare il nervo ottico tagliandolo fuori il cervello prima della posizione del chiasma ottico, e rimuovere tutti i tessuti cerebrali tra cui lampadina olfattiva attaccato alla parete del cranio.
- Ora i tessuti rimanenti devono avere tutte le ossa del cranio/orbitale associate al bulbo oculare (Figura 1C,D). Lavare la parte restante con PBS per pulire sangue e detriti di capelli.
- Tessuti di prefisso con 4% paraformaldeide (PFA, in salina tamponato fosfato [PBS], pH 7.4) in un tubo conico da 50 mL a temperatura ambiente (RT) con rotazione. Il tempo di fissazione approssimativo è il seguente: 10 min per P0 a P7; 20 min per P8 a P28; e 30 min per P29 e più anziani.
NOTA: La prefissazione offre rigidità tissutale che facilita la dissezione che ne deriva. Inoltre, la prefixazione evita di lasciare tessuto fresco non fissato troppo tempo prima che la dissezione sia completa.
AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura.
- Rimuovere il cranio /ossa orbitali.
- Dopo la presunzione, lavare rapidamente la testa sezionata in PBS tre volte per eliminare ulteriormente i peli rotti e fissativi al fine di procedere con ulteriore dissezione.
AVVISO: L'esposizione ai fissativi durante la dissezione può essere dannosa per la salute. - Mettere il tessuto nella parabola di 10 cm Petri, tagliare il cranio in tre parti lungo i piani indicati nella Figura 1D,E. Il bulbo oculare nella presa è nascosto nella parte centrale del cranio sotto ossa etmoidi, frontali e mascellari (Figura 1D,E).
- Utilizzare due paia di pinze dritte n. 4 per staccare l'osso etmoide per esporre completamente le ossa frontali e mascellari (Figura 1F).
- Dividi geograficamente la superficie del cranio (compresi la mascella e le ossa frontali) in 4 aree (Figura 1F). Inserire la punta delle pinze curve orizzontalmente in ogni area per rimuovere le ossa mascellari e frontali in sequenza (Figura 1F).
NOTA: le ossa mascellari non possono essere rimosse contemporaneamente. Sezionano pazientemente pezzo per pezzo. L'osso frontale è direttamente collegato al bulbo oculare attraverso tessuti connettivi molli. Prestare attenzione quando si rimuove dal bulbo oculare per evitare di allungare il bulbo oculare e danneggiare la congiuntiva. - Dopo la rimozione dell'osso mascellare parziale e di tutti gli osso frontali, le ossa lacrimali e jugale sottostanti sarebbero esposte (Figura 1G). Rimuovere le due ossa e i muscoli sottocutanei associati e i grassi che circondano il bulbo oculare, tagliare il bulbo oculare con le palpebre attaccate e la pelle in un piccolo blocco a forma quadrata per ridurre il volume del tessuto e facilitare l'orientamento del tessuto durante l'incorporamento(Figura 1 H).
- Posizionare il bulbo oculare e i tessuti associati di nuovo nel 4% di PFA e continuare a fissare durante la notte a 4 gradi centigradi. Il tessuto fisso può essere conservato per almeno un mese a 4 gradi centigradi in PBS con l'aggiunta di 0,02% NaN3. In alternativa, procedere immediatamente all'analisi istologica.
NOTA: Se il tessuto deve essere conservato per periodi più lunghi, può essere facilmente conservato nel 70% di etanolo.
- Dopo la presunzione, lavare rapidamente la testa sezionata in PBS tre volte per eliminare ulteriormente i peli rotti e fissativi al fine di procedere con ulteriore dissezione.
2. Analisi istologica
- Colorazione della sezione di paraffina e dell'ematossia e dell'eosina (H&E)
- Seguire il protocollo standard descritto altrove9 per eseguire l'incorporamento e il sezionamento della paraffina.
- Immunohistochimica (IHC)
- Dewax le sezioni di paraffina con xilene e reidratare le sezioni attraverso la serie di alcol (100%, 95%, 80%) in acqua distillata (dH2O).
- Eseguire il recupero dell'antigene mediante il trattamento a microonde dei vetrini tissutali in tampone di acido citrico da 0,01 M (3 g di citrato trisodio, 0,4 g di acido citrico per 1 lppia distillato H2O) in un baratto di vetritta a bassa potenza (120 W). L'energia deve essere consegnata a intermittenza per un totale di 5-10 min con ogni intervallo della durata di circa 2 min.
NOTA: il microonde ad alta potenza o il riscaldamento costante porterebbero al distacco di sezioni di tessuto dal vetrino. - Raccogliere i vetrini da vaso di vetro, pulire con attenzione il liquido residuo che circonda ogni sezione utilizzando tessuti facciali e metterli sul rack slide in una scatola di istologia. Disegnare un quadrato intorno a ogni sezione con una penna istologica impermeabile. Posizionate 100 lun di buffer di blocco (0,1% triton X-100 e 10% siero d'asino in 1x PBS) su ogni quadrato e incubate per 30 min a RT.
- Rimuovere con attenzione la soluzione di blocco con il vuoto, aggiungere l'anticorpo primario (vedere la Tabella dei Materiali)con la diluizione desiderata nel buffer di blocco e continuare a incubare i vetrini a 4 gradi centigradi per 24 ore o più.
NOTA: La concentrazione per ogni anticorpo primario utilizzato per l'IHC varia e deve essere testata negli esperimenti pilota. - Lavare i vetrini di tessuto con PBST (0,1% Triton in PBS) tre volte, per 10 min ciascuno. Ripetere il passaggio 2.2.4 utilizzando l'anticorpo secondario (vedere Tabella dei materiali)insieme a 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) sostituendo il buffer di blocco. Continuare a incubare per almeno 4 ore o più a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere l'anticorpo secondario, lavare le sezioni del tessuto con soluzione PBST tre volte, per 10 min ciascuno, quindi lavare con PBS pulito per altri 5 min.
- Pulire le sezioni residue di tessuto circostante PBS, montare coverlips su sezioni con supporto di montaggio. Eseguire la microscopia fluorescente per ottenere immagini (vedere la Tabella dei Materiali).
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Representative Results
Le ossa principali del cranio viste da diverse prospettive sono state illustrate nella Figura 1A-E, con colori che denotano ossa diverse. Abbiamo usato animali di quattro settimane per la dimostrazione dei processi di dissezione. A seguito dei passaggi di dissezione 1.1.1-1.1.3 e di una breve predazione (passaggio 1.1.4), il bulbo oculare con ossa facciali associate sono illustrati nella Figura 1E. Ulteriore taglio per rimuovere anteriore (nasale e premascellare) e posteriore (ad esempio, parietale) e ossa etmoidi generate blocco di tessuto con ossa principalmente mascellari e frontali in cima al bulbo oculare (Figura 1F). Rimozione sequenziale di queste ossa in base alle aree designate nella figura 1F esposte al sottostante ossa lacrimali e giugare così come la ghiandola Harderin (Figura 1G). La ghiandola Harderin attaccata al bulbo oculare fungeva da punto di riferimento (Figura 1G), e dovrebbe essere mantenuta in posizione in ogni momento. L'isolamento del bulbo oculare è stato completato dalla rimozione di tutte le ossa e i grassi circostanti e i tessuti muscolari (Figura 1H).
Dopo l'incorporamento della paraffina, il bulbo oculare è stato sezionato e Macchie H&E. Le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 2. Le relative posizioni intatte delle palpebre, della superficie corneale e congiuntivale sono state visualizzate in una sezione (Figura 2A), le cui parti sono state ingrandite nella Figura 2B,C. La morfologia delle lenti è difficile da mantenere (Figura 2A) a causa della sua rigidità e fragilità. Abbiamo applicato questo metodo di dissezione ad altre età postnatali e mostrato un esempio di istologia H&E della sezione eyeball P10 (Figura 3). In generale, più giovane è il topo, migliore è la morfologia del bulbo oculare è conservata. Le sezioni di paraffina immunostained delle età postnatali seriali sono mostrate nella Figura 4, con cheratina 12 (K12) (Figura 4A-F) e cheratina 14 (K14) (Figura 4G-L) che colorano la cornea e l'intero epitelio OS, rispettivamente.
Figura 1: Illustrazione della dissezione del bulbo oculare nel vecchio topo adulto di 4 settimane. (A-D) Il diagramma schematico della composizione del cranio vista rispettivamente dall'alto (A), dal basso (B), dal laterale (C) e dal piano intermedio (D). Le linee tratteggiate in (A) e (B) indicano piani bisecti. (E) Teschio semese sezionato all'età di 4 settimane che corrisponde esattamente (D). (F) Vista mediale del tessuto sezionato tra i due piani trasversali in (D) e (E). Il bulbo oculare (cerchio tratteggiato) è stato incastrato principalmente sotto il frontale (Fron) e il mascellare (Max). Le linee tratteggiate colorate dividono geograficamente il piano sezionato in 4 aree, in cui le ossa sono state approssimativamente rimosse in base all'ordine o ai numeri. Si noti che l'osso etmoide (Eth) è stato rimosso. (G) Dopo la rimozione dell'osso frontale e del mascellare parziale, sono state esposte le ossa della ghiandola di Harderin (Har) e della jugal (Jug) e lacrimale (La). Le linee tratteggiate del cerchio indicano la posizione del bulbo oculare. (H) Bulbo oculare isolato visto dall'interno dopo il completamento della dissezione. Freccia punta al nervo ottico (On). E - Occhio, Na - Nasale, Premaxilla, Max: Maxillary, La - Lacrimal, Fron , Frontale, Ali , Alisphenoid, Jug , Jugal, Pal , Palatine, Ptery , Pterygoid, Squ , Squamosal, Par , Parietal, Ethmoid. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Istologia H&E del tessuto superficiale oculare a 4 settimane di età postnatale. (A) Le palpebre, la congiuntiva e la cornea sono visualizzate in una sezione di tessuto. Le aree boxed di "b" e "c" sono state ingrandite rispettivamente in (B) e (C). (B) L'epitelio di cornea, stroma ed endotelio. (C) La congiuntiva con le cellule di calice. ce - cornea epitelio, st , stroma, ed , endothelium, gc , cellula di calice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istologia H&E del tessuto superficiale oculare al giorno postnatale 10. (A) Bulbo oculare intatto a P10. Le aree boxed di "b" e "c" sono state ingrandite rispettivamente in (B) e (C). (B) La cornea. (C) La congiuntiva. Ce - cornea epitelio, st , stroma, ed , endothelium, cj , conjunctiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immunostaining della superficie oculare da P5 a P15. L'area squadrata in ogni pannello è stata ingrandita a destra. (A-F) Keratin 12 è stato specificamente espresso nell'epitelio cornea (frecce). (G-L) La cheratina 14 espressa nella superficie oculare. ac - camera anteriore, pc - palpebral conjunctiva. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione Guo etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un promemoria fondamentale per la preparazione del bulbo oculare intatto è che tutte le ossa orbitali devono essere rimosse completamente, in particolare le ossa di juga e lacrimali, che sono piccole e si trovano vicino alla parte inferiore della orbita oculare. Qualsiasi osso residale può complicare l'istologia che ne deriva. Nel caso in cui un piccolo pezzo di osso non sia stato completamente rimosso dalla dissezione per caso, può essere prelevato dal blocco di paraffina incorporante utilizzando un paio di sharptweezer. Il foro lasciato deve essere riempito con paraffina fusa dopo questa operazione.
Ulteriore cautela deve essere esercitata quando si maneggia l'obiettivo. I pezzi rotti di lente sono di solito sparsi in tutta la sezione. Ciò influirà notevolmente sull'esame della microscopia e sull'analisi delle immagini. I tentativi di rimuovere l'obiettivo danneggerebbero la superficie oculare (se l'operazione è stata condotta dal lato facciale) o la retina (se l'operazione era dal lato del disco ottico della retina). Un modo alternativo per ridurre l'impatto negativo della presenza del tessuto dell'obiettivo senza dissezione è quello di cambiare le direzioni di sezionamento. Ad esempio, per salvare la morfologia della superficie oculare, la sezionamento del blocco di paraffina deve essere eseguita dall'anteriore del bulbo oculare al posteriore, altrimenti, dalla direzione opposta.
Una nota utile da fare per la sezione di paraffina fissata PFA è che il recupero dell'antigene è di solito necessario per l'immunostaining come l'uso di anticorpi K12 e K14. Tuttavia, ci sono molte eccezioni che il recupero dell'antigene genererebbe segnali non specifici aumentando la colorazione in background. Pertanto, si dovrebbe essere cauti quando si utilizza la tecnologia di recupero degli antigeni, e si dovrebbe testare gli anticorpi negli esperimenti pilota, se possibile, in anticipo.
In generale, ci sono due metodi per l'isolamento del bulbo oculare dal cranio / ossa orbitali: (i) sezionare direttamente il bulbo oculare dal lato facciale; e (ii) rimuovere il cranio interno / ossa orbitali per liberare il bulbo oculare. La sfida per il primo metodo è che il bulbo oculare affonda in profondità nella presa orbitale con uno spazio stretto in mezzo per la dissezione. Inoltre, il bulbo oculare mobile allungherebbe l'epitelio congiuntivo in un dato punto quando gli strumenti di dissezione lo toccano, creando danni involontari. Al contrario, il secondo metodo inizia con la dissezione delle ossa cranica/orbitali, che sono più lontane dal bulbo oculare e dal tessuto superficiale oculare associato, riducendo così il rischio di danneggiare la congiuntiva. Inoltre, non ci sono costrizioni spaziali per l'esecuzione di dissezioni. Anche se il primo metodo può funzionare se sono state prese grandi precauzioni, il secondo è sicuramente più facile e migliore.
In sintesi, abbiamo descritto un metodo per l'isolamento del bulbo oculare del topo con palpebra tadiata e superficie oculare associata dai topi postnatali. Il protocollo descritto è adatto per l'isolamento del bulbo oculare con palpebra tabra intatta e tessuti oculari associati nei topi postnatali. Il protocollo è particolarmente utile quando è richiesta l'integrità del sistema operativo o di interi tessuti oculari. Abbiamo usato questo metodo per preparare campioni di tessuto per l'esame dei marcatori di cheratina in OS in condizioni normali e patologiche. Concludiamo che i tessuti oculari di tali preparati sono particolarmente utili per esaminare le regolazioni differenziali di una proteina in diverse parti del sistema operativo su una singola sezione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il professor Rong Ju per la lettura critica del manoscritto e tutti i membri del laboratorio per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Pechino, Cina), il progetto di innovazione di Guangzhou City Sciences and Technologies (201707020009; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina), "Piano 100 Persone" dell'Università Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina), e finanziamenti per la ricerca dal Laboratorio Chiave dello Stato di Oftalmologia presso il Centro Oftalmicico di Hongshan (303060202400339; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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