Summary
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av musen øyeeplet med øyelokk, øye overflate, fremre og bakre segmenter i relativt intakt posisjon.
Abstract
Øyeoverflaten (OS) består av et epitel ark med tre sammenkoblede deler: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva og hornhinne epitel. Forstyrrelse av OS ville føre til keratitt, konjunktivitt eller begge (Keratokonjunktivitt). I eksperimentelle dyremodeller med visse genetiske modifikasjoner eller kunstige operasjoner, er det nyttig å undersøke alle deler av OS epitel arket for å evaluere relative pathogenetic endringer av hver del parallelt. Men Disseksjon av OS vev som helhet uten forvrengning eller skade har vært utfordrende, først og fremst på grunn av mykhet og tynnhet av OS festet til fysisk separate ennå bevegelige øyelokk og øyeeplet. I tillegg er det dype øyet socket dannet av den harde skallen/orbital bein fullt okkupert av øyeeplet forlate begrenset plass for drift dissections. Som et resultat, direkte Disseksjon av øyeeplet med tilhørende OS vev fra Facial side vil ofte føre til vevskader, spesielt palpebral og bulbar conjunctiva. I denne protokollen, beskrev vi en metode for å fjerne skallen og orbital bein sekvensielt fra en delt mus hodet, forlater øyelokkene, øye overflate, linse og Retina helt i ett stykke. Integriteten til OS-arket ble godt bevart og kan undersøkes ved histologi eller immunostaining i en enkelt seksjon.
Introduction
Øye flaten består av et sammenhengende ark med regionene epitel, inkludert palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva og hornhinne1. Mange kjertel strukturer er forbundet med øye overflate epitel og sammen generere et lag av tåre film beskytte hornhinnen overflaten fra tørking og miljømessige invasjoner2. Forstyrrelse av OS ville føre til keratitt, konjunktivitt eller begge (Keratokonjunktivitt). Både genetiske faktorer og miljømessige irriterende eller deres interaksjoner bidra til patologiske forandringer i OS3,4. Følgelig har en rekke genetisk konstruerte og fysisk eller kjemisk induserte dyremodeller blitt brukt til å studere sykdoms prosesser i det menneskelige operativsystemet.
Strukturen og funksjon av musen OS er lik som mennesker på mange måter. Tåre film komponentene som skilles ut av øye kjertlene er også like mellom mus og mennesker. Et vell av studier har vært gjennomført ved hjelp av musen modeller for Elucidating mekanismer av menneskelig OS sykdommer5,6,7. I mange tilfeller er det avgjørende å analysere global i stedet for lokale molekylære endringer av OS for å få omfattende informasjon under samme eksperimentelle behandling. Derfor er prøve forberedelser med god integritet nødvendig for å sikre at hver del av operativsystemet analyseres samtidig.
Musa OS tett forbinder med øyeeplet som var innebygd i øyet socket/bane (en bein kopp laget av flere forskjellige skallen bein) og kobles til det gjennom tynne bindevev. Det finnes enorme utfordringer for å dissekere hele øye flaten uten å skade palpebral eller bulbar conjunctiva. Disse utfordringene stige ned fra: (i) OS er myk og tynn og festet til fysisk separate ennå bevegelige øyelokk og øyeeplet, derfor sårbare for forvrengning og skade; og (II) den begrensede plassen mellom orbital bein og øyeeplet begrense disseksjon operasjoner. Utfordringene er mye større for den voksne musen. I den embryonale musen er orbital benet forbening ikke komplett og omkringliggende vev er relative løs8. Hodet kan fjernes og delt, og deretter direkte utsatt for paraformaldehyde (PFA) fiksering og innebygging9. I motsetning til postnatal og voksen mus orbital bein er fullt ossified med tykke omkringliggende vev, noe som gjør inntrengning av fiksativene mindre effektiv. Videre er orbital/Skull Bones harde og sprø, lett ødelagt når skjære dem i myke embedding forbindelser som parafin. Den ødelagte stykker av bein vil enstemmig rive den nærliggende vev som resulterer i dårligere vev morfologi.
Mange publiserte studier viste ofte delvis øye overflate, noe som kan være tilstrekkelig for deres spesielle forskningsformål10,11. En grov undersøkelse av litteratur funnet bare noen studier som viser hele intakt øyeoverflaten blir demonstrert uten detaljert beskrivelse av disseksjon protokoller12,13. I denne protokollen, vi detaljert en disseksjon metode for å få integrert postnatal øye overflate, der orbital og skallen bein ble ryddig fjernet, etterlot urørt øye overflate sammen med øyeeplet og øyelokkene, minimere fysiske skader. Vi undersøkte videre OS-histologi og utførte immunhistokjemi ved hjelp av vevs delene som er klargjort med denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer bruk av mus ble godkjent av Animal Care og use Committee, Zhongshan øye senter, og overholdt ARVO statement for bruk av dyr i øye-og Visjons forskning.
1. Disseksjon av øyeeplet med intakt øye overflate og øyelokk
- Analysere hodet.
- Euthanize postnatal dag 10 (P10) og P28 mus (se tabell over materialer for mus stammer) ved cervical forvridning, kutt hodet av nakken av et par skarpe saks.
- Halvere hodet med et par rett saks langs sagittal midtlinjen begynnelsen på interparietal benet rostrally til nasal (figur 1a, B).
Merk: skallen benet stivner med musen aldring, være forsiktig med å holde saksen skjære langs midtlinjen så mye som mulig. - Plasser hver halvdel av delt hodet i en ren Petri parabolen, avskåret kjeven og tungen første bruker skarp saks. Frigjør den optiske nerven ved å kutte den av hjernen før den optiske Chiasm plassering, og Fjern alle hjernevev inkludert olfactory pære festet til hodeskallen veggen.
- Nå de resterende vev skal ha alle Skull/orbital bein forbundet med øyeeplet (figur 1C, D). Vask den resterende delen med PBS å rengjøre blod og hår rusk.
- Prefiks vev med 4% paraformaldehyde (PFA, i fosfat-bufret saltvann [PBS], pH 7,4) i et 50 mL konisk rør ved romtemperatur (RT) med rotasjon. Den omtrentlige fiksering tid er som følger: ~ 10 min for p0 til P7; ~ 20 min for P8 til P28; og ~ 30 min for P29 og eldre.
Merk: prefixation gir vevs stivhet og gjør den påfølgende disseksjon enklere. I tillegg unngår prefixation å la friskt vev unfixed for lenge før disseksjon er fullført.
FORSIKTIG: PFA er farlig og må håndteres med forsiktighet.
- Fjern skallen/orbital bein.
- Etter prefixation, raskt vaske dissekert hodet i PBS tre ganger for å ytterligere eliminere ødelagte hår og fiksativene for å fortsette med videre disseksjon.
FORSIKTIG: eksponering for fiksativene under disseksjon kan være skadelig for helsen. - Plasser vevet i 10 cm Petri parabolen, kutt skallen i tre deler langs flyene angitt i figur 1D, E. Øyeeplet i kontakten er skjult i den midtre delen av skallen under ethmoid, frontal og maksillære bein (figur 1D, E).
- Bruk to par med no. 4 straight pinsett til å skrelle av ethmoid beinet å fullt utsette frontal og maksillære bein (figur 1F).
- Geografisk dele hodeskallen overflaten (inkludert maksillære og frontal bein) i 4 områder (figur 1F). Sett tuppen av buet tang horisontalt inn i hvert område for å fjerne maksillære og frontal bein sekvensielt (figur 1F).
Merk: maksillære bein kan ikke fjernes på en gang. Tålmodig analysere dem stykke for stykke. Frontal benet er direkte koblet til øyeeplet gjennom mykt bindevev. Vær forsiktig når du fjerner den fra øyeeplet for å hindre strekke øyeeplet og skade conjunctiva. - Etter fjerning av delvis maksillære bein og alle frontal bein, den underliggende lacrimal og Jugal bein ville bli eksponert (figur 1G). Fjern de to beina og tilhørende subkutan muskler og fett rundt øyeeplet, trim øyeeplet med vedlagte øyelokk og hud i en liten firkantet form blokk for å redusere vevs volum og tilrettelegge orientere vevet ved innebygging (figur 1 H).
- Plasser øyeeplet og tilhørende vev tilbake i 4% PFA og fortsette å fikse over natten ved 4 ° c. Den faste vev kan bevares i minst en måned ved 4 ° c i PBS med tillegg av 0,02% NaN3. Alternativt, fortsette å histologiske analyse med det samme.
Merk: Hvis vevet må oppbevares i lengre perioder, kan det lett oppbevares i 70% etanol.
- Etter prefixation, raskt vaske dissekert hodet i PBS tre ganger for å ytterligere eliminere ødelagte hår og fiksativene for å fortsette med videre disseksjon.
2. histologiske analyse
- Parafinsnitt og hematoksylin og eosin (H & E) farging
- Følg standardprotokollen som er beskrevet andre steder9 for å utføre para fin innebygging og-snitting.
- Immunhistokjemi (IHC)
- Dewax para fin seksjonene med xylen og rehydrate seksjonene gjennom alkohol serien (100%, 95%, 80%) destillert vann (dH2O).
- Utfør antigen henting ved mikrobølgeovn behandling av vevet lysbilder i 0,01 M sitronsyre buffer (3 g Trisodium citrate, 0,4 g sitronsyre per 1 L dobbel destillert H2O) i et glass Slide krukke med lav effekt (120 W). Energi bør periodisk leveres for totalt 5-10 min med hvert intervall som varer ca 2 min.
Merk: High-Power mikrobølgeovn eller konsistent oppvarming ville føre til avløsning av vev seksjoner fra raset. - Plukk ut lysbildene fra glass jar, tørk forsiktig av resterende væske rundt hver del ved hjelp av ansikts vev og legg dem på lysbildet rack i en histologi boks. Tegn en firkant rundt hver del med en vanntett histologiske penn. Plasser 100 μL av blokkerings buffer (0,1% Triton X-100 og 10% esel serum i 1x PBS) på hver firkant, og ruge i 30 min ved RT.
- Fjern forsiktig blokkerings løsningen med vakuum, Legg til det primære antistoff (se tabell over materialer) med ønsket fortynning i blokkerings bufferen, og Fortsett å ruge lysbildene ved 4 ° c i 24 timer eller mer.
Merk: konsentrasjonen for hvert primære antistoff som brukes for IHC varierer, og må testes ut i forsøks eksperimenter. - Vask vev lysbilder med PBST (0,1% Triton i PBS) tre ganger, for 10 min hver. Gjenta trinn 2.2.4 med det sekundære antistoff (se tabell over materialer) sammen med 4 ', 6-diamidino-2-PHENYLINDOLE (DAPI) som erstatter blokkerings bufferen. Fortsett å ruge i minst 4 timer eller mer ved romtemperatur (RT).
- Fjern den sekundære antistoff, vask vev seksjoner med PBST løsning tre ganger, for 10 min hver, vask deretter med ren PBS for ytterligere 5 min.
- Tørk av den gjenværende PBS rundt vevs delene, Monter coverslips på seksjoner med festemiddel. Utfør fluorescerende mikroskopi for å få bilder (se tabell over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De store skallen bein sett fra ulike perspektiver ble illustrert i figur 1A-E, med farger som viser forskjellige bein. Vi brukte fire ukers gammelt dyr for demonstrasjon av disseksjon prosessene. Etter disseksjon trinn 1.1.1-1.1.3 og en kort prefixation (trinn 1.1.4), er øyeeplet med tilhørende ansikts bein demonstrert i figur 1E. Videre trimming å fjerne fremre (nasal og premaxillary) og bakre (f. eks, parietal) samt ethmoid bein generert vev blokk med hovedsakelig maksillære og frontal bein på toppen av øyeeplet (figur 1F). Sekvensiell fjerning av disse beina i henhold til utpekte områder i figur 1F eksponert underliggende lacrimal og Jugal bein samt Harderin kjertel (figur 1G). Den Harderin kjertel festet til øyeeplet fungert som et landemerke (figur 1G), og bør holdes på plass til enhver tid. Isolering av øyeeplet ble fullført ved fjerning av alle bein og omkringliggende fett og muskel vev (figur 1H).
Etter parafin embedding, øyeeplet var delt og H & E-beiset. Representative bilder vises i figur 2. De relative intakte posisjonene til øyelokkene, hornhinnen og konjunktival overflate ble visualisere i en del (figur 2A), hvorav deler ble forstørret i figur 2B, C. Objektivet morfologi er vanskelig å opprettholde (figur 2A) på grunn av sin stivhet og skjørhet. Vi anvendt denne disseksjon metoden å annet postnatal aldre og viste en eksempel av H & E histologi av P10 øyeeplet avdeling (skikkelsen 3). Generelt, jo yngre musen er, jo bedre øyeeplet morfologi er bevart. Immunostained parafin seksjoner fra serie postnatal aldre er vist i Figur 4, med keratin 12 (K12) (Figur 4A-F) og keratin 14 (K14) (Figur 4G-L) farging av hornhinnen og hele OS epitel, Henholdsvis.
Figur 1: illustrasjon av øyeeplet disseksjon i 4-ukers gammel voksen mus. (A-D) Den Skjematisk diagram av skallen sammensetning sett fra toppen (A), bunn (B), lateral (C) og midtre Planet (D), henholdsvis. Stiplede linjer i (A) og (B) angir delt plan. (E) delt-Half skallen på 4-ukers alder som samsvarer nøyaktig (D). (F) midtre-Plane visning av dissekert vev mellom de to tverrgående flyene i (D) og (E). Øyeeplet (stiplet sirkel) var hovedsakelig innebygd under frontal (Fron) og maksillære (Max). Fargede stiplede linjer geografisk dele delt flyet inn i 4 områder, der bein ble grovt fjernet som per ordre eller tall. Merk at ethmoid (ETH) benet er fjernet. (G) etter fjerning av frontal bein og delvis Maksillære, Harderin kjertel (har) og Jugal (jug) og Lacrimal (la) bein ble eksponert. Sirkel stiplede linjer indikerer øyeeplet posisjon. (H) isolert øyeeplet sett fra innsiden etter disseksjon fullført. Pil peker til optisk nerve (på). E = Eye, na = nasal, pre = Premaxilla, Max = Maksillære, la = Lacrimal, Fron = frontal, Ali = Alisphenoid, jug = Jugal, PAL = Pfalz, Ptery = Pterygoidmusklene, SQU = Squamosal, par = parietal, ETH = Ethmoid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: H &Amp; E-histologi av øye vevet ved postnatal 4-ukers gammel. (A) øyelokk, conjunctiva og hornhinnen er visualisere i en vevs seksjon. Innrammet områder av "b" og "c" ble forstørret i (B) og (C), henholdsvis. (B) hornhinnen epitel, stroma og endotelet. (C) conjunctiva med begeret celler. CE = hornhinne epitel, St = stroma, Ed = endotelet, GC = begeret celle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 3: H &Amp; E histologi av øye vevet ved postnatal dag 10. (A) intakt øyeeplet på P10. Innrammet områder av "b" og "c" ble forstørret i (B) og (C), henholdsvis. (B) hornhinnen. (C) conjunctiva. CE = hornhinne epitel, St = stroma, Ed = endotelet, CJ = conjunctiva. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 4: Immunostaining på øye flaten fra P5 til P15. Square-eske området i hvert panel ble forstørret i høyre. (A-F) Keratin 12 ble spesielt uttrykt i hornhinnen epitel (piler). (G-L) Keratin 14 uttrykkes i øye flaten. AC = fremre kammer, PC = palpebral conjunctiva. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon Guo et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk påminnelse for utarbeidelse av intakt øyeeplet er at alle orbital bein må fjernes helt, spesielt juga og lacrimal bein, som er små og ligger nær bunnen av øyet socket. Eventuelle venstre-over bein kan komplisere den påfølgende histologi. I tilfelle et lite stykke bein ble ikke helt fjernet fra disseksjon ved et uhell, kan det plukkes ut fra innebygging para fin blokken ved hjelp av et par sharptweezers. Hullet igjen skal fylles med smeltet parafin etter denne operasjonen.
Det bør utvises ekstra forsiktighet ved håndtering av linsen. Den ødelagte biter av linsen er vanligvis spredt gjennom hele seksjonen. Dette vil betydelig påvirke mikroskopi undersøkelse og bildeanalyse. Forsøk på å fjerne objektivet ville skade enten øyeoverflaten (Hvis operasjonen ble utført fra ansikts side) eller Retina (Hvis operasjonen var fra den optiske platen siden av Retina). En alternativ måte å redusere den negative virkningen av tilstedeværelsen av linse vev uten disseksjon er å endre snitting retninger. For eksempel, for å lagre øyeoverflaten morfologi, bør snitting av para fin blokken utføres fra fremre av øyeeplet til bakre, ellers fra motsatt retning.
Et nyttig notat å gjøre for PFA-Fixed parafin delen er at antigen henting er vanligvis nødvendig for immunostaining som bruker k12 og K14 antistoffer. Det er imidlertid mange unntak som antigen henting ville generere ikke-spesifikke signaler øke bakgrunnen farging. Således, en burde være advarsel når benytter antigen gjenervervelse teknologien, og burde test antistoffene inne pilot eksperimenter dersom det er mulig, på forhånd.
Generelt er det to metoder for isolering av øyeeplet fra skallen/orbital bein: (i) direkte analysere øyeeplet fra ansikts side; og (II) fjerne innsiden skallen/orbital bein å frigjøre øyeeplet. Utfordringen for den første metoden er at øyeeplet synker dypt inn i orbital socket med en smal plass i mellom for disseksjon. Videre ville den bevegelige øyeeplet strekke conjunctiva epitel på et gitt tidspunkt når disseksjon verktøy berører den, skaper utilsiktede skader. I motsetning til den andre metoden begynner med Disseksjon av skallen/orbital bein, som er lenger fra øyeeplet og tilhørende øye overflate vev, og dermed redusere risikoen for å skade conjunctiva. Videre er det ingen romlige constrictions for å utføre dissections. Selv om det for det første metoden kanne arbeide hvis stor forsiktighetsregler var tatt, sekundet en er som absolutt lettere og bedre.
Oppsummert har vi beskrevet en metode for isolering av mus øyeeplet med intakt øyelokk og tilhørende øye overflate fra postnatal mus. Den beskrevne protokollen er egnet for isolering av øyeeplet med intakt øyelokk og tilhørende øye vev i postnatal mus. Protokollen er spesielt nyttig når integriteten til operativsystemet eller hele øye vevet er nødvendig. Vi har brukt denne metoden til å forberede vevsprøver for undersøkelse av keratin markører i OS under normale og patologiske tilstander. Vi konkluderer med at øye vevet fra slike preparater er spesielt nyttige for å se på differensial regulering av et protein i ulike deler av operativsystemet på en enkelt seksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Prof. Rong Ju for kritisk lesning av manuskriptet, og alle Lab medlemmer for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Beijing, Kina), Guangzhou City Sciences og Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdong provinsen, Kina), "100 People plan" fra Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), og forskningsmidler fra State Key laboratorium av Oftalmologi ved Zhongshan øye Senter (303060202400339; Guangzhou, Guangdong-provinsen i Kina).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
